JPS62500001A

JPS62500001A - 細胞増殖

Info

Publication number: JPS62500001A
Application number: JP60502558A
Authority: JP
Inventors: リトウイン、ジヤツク
Original assignee: リトウイン、ジャック
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1985-05-21
Publication date: 1987-01-08
Also published as: DK19086D0; SE454518B; DK19086A; EP0216771A1; NO860180L; SE8402742L; WO1985005375A1; SE8402742D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細　胞　増　殖本発明は特別な型のセルロース繊維の存在下に、瑠燗培地中における細胞、符に二１き体細胞、とりわけヒト細胞のようなμ１１乳ａ物の二倍体細胞（たとえば籾雄芽細胞）の増殖方法に関する。前記セルロース繊維ｔ維はｌ＃電荷セルロースおよび／１ｊ工Ｍイオン父遺セルロースからなる。この型のセルロースは艮く知られており、いくつかの型のこのセルロースが、ｕｊえは、［チクニックスイングロチインケミストリー（Ｔｅｃｂｎｊｑｕｅｓ　１ｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ　、　：Ｌルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　■販社。

１９６７、Ｉ、Ｖゲット（Ｌｅｇｇｅｔｔ）、２９０−：５０４ページに示されている。過当な材料は飼えばシグマケミカーＡ／（８ｉｇｔｎａＣｈｅｍｉ　ｃ　ａ　ｌ　）社、セントルイス（ａｔ、Ｌｏｕｉｓ）、　ＭＯ，ＵＳ人から市ｊ＆されている。罰紀セルロース１櫨イオン交換体では、種々の方法で置換されうるアミノ基ｙｘＡ薄セルロース分子と結合させ。

囁イオン交換特性ヶ生ずる。

本発明により増殖する細胞は、好ましくは列えは浮遊級中で正富に増殖するいわゆる基質依存性細胞である。

以下の本発明による央駿列の一明は本発明の一部ン慣成している。

央１ＩＩＬ飼　１培ｍ：　イータＮ（Ｅａｇｌｅ’ｓ）　最小必ｆｆ１ｉ地にａｍｍのグルタミン、１ｍＭのピルビン醒ナトリウム、２０！ＩＩＭのトリシン（ＴルＩＣＩＮｇ）（Ｎ−トリス（ヒドロキクメチル）メチルグリシ７］、　ｐ）１７．８　、　１０４仔牛血清および０．１％重炭故ナトリクムＹ：ぶ加する。

セルロース：　細胞層８＋１は１−電荷セルロース繊維（原イオン交換捧）上でのみ起こり、隙電荷愼維（爾イオン交換体）上では増殖しなかった。全てのセルロースはシグマ１ヒ学社、セントルイスＩ、ＭＯ，ＵＳ人より購入した。以下のセルロース繊維′Ｊｋ：試験した。

＋１）ＱＡＥ（ジエチル−（２−ヒドロキシプロピ／Ｌ／）アミノエテル）　０．９ｍｅｑ／ｇｔ２＋　Ｌ）ＥＡＲ（ジエチルアミノエチＡ／　）　Ｑ、９ｍｅｑ／ｇ＋０．７ｍｅｑ／ｇ（３１ＴＥＡＲ（）リエチルアミノエチＡ／）α９ｍｅｑ／Ｎ（４）　アミノエチルＱ、３３ｍｅｑ／、５ｌ（５１ベンジル−ＤＥＡＲｔ６＋　ベンゾイル１と一ナフトイル１ヒＤＥＡＲｔ７１　１！２ｅＴＥＵＬ人　（エビクロロヒドリントリエタノールアミン）０．３ｍｅｑ／ｊｌｔ８１ＰＥＩ（ポリエチＶフイミ７　）　ｔｏ　７ｍｅｑ／　Ｊｉ’ＱＡＥ、１）ｇＡＥ　および’ｒｇＡｇでは同様に艮好な増殖が得られたが、七の他の型のセルロースではそれ以下の増殖しか得られなかった。七の繊維を蒸留水中に５０ｍ１ｌＩＬＩの一度で浮遊させ、６０分間オートクレイプにかけた。

細胞株：　全実験にヒト二倍体線維芽細胞？使用した。この細胞は胎児の肺梃滅に由来し、敵俸−索中に凍結、保存する創に檎々の継代数Ｙ：経過していた。それらは付層し、広がり、Ｊ＆懐的に分裂するのに１当な表面を必費とする依存性細胞である。

２櫨類の細胞体馨使用した＝（１）イングランドから入手したＭルｅ−５および（２１Ｌｕ　（８）と命名された本兄明者の研究所で半端された細胞株である。

これらＩ４方の一喝体の項殖符性を徹底的に検討し１Ｍ似していることが判明した。これらは共に７０〜９０の分裂回数の生体外寿命を有する。

ヒトＭＡ雄芽細胞の増殖方法：細砲の凍結アンプルをすみやかに浴かし、１５０ｍのイーグル培地を含んだグラスチックルー（ＬＬｏｕｘ）びんに描樵した。細胞層がコンフルエント（融合）になったら、カルシウムおよびマグネシウム？含まない９）１７．８のす／ｅｌＲ凌衝浴液中に２００ｔｔｇ／ｕの結晶性トリプシンの浴敵５０ｍ１で細胞を浮遊させ、細胞を耕鮮な培地を入れた４Ｆシいローびんに移した。最終的には採取した細胞を１撹拌びん”に渣徨した。このびんは攪拌装置として使用する憇濁用の磁石棒を含み、イーグＡ／層地とセルロース繊維の浮遊液乞含Ｍする。使用された＠＠渣檀物質はｌＸ１０’　ａ胞数／リセルロースであった。セルロースはｆＪ５ｍｇ７ｍの一度で用いられた。大部分の実験はＱＡＥセルロースで来施した。攪拌接置への必費童？５ｏｏｏｘ、ｐで１０分間遠沈し、上溝を吸い出し、セルロースを壇５１１培地に再び浮遊させ、撹拌びんに加えた。

