JPS641119B2 - - Google Patents
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- JPS641119B2 JPS641119B2 JP55076690A JP7669080A JPS641119B2 JP S641119 B2 JPS641119 B2 JP S641119B2 JP 55076690 A JP55076690 A JP 55076690A JP 7669080 A JP7669080 A JP 7669080A JP S641119 B2 JPS641119 B2 JP S641119B2
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- Japan
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- interferon
- cells
- culture
- poly
- microcarriers
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はインターフエロン産生方法にかゝわる
ものであり、更に詳しくは正に荷電した化学的残
基を有するミクロキヤリヤ上に増殖した動物細胞
をポリリボイノシン酸（ポリＩ）およびポリリボ
シチジル酸（ポリＣ）を構成成分として含むイン
ターフエロン誘発剤で刺激してインターフエロン
産生を行わせる方法に関するものである。
ものであり、更に詳しくは正に荷電した化学的残
基を有するミクロキヤリヤ上に増殖した動物細胞
をポリリボイノシン酸（ポリＩ）およびポリリボ
シチジル酸（ポリＣ）を構成成分として含むイン
ターフエロン誘発剤で刺激してインターフエロン
産生を行わせる方法に関するものである。
インターフエロンは各種のウイルスや二重鎖
RNA等の誘起剤の刺激により動物細胞が産生す
るタンパク質であり、ウイルスの細胞内増殖を抑
制する作用を有する。インターフエロンの作用は
ウイルス種に関しては非特異的であるが、動物種
に関しては特異的である。すなわち、ある動物種
の細胞で産生されたインターフエロンは他の動物
種に対しては作用しない。近年ある種のウイルス
性疾患さらには腫瘍に対するインターフエロンの
治療効果が認められるに至り、その医療薬として
の可能性が注目を集めている。インターフエロン
を医薬として応用するためには、ヒトの何らかの
細胞を用いて生体外でインターフエロンを産生さ
せこれを分離精製することが必要となる。ヒト・
インターフエロンを産生させる為の細胞としてこ
れまでは血液より分離した白血球が用いられるこ
とが多かつたが、次第に胎児あるいは新生児由来
の二倍体細胞がこれに代わろうとしている。白血
球の供給は不特定多数の人間にたよらざるを得
ず、また白血球の産生したインターフエロン標品
中には各種のリンフオカインが混入している恐れ
が多い。従つて白血球から得られるインターフエ
ロン標品の安全性に対する監視は必ずしも容易で
はない。これに対して二倍体細胞にあつては一個
体由来のものを大量に培養することが可能である
ので、得られるインターフエロン標品の安全性の
確認は白血球由来の場合に比して容易であると考
えられている。
RNA等の誘起剤の刺激により動物細胞が産生す
るタンパク質であり、ウイルスの細胞内増殖を抑
制する作用を有する。インターフエロンの作用は
ウイルス種に関しては非特異的であるが、動物種
に関しては特異的である。すなわち、ある動物種
の細胞で産生されたインターフエロンは他の動物
種に対しては作用しない。近年ある種のウイルス
性疾患さらには腫瘍に対するインターフエロンの
治療効果が認められるに至り、その医療薬として
の可能性が注目を集めている。インターフエロン
を医薬として応用するためには、ヒトの何らかの
細胞を用いて生体外でインターフエロンを産生さ
せこれを分離精製することが必要となる。ヒト・
インターフエロンを産生させる為の細胞としてこ
れまでは血液より分離した白血球が用いられるこ
とが多かつたが、次第に胎児あるいは新生児由来
の二倍体細胞がこれに代わろうとしている。白血
球の供給は不特定多数の人間にたよらざるを得
ず、また白血球の産生したインターフエロン標品
中には各種のリンフオカインが混入