ＱＡｇセルロースＮ１．維（低級品）は長さが６ミクロンから８００ミクロンまたはそれ以上の変異があり１幅では直径で１０ミクロンから５５ミクロンのｆＪ４があった。

セルロース浮遊献に添加された細胞は一鄭の繊維に付層するが、基′ｊｉｇｉ任性細胞任期細胞れるような通常の方法で繊維表面に広がって増殖することはなかった。代わりに檀々の大きさのセルロース繊維に＃ａ胞の塊となり増殖した。この細胞と繊維の凝集１２２Ｉは７から８日の培豊後には直径で１５０から２００ミクロンの大ざさに通した。この時に舟もれｔ′輔胞の概算数は１．２ｘ１０’ 　からｔ８Ｘ　１０’細胞畝／ａの変異があった。８かも１０日の冶誉後にを工、浮遊液中の一１厄以は絨少し７こ。セ堀しエ２から６日置きに、率ｘ維−細胞の魂ンひんの妊に沈降させ℃、培地の牛分瀘７￥：吸い田し１等蓋のν［絆な培地ン加えることにより父１４シた。

この縦果物に租み込まれた繊維は１００ミクロンまたはそれ以下から２００ミクロンの１６１の＆さであり、ｍ＜４６により址い４Ｒ雄が収祭された。七の繊維の肩は直径で１０ミクロンから２０ミクロンの闇であると思われた。残りの大部分のセルロース繊維は元金に紬膳が黒かった。細琶はその付庸および増殖に最も好適な１代班群ン迫択するらしく思われた。この効果はｍ雄の大きさ、または荷電した１じ字基の不均一な分布によるのかも知れない。

Ｓ＠地：　イーグル最小磨潰培地に４ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン区ナトリウム、２０！ＩＩＭのトリシン（Ｎ−）リス（ヒドロキシメチＡ／）グリシン）、ｐ）１７．８．１０％仔牛血７＃および［Ｊ、１％本災醒す）　ＩＪウムン肉加する。

細胞体：　全央枳にヒト胎児肺由米二活捧嶽継芽細認を使用した。大りも分の実験はｉ、ｕ　（Ｓ　）　と命名されＬ不発ｌ３１１省の研究所で準喘された細胞体Ｙ：２０から６０回分裂の活加数で使用した。

一部の央峡は６０かも６５回分裂の倍加数のＭにＧ−５＃４１１胞株で央飽した。両＜！１ｌｒｉｄ株で結ズーは同様であった。

セルロース：　細Ｕ瑣殖は陽−付セルロース繊林（該イオン交換体）上でのみ起こり、陽電荷繊維（陰イオン交換体）上では増殖しなかった。全てのセルロースはシグマ１！学社、セントルイス、ＭＯ，ＵＧ人より購入した。以下の陰イオン交換体をｌ入賦した。

＋１１　ＱＡ１３−２−ヒドロキシツクビルてミノエチ／ｌ／　Ｑ、９　ｍｅ　ｑ　／　１ｔ２）ＤＥＡＲ−ジエチルアミノエチルＱ、９＋ｎｅｑ／ｇ（３１ＴＥＡＥ−トリエチルアミノエチルα９ｔｎｅｑ／ｊ！（４）　アミノエチル０．３５ｒｎｅｑ／ｇ１５１　ベンジル−ＬｌｇＡＭ（６）　ベンゾイル１ヒーナフトイルｔじＤＥＡＷ（７）　ａｅ’ｒｇｏｔ、ａ −エビクロロヒドリントリエタノールアミンＱ、３ｍｅｑ／７ｉ８ｊＰ）ｕＩ−ポリエチＶフイミンｔ０７ｏｘｅｑ／＃セルロース−細胞浮遊液の娘倣鍵検査（図４）は、細胞が繊維るよ５には付着していないし、広がっていないこと？明らかにした。代わりに４１１胞とセルロース製品継の縦果物が形成され、培簑ン続ける程直径が増加した。

本央績の開始時に使用されるセルロース製品は表遺栗首により下級品と分類されたもので、その繊維は長さで６ミクロンから８００ミクロンまたはそれ以上、ｍで直径１０ミクロンから６５ミクロンの変異があった。図４ａ、ｂ、ｃ、ｆ　で明らかなように大部分のＮＬｍは細胞−稙織凝乗物と粘合しなかった。この涙果物に峨み込まれに繊維は１００ミクロンまたはそれ以下から２００ミクロンの１１２１の長さであり、憔く檜により艮い繊成が威令された。その繊維の幅を工直径で１０ミクロンから２０ミクロンの間であると思われた。細心−蝋雄縦果物は７から８日の培髪後には直径で１５０から２００ミクロンの大きさに遜しうる。

時には、より大きな縦果物も鋭祭された。

細胞はその付なおよび増殖に遊も好適な繊維群を選択するらしく思われた。この選択はＰＲｍの大ざさに関連しているらしい。

２００メツシユのステンレススチールふるい７通してＣ遇したセルロース浮遊故に細胞乞膚櫨した。図４ｄ、ｅで明らかなように、−ｋｋさ１１１００ミクロンまたはそれ以下の繊成の大部分は細胞と結合した。長さ１００ミクロンまたはそれ以下のＱＡｇおよびＤＥＡＲセルロースからなるＴＬｅ（［Ｉ−クロマドグ２フイー）製品上で巌維芽細胞を増殖させる予備試験を工、この製品が細胞−愼准蘭果にとって下域セルロースよりも艮（場合したことｔ示役する。

ヒト二倍体線維芽細胞が増殖してこのような細侶−鐵繊錠果′＠ン形成するという能力は本発明省の知る限り、今までには報告され−（いない。

フオルクマン（Ｆｏ　ｌ　ｋｍａｎ　）とグリーンスパン（（ｊｒｅｅｎｓｐａｎ）は細泡塊の回転傷内（２）が直径で数鱈にも増殖し５るが、直径１Ｕでは中心の禎ムは鍛死し℃いることン示し℃いる。しかし。

細胞−４，誰凝果物ははるかに小さいし、繊維が縦果物の西都へ培地？導く手助ゲして浸透させるので、多分、少なくとも８日間の培養で形成される縦果物では大部分の細胞は生存していたと思われる。しかし、より長いｊ８豊では、頻葉な培地交遺乞行っても、しばしば細胞蛋白質の減少が生じたので、このような縦果物にｉ６ける細胞の大きさと生存能力には限界が存在するにちがいない。

本報告中に記述された方法はヒト二倍体巌維芽細胞によるタイルスワクチンの大規模表造の将来性を明示している。

表　■ 谷櫨セルロース囁イオン父侠俸の浮遊培養中でのヒト二倍体層ｙ＝芽ｍ＠の増殖（±）？維持てる能力。最良の結果はＱＡＥ。

ＤＥＡｇおよびＴＥＡＥセルロースで４られた。

ＱＡＥ−ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル＋ＤＥＡＲ−ジエチルアミノエチル　＋ＴＥＡＥ−トリエチルアミ／エチル　＋アミノエチル　士ベンジル−１）ＨＡＭ　士ペンシイＡｌｌζ−ナフトイ／Ｉ／］ヒＤｗｈｊ！２　十本発閣に従って使用される陰イオン交換体は好ましくはアミノ基Ｙ［Ｌ、、特に少なくとも０．０１ｍｅｑ／７．場合によっては少なくともＱ、０５ｍｅｑ／７　または少なくとも０．１　ｍｅ　ｑ　／　ｊｉ　Ｉ）晒イオン交換能力をＭするものが好適である。

罐イオン父侠能力は通富方法による決定で５ｍｅｑ／ｉ、１６合によっては６Ω ｌｅｑ　／　ｉまたはｔ５ｍｅｑ／ｇ　またはｉ　ｍｅ　ｑ　／　Ｊｉ’でのものできえ好適である。

好適な隙イオン交換セルロースは１１賃基準で少なくとも２０％、好土しくは少なくとも５０％、そし工特に少なくとも７５％または少なくとも９０４＋の４繊が大きくて２００ミクロン、特別には大さくて１００ミクロン、好ましくは大きくて５０ミクロンまたは２５ミクロンの直径である繊維からなる。

繊維の長さは好ましくは長（て１０００ミクロン、特別には最くて２００ミクロンまたは１００ミクロンである。また長（て５０ミクロンまたは長くて２０ミクロンのＰＩｌ、ｍの長さの憾は東安である。また繊維の長さは少なくとも０．１ミクロン、特別には少なくとも１ミクロン、好ましくは少なくとも５ミクロンまたは少な（とも１０ミクロンであることが好ましい。削配楓誰の長さの値は、セルロース材料の真意の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、少な（とも９０％若しくは少なくとも９９％に基づいて休出される。

好んで使用される隙イオン交換セルロースは次の型のものに挑する。

好ましくは約α９ｍｅｑ／１１のイオン交換ｈＬカχ有するＱＡｇ〔ジエチル− （２−ヒドロキシプロピル）アミノエチルセルロース。

好ましくは約０．７〜ｃ１．９ｍｅｑ／Ｉのイオン交換能力ＹＷするＤ１！２人Ｂ（ジエチルアミノエチル）セルロース。

好まシ＜シ謝０．９ｍｅｑ／ｌのイオン交換能力ＶＷするＴＥＡＲ（トリエチルアミノエチ＃）セルロース。

好ましくは０．３３ｍｅｑ／、ｉｒ　のイオン交換能力を肩するアミノエチルセルロース。

ベンジル−ｏｗｈｗセルロース。

ベンゾイル１じ−ナフトイル１ヒＤＨｋｍ。

本発明に従って、好適な唾乳ｖＩ！Ｊ吻の二倍体＃１ｆｌ胞、好ましくは巌雄芽細胞のようなヒト細胞ゲ１燻することができ。このよ５な増殖はウィルスの増殖またはワクチンの製造にも実施することができる。

本発明の一見地によると、拙泡は１本または数本の愼遜上で籍に屑円形または円筒形状の且つ符に１ｏｏｏミクロンまで。

場合によって１１５００ミクロンまでまたは１０ミクロンまで若しくは２００ミクロンまたは１００ミクロンまでの直径を有する細胞赦集物として増殖する。細必ｄＩｋ集物の増殖は、少なくとも１０徂１＊、少なくとも５０嵐童係または少なくとも９０１＋％の細胞材料が少なくとも１０ミクロン、好ましくは少なくとも２５ミクロンまたは少なくとも５０ミクロン、１１′合によっては少なくとも１００ミクロンの直径１ｊ１：Ｎする細胞縦業物として存在するよ５になるまで実施することが好ましい。

別記細胞緘果物の細胞は早層細胞よりも多くの凝集物乞形成するｏ　ｆｏｌ記Ｍ胞峡果物は七の細胞縦果物内に好ましくは２本またはそれ以上の繊維の少なくとも一鄭分を含Ｍする。削記鑞維は上述した限展（列えば長（て５００ミクロン、特別には５０（３ミクロンまでの繊維の−１にさおよび６から５０ミクロンの間、特別には５から６００ミフロンガば１０から２０ミクロンの間の直径）内の４１Ｃ織の長さや直径をＭすることが好ましい。創記壇Ｗｉは分散液１ａｔ当りの細胞数が少なくとも１０４．少なくとも１０′または少なくとも１０′細＠ｔｉ／ｍ分散液となるまで実施することが好ましい。細胞ｍ度の上限の好適な叙諌は、多くて１０９．多くて１０’または多（て１０’　？＃ｕＵＵａ／ａｇ分紋淑である。−「１而時間は、少なくとも１日、少なくとも２日または少なくとも６日または少なくとも５日というよプに変更し５る。々ｔＨ昭Ｒ１幼時間の好適な上限は、１４日、１０日、７日まｙ：＆′ｓ、５日までとすることかでざる。

増殖Ｊ＠池中のセルロース繊維の好２１４一度は少な（ともα０１ｍｆｌ／ｌｎｔ、少なくとも０．１　ｍｇ／ａｔまロエ少なくともｌＨｇ／ｇで、場合によっては少なくともｂｍｇ／νとすることかできる。

好ニーな上限は、多くて５ＱＱＷＩｇ／ａｌ、多くて１００ｒｎｌ／Ｋ１．多くて５０ｍｇ／ｌｎｔ　または多くて１０ｍｇ／ｌｕであることが判明した。

各４の梨のｆＪｌ　ａｌのための好適な檀殖射地および他の９悄条件は当莱首に良く知られており１本発明にも使用されうる。この関−では、ガえはファルマクアファインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　からの出版物「ミクロキャリャーセルカルチャープリンシプルズアンドメンツズ（Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　（、：ｅ口Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｌｃＭｅｔｈｏｄｓ）Ｊおよび七の中の引用文献が赳考文献となり５る。

小児膵淳ワクチン袈造へのヒトニｆｊ俸嶽維芽細Ωの利用を工。

過去においては一収に市販されている減小ｆｆ１体上にこの細認ン壇噴させろｆｆＬ術的な銀かしさのためｙ★定されていた。この細胞は比収的低ｆｉ＋！ｊで増殖し、培養が操作に瀘献であったので減小化体上の大６１シ分の細帖が個々の取扱い操作中に失なわれた。本発明による１４厖荷セルロースは小担捧の使用はこれらの技術的な問題の多く？耕法する。ヒトニ１跨捧−維芽細胞はジエチル２ −ヒドロキクプロビルアミノエチ＃（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエ？　／’　（ＤＨＡＥ　）　、）　９　工？　／’　７　ミ／　工ｆ−１％／（ＴＥｒｋＫ　）　０）　ヨ５な数棟のセルロース繊維での細胞−鐵維緘果の試績で良く増殖した。

小児屏痒ワイルス感染のヒト二倍体ｆＩＭ維芽細胞の細部−繊維凝果物の浮遊培貞で以下の結果が得られた。

材料および方法：細胞株（２株のヒト胎児肺由来二倍体−雄芽細胞を使用した：（１１イングランドの国立生物標準状制研死所（Ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　８ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）から得たＭルＣ５および（２）当発明者の研究所でヒト胎児の肺組峨から早１１されたＬｕ（８）。

セルロース鴎イオン交換繊維二　大部分の実験はＱＡｉ２またはＤＲＡＷセルロースで夾施し、４？に薄ｌ−クロマトグラフィー（ＴＬＣ）では短い長さの砿碓による製品を用いた。他に使用したセルロースはＴ　ｋｉ　Ａ　Ｅ　ｉ＝よひベンジル−Ｄｇｈｗであった。

全℃のセルロースｋｉｉＦＪＱ、９ｍｅ　Ｑ　／１１の能力乞Ｍしていた。セルロースは５ｎｉｇ／社の産直で使用された。

培地およびａｔ胞増殖：　細胞増殖に使用した培地は１０釜仔十血１’１．４ｍＭグルタミン、２０ｍＭ）リシンｔ＆（ｆｉ［ｐ８７．８および１ｍＭピルビン醒ナトリクム？追加したイーグル敲小必須培地であった。

細胞ケまずグラスチックルーびん中でコン７／Ｉ／エンドな率Ｉ−に壇ｙｌＡさせ、トリプシン（２０ｍＭ）リシン、　ｐ）１７．７〜１８および０．０８％真災醗ナトリワム乞含んだリンｒＲ収伽溶液中に２００μｇ　／　ｌの結晶性トリプシン（シグマ）の浴Ｍ、）で浮遊さセ、遠沈し、−貫尻浄堕約’Ｌ５Ｘ１（ｐ　−飽赦／ｍｙセルロースのａ度にした。５〜７日間Ｊ８貞した欠、細胞−電裁雄の塊ンｐＨ１４ｃｌ）　ＩＪ　ｙ岐緩伽浴欣で６回洗浄し、最初の谷斂の無血 τδバーカーズ（Ｐａｒｋｅｒｓ）　１９９に再び＃遊させ。小児林俸ウィルスに感染させた。この実績の大部分では小児麻痺ウィルス１型〔プルネンダー（Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒ）　：ｌゲ使用し、小児麻痺ウィルス２型は１回の夾朕で使用した。ワイルス感染住は組賊培％宮中にウィルス製品２１０倍希釈の播種で測定＋、、ＳＯ％の培％細刊が感染する布釈度馨計算し、ｒ組威培養感染盆」５０％終末点（ＴＣＩＤ、）として衣わレタ。全ての７Ｊ’ｄｂ’に：　ｌｏｇｖｏＴｃＩＤｍで示す。

帖　朱：衣ＩＩ　＆ｔ、　６．３　Ｔｅ　Ｋ　１）、Ｊ・の小児麻痺ウィルス１型で感染さゼｋＬｕ（８）、？ｄｉａｌの５ｍｇ１ＭｔＱ人Ｅセルロースとの５回の１００＃ｊ浮遊ｆ＠書からの結束ゲ示す。

表　■ 浮遊培養２ａ　７．９　８．７　＆４　＆３　ａＯ、！！８　８．４　８．３　８．２　８．１　ａ３７２　７．５　７．７　７．９　７．８　７．５１２Ｌｌ　７．０　７．０　７．４　＆８　７．５１４４　１＞９　６．９　１６　７．２　６５表■ロ１ＭルＣ５細侶の６頂ｙ／１の記載セルロースとの５回の１００ｇ浮遊層養からの結果Ｙ示す。賠償細胞乞（５−（）’ｌ’ｃ１１）や／ｎｉｌの小児麻痺ウィルス１型で感染させた。

２２　７．８　８！５７．５　８．ＯＺ３４５　Ｚ８　７．５　７．８　ａｏ　７．５６８　７３　７．８　７．０　７．５　８．５１００１Ｉｔ以上の容積の浮遊培養も同様のウィルス力価ン示しよ。表ＩＶ＆！Ｍ　ＲＣ５ｆｌ胞Ｙ　５　ｍｇ　／ａｔ　ＤＥＡ、ｍ−ＴＬＣ−４ｒ、＋　＊　−スと件に増殖しＴ：時の小児淋連カイルス１型の結果？示１−０２ｄ　ａＯ＆５　７．０４８　７．８　８．５　ａ０７２　７．３　７．８　８．０小児麻俸ウィルス２型ｙａＭＥＬＣ５の５ｒｌ１ｇ／ｒａｔ　Ｄｈλｇ−ＴＬＣセルロースとの５Ｉの浮遊培養に５．ＯＴＣｌｌ）、、　／νの一度で原種した。２４時間後、力価は６５に上昇し、４８時間後には／Ｈｄ３　ＴＣＩ　Ｉ）、。／ｍｔｙｃ上昇した。これらの力価は、多分接種物が低−腿丁ざるために低いのであるが、はぼ１００倍（小児麻痺ウィルス１型で優られるものとほぼ同様の増加である）に増加しうろこと乞明示した。

ヒト二倍体巌維芽細ムは、その細認体が容易に官埋、僚準ＩＬされ、惟めて良く研究され、大部分のヒトクイｙスの増殖Ｙ継持し、ワクチン人造への鹿膓遺伝子ＤＮＡの混入の危険を完全に除去しているので、ヒトウィルスワクチンへの最良のＭ幼な細鳳基實であると考えられる。しかし大規模に幀小徂体上でこれらのａｌ泡ン壇煽てることが困雌であるため、これらの−絽ンワクチン袈造（利用することは躯かしかった。不発＃４によればヒト二倍体彎計芽細胞ゲ七ルロース倣小徂体と惨に光分な細−＠度（飼えば１．５〜２Ｘ１０・細侶畝／ｄ）で増殖しうるので、小児解体ウィルスで感染させ′ＩＣ場合［、これらの細胞またはサル胃城細飽の早Ｊ−培養で得られる力１曲よりも着しく大きな力価を得ることかでさる。

以下は本発明による方法と従来の細胞瑣殖基箪で実施した比収試緘の説明である。項燻させた細胞はヒト二倍体巌祇芽細胞のＭル０５株であった。この細認抹はジエイコブス（Ｊ　ａｃｏｂｓ）。

ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、ペイル（Ｂａｉ口ｅ）によりネイチャー、（Ｎａ　ｔｕｒｅ）、　Ｗ、　２２７巷、１６８−１７０ページ、１９７０年にａｄ４１ｉｌｃされた一文「キャラクテリスティンクスオブアヒューマンジプロイドセルデザインドＭルＣ５（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆａ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｐｌｏｉｄ　ｃｅ目ｄｅｓｉｇｎｅｄ　？ａｌもＣ５月にｒｉｉｓれており、Ｗ立生Ｗ研冗鴇１−ｉｉｔｌ研究所から入手した。

増殖培地は全ての夾続で１０係仔牛血清、２０ｍＭ）！Ｊレシン１−１７．８　、　４．Ｍグルタミン、１ｍＭビルビ／酸ナトリクムおよび０．０８４憲炭誠塩？追加したイーグル蛙小必狽培地？使用した。

以下の倣小担体を使用した。

１、本発明による倣小担体：博層クロマトグラフィー用の能力０．９６ｔｎｅｑ／ｇ　のＤｇｈｗセｙｏ−スｔＪ［（小型愼６）。

２、プラスチックビーズ＠ｌト徂体であるビオシロン（Ｈｉｏｓｉｌｏｎ）ＹＴｉ、Ｉ粉末として培地に繍Ｓ加した。

６、および４．シトデツクス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）　Ｍよびゲリビーズ（ＧｅＬｉｂｅａｄｓ）　（チオ上２チンビーズ）は製造菓省の指示に従って製造した。

本発明によるセルロースは５１１ｇ／ｕの一度で、ビオシロンは６０　ｔｎｇ／ｍｌの一度で、シトデツクスおよびゲリビーズは４　ｍｇ　／Ｌｔの濃度で使用した。

イルス１型の刀１曲の決定Ｙ含む。

ｍ代１ｊ１２１ノＮｉ１−Ｌｅ５’Ｙ４　Ｘ　Ｉ　Ｌ）’　ｍｍ１ｘ／ａ（のｍｗで浮遊培養中に接種した。場！ｌ！は１分当り約４０回転の速度で攪拌した。

培地は４日間賠償した袋、細胞倣小徂体の塊ンびんの底に沈呻させて、古い４１＃ｌ乞吸いＷし１等量の耕爵な培地乞加えることにより交換した。

６７℃で７日間培養した後、細胞倣小担体の塊’ｋｐ）ｉ７．４のリン酸緩価浴欲で６回洗浄し、焦血清パーカーズ１９９培地ン加えた。次に培養物？小児淋陣ウィルス１績（約１０ゝ−ＴＣＩＬ）、。

／ＩＬｔの従ａ）で感染させた。結果Ｙ衆■に示す。以創の央験では小児淋痺ワイルスワクチンの抗原物質？優る最適な時間は感染後７２時間目であると示されている。

表　Ｖ浮遊賠償における各柚倣小担体上で増殖したｆｌｃ５細砲中の小児麻痺ウィルス１型の力価２ａ　８．５　８．０　８．５７０　７．１　７．５　７．１４１３　７．５　Ｚ８　８．３８．０　７．５　８．３　Ｂ５７２　７．８　７．３　７．８８．０　７．５　７．５　７５本発明により種型する細胞は音直の細胞５丁ｔＪ、わ ′ら１通濱平均して多く一’Ｃ１５０，１００まＩＪは７０回の分裂（いわゆる集団分裂）というように分裂を受ける能力の１奴定され危細胞からなシ）ことが好ましい。このよ５な細胞の定在は、り１ｊえはへイフリツク（Ｈａｅｆ　Ｉ　１ｃｋ）、モアヘッド（Ｍｏｏｒｈｅａｄ）によるエクスベリメ７　ｐ　Ａ／七ｙリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｒｒｘｅｎｔａｌ　Ｌ：ｅ口ｔｋｓｅａｒｃｈ）　。

第２５含（１９６１年）、５８６〜６２１ページの［ザシリアル力ルチベイションオブヒューマンジプロイドストレインズ（Ｔｈｅ　５ｅｒｉａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｎｎａｎ　ｄｉｐｌｏｉｄｓｔｒａｉｎｓ）Ｊおよびヘイフリックによるエクスペリメンタルセルリサーチ、第６７巷（１９６５年）、６１４〜６５６ページの「ザリミテッドインヒドロライフタイムオブヒューマンジプロイドセＡ／Ｘトレインズ（Ｔｈｅ　１１ｍ１ｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

目ｆｅｔｉｍｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｐｌｏｉｄ　ｃｅｌｌ　５ｔｒａｉｎｓ月のよ５な文献中に見ろことができる。

細胞源の列としては、一般には動物細胞の５５を抵動物の細胞で声」えはａ増殖のような鳥類の細胞やラット、マウス、す、１％／。

ウシ、ウマ、メタ、ヒツジ、イヌ、ネコおよび符にヒト細胞のような哺乳＃ｈ物の細胞である。増殖させる細胞は、しばしば上述起源動物の胎児細胞（問えはヒト男子または女子胎児）からなる。その細胞は肺、皮Ｉ１１．民皮、上皮のような特定滲゛ビから由来てる。胎児細胞の列としてはニワトＩＪ胚ｉＭ維芽細泡も含まれる。

細胞）＠養は＃素および小児ｇ俸、狂犬病。風、疹、インフルエンザ、はしか、 ′＼ルベス、偽偽狂犬病２尼σ）製造［基づいたインター・フエロンのようなホルモンなどの性々の生成物の生殖に使用されうる。ＷｌｉＵによりワクチン人造１を容認されている＃Ｍ胞の賠償γ用いるこｋが好適である。

セルロース繊維の好適な寸法は上述しである。少なくとも２０ミクロン、少なくとも４，０ミクロンまたは少なくとも６０ミクロンの最さのｒａｍがしばしば過当である。同時に．繊維の長さの上限ｉ’ｚ削述し′ｆ：．限界値（飼えば。長くて２００ミクロンｆたは最くて１５０ミクロンま茫は従（て１００ミクロンまで）付近である。次に削述の愼雄長のれ１直と四績にして，セルロース材料の少なくとも６０真を航好ましくは少なくとも５０嵐瀘優．特別には少なくとも７５嵐菫釜．９０惠菫鴫または９９Ｎ．ｔ％に基づいて檻維長の数１直を計算する。

本発明に従って使用される砿イオン交換セルロース材料用に基礎として使用されるセルロースは約２０００〜ａｏｏｏ　ｆ．たはそれ以上（例えば鎖中に３５００またはそれ以上の半位の繰返し）のグルコースの瓜合体からなる。グルコシド結合はβ位であり，セルロースはβ−１〕−グルコースの重合体として定ａされつる。

図１−　５ｍｇ／ｍｌ　ＱＡ１！Ｊ，ＤＥＡＮ　またはＴＷＡＷセルロース？含む１００ｇの浮遊培侵中に２０Ｘ１０＠細＠数を播種したＬ　ｕ　（　８　）　＃ＪＩＩ胞の糟焔。

図２−　２０Ｘ１０”細＠数乞邊植した１００ａの浮遊賠償中のＬｕ（Ｓ）細胞のｐａ殖へのＱＡＥセルロース誂度の＃書。

図５　−　３　ｍｌ／／ｒａｔ　ＱｋＥＹ含む１００Ｍの浮遊培養中のしｕ　（　Ｓ　）　４ｉｕ胞の種型への細喝帰櫨数の整置。

凶４−　ヒトニ焙俸厭縦芽細泡−繊維凌果物の形６学的外観（矢印び照）。

ＡおよびＢ：　１）ＥＡＥセルロースとの坩譬４日目のＭルＣ５。

３　８　０　ｘ。

Ｃ：　５ｍｇ／ｕ　ｔ，ＩＡＥセルロースとの培簀１６日目のＭＬＬｅ５。

３８０ｘ。

１）：　２００メツシユのステンレススチールふるいン通してｅ過Ｌ７．：、ＱＡＷセルロース（Ｆ１１＋＋＋ｙ／酊）との培誉８日目のＬｕ（Ｓ）ｓ４８ＸａＥ：　２００メツシユのステンレススチールふるいケ辿して１４したＱＡＥセルロース（約１ｙ／ｄ）　との培虜８日目のＬｕ（８）、９６０ｘ。

Ｆ：　３ｍｇ／ａｊＱＡＥセｙａーｘと（’Ｌ）ｊ？ｉ貞１　５　Ｂ　ｆｉノＭｌ：５。

１　２　０　Ｘ。

図　１老を日級図　２１２３４５６７　Ｂ　９１０１１１２１３１４１Ｓ材ＪＬｅ軌図　３賠す穀Ｆｅｂ、何Ｆ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和６１年１月２１日　画特許庁長官　宇　賀　道　部　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／５Ｅ８５／口０２１６２、発明の名称細胞増殖ろ、特許出願人住所　スウェーデン王国ニス−１７１６３ンルナ。

住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号５、補正書の提出年月日浄占（内容に変更なし）補正された請求の範囲（１１陽′１ｄ荷および／または陰イオン交換能力を有するセルロース繊維を含む浮遊液中で増殖乞行うことを特徴とする。培養培地中で浮遊状態で通常の二倍体細胞火増殖する方法。

（２）セルロースが陰イオン交換セルロースからなり、好ましくはアミノ基を有しており且つ特に、少なくとも０．０１ｍｅｑ／Ｆであり場合により５ｍｅｑ／、９　までのイオン交換能力を有すること乞特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。

（３）陰イオン交換セルロース繊維乞使用し、そのうちの重量基準にして少なくとも２０％がせいぜい１００ミクロンの繊維直径ｌ有しており、好ましくはせいぜい１０００ミクロンで少なくとも１ミクロンの長さ？有していることを特徴とする請求の範囲第１項まムニは第２項に記載の方法。

（４）イオン交換セルロースが以下のいずれかの型に属することを特徴とする請求好ましくは約Ｑ，９　ｍｅ　ｑ　／　ｇのイオン交換能力を有するＱＡＥ〔ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル〕セルロ一孔好ましぐは約０．７〜０．９ｍｅｑ／ｉのイオン交換能力を町丁る１）ＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロース。

好ましくは杓０．９ｍｅｑ／．！ｉ’のイオン交換能力ンイ１￥るＴＥＡ．Ｅ（　｝　ｌ）エチルアミノエチル）セルロース。

好ましくは０３ろｍｅｑ／ｌ’　のイオン交換能力をＭ丁るアミノエチルセ，ルロース。

ベンジル−ＤＥＡＩらセルロース。

ベンゾイル比−ナフトイル比Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｂ（５）捕乳動物の二倍体細胞、特にヒト細胞、特に線維芽細胞の増殖、場合によっ”Ｃはウィルスまたはワクチンの製造のへ二めの増殖を含むことうで特徴とする上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。

（６）細胞乞１本ま１こは数本の繊維上で、好ま；−＜は本・瓜的に楕円形ま１こは円筒形状であって、特に１０００ミクロンまでの直径で好ま１〜くは少なくとも１０ミクロンの直径’ｌｆＷする細胞凝集物として単層細胞よりも多い量で増殖させ、該細胞凝集物はその細胞凝集物中に２本またはそれ以上の繊維の少な（とも一部分？封入しており、好ましくはその繊維はせいぜい５００ミクロンの長さと好ましくは６〜５０ミクロンの直径を有しており、該増ＭＹ好ましくは分散液１ｍｌ当りの細胞数が少なくとも１０４細胞数／ｍ１分散液で好ましくはせいぜい１０９細胞数／ゴ分散液洗なるまで実施し１％に少なくとも１日で好ましくはせいぜい１４日の期間実施することヶ特徴とする上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。

（７）培養培地中のセルロース繊維の濃度が少なくとも０．０１ｍ、９／　ｍｌで且つせいぜい５００ｍｇ／ｍｌであること乞特徴とする上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。

手続補正よ（方式）１、事件の表示ＰＣ丁／５Ｅ８５１００２１３２、発明の名称細胞増殖３、補正をする者小ｆｌとの関係　出　願　人住所名　称　スタテンス・バクプリ第１］ギスカ・ラボラトリラム（エスベーエル）４６代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号５、補正命令の１］付　昭和６１年　９月１６日　（発送日）６、補正の対象タイプした請求の範囲の翻訳文７、補正の内容別紙の通りくなお、内容には変更なし）手続補正出（方式）１、事件の表示ＰＣＴ／５Ｅ８５１００２１３２、発明の名称細胞増殖３、補正をする者事件との関係　出　願　人住所名　称　スタテンス・バクテリオロギス力・ラボラトリラム（エスベーエル）４、代　理　人、− 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２ｆｆｉ１号新大手町ビル　２０６号室５、補正命令の日付　昭和６１年　９月１６日　（発送日）６、補正の対象（１）　委任状及訳文（２）　法人国籍証明書及訳文（３）　タイプした明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容別紙の通り（なお、（３）の書面の内容には変更なし）国際調査報告１炉彎喝緯Ｉ龜−ｕｌ＾−−−ｉ−【ｌＩ嘲ｅＩＩ！−・ＰＣＬＩＳＥ８５１００２１コ１

Claims

【特許請求の範囲】（１）陽電荷および／または陰イオン交換能力を肩有するセルロース繊維を含む浮遊液中で埴殖を行うことを特徴とする．培養培地中で浮遊状態で二倍体細胞を増殖する方法。（２）セルロースが陰イオン交換セルロースからなり、好ましくはアミノ基を有しており且つ特に、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５または少なくとも０．１ｍｅｑ／ｇであり好ましくは５ｍｅｑ／ｇまて、５ｍｅｑ／ｇまで。１．５ｍｑ／ｇまでまたは１ｍｅｑ／ｇまでのイオン交換能力を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。（３）陰イオン交換セルロース繊維を使用し、そのうちの重量基準にして少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％そして特に少なくとも７５％がせいぜい２００ミクロン、好ましくはせいぜい１００ミクロン、せいぜい５０ミクロンまたはせいぜい２５ミクロンの繊維直径を有しでおり、セルロース材料の少なくとも５０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％まには少なくとも９９重量％に基づいて算出し繊維の長さが好ましくはせいぜい１０００ミクロン、好ましくはせいぜい２０ロミクロン、せいぜい１００ミクロンまには特にせいぜい５０ミクロンまにはせいぜい２０ミクロンの長さで、且つ好ましくは少なくとも０．１ミクロン、特に少なくとも１ミクロン、少なくとも５ミクロンまには少なくとも１０ミクロンの長さであることを特徴とする請求の範囲第１項まには第２項に記載の方法。（４）陰イオン交換セルロースが以下のいずれかの型に属することを特徴とする上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。好ましくは約０．９ｍｅｑ／ｇのイオン交換能力を有するＱＡＥ〔ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル〕セルロース、好ましくは約０．７〜０．９ｍｅｑ／ｇのイオン交換能力を有するＤＥＡＥ（ジェチルアミノエチル）セルロース、好ましくは０．９ｍｅｑ／ｇのイオン交換能力を有するＴＥＡＥ（トリェチルアミノエチル）セルロース、好ましくは０．３３ｍｅｇ／ｇイオン交換能力を有するアミノエチルセルロース、ベンジル−ＤＥＡＥセルロース、べンゾイル化−ナフトイル化ＤＥＡＥ。（５）哺乳動物の二倍体細胞、特にヒト細胞、特に線維芽細胞の増殖、場合によつてはワイルスまたはワクチンの製造のための応用を含むことを特徴とする上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。（６）細胞を１本または数本の繊維上で、好ましくは本質的に楕円形または円筒形状であつて、特に１０００ミクロンまで、５００ミクロンまでまたは３００ミクロンまでの直径で好ましくは少なくとも１０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも５０ミクロンまたは少なくとも１００ミクロンの直径を有する細胞凝集物として単層細胞よりも多い量で増殖させ、該細胞凝集物はその細胞凝集物中に２本またはそれ以上の繊維の少なくとも一部分を封入しており、好ましくはその繊維はせいぜい５００ミクロン、特にせいぜい５００ミクロンの長さと好ましくは３〜５０ミクロン、特に５〜３０ミクロン（たとえば１０〜２０ミクロン）の直径を有しており、該増殖を好ましくは分散液１ｍｌ当りの細胞数が少なくとも１０４、少なくとも１０５または少なくとも１０６細胞数／ｍｌ分散液で、好ましくはせいぜい１０９せいぜい１０８またはせいぜい１０７細胞数／ｍｌ分散液になるまで実施し、特に少なくとも１日で好ましくは１４日の期間実施することを特徴とする上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。（７）培養培地中のセルロース繊維の濃度が少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、場合によつては少なくとも５ｍｇ／ｍｌで好ましくはせいぜい５００ｍｇ／ｍｌ、せいぜい１００ｍｇ／ｍｌ、せいぜい５０ｍｇ／ｍｌまにはせいぜい１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴と下る上記請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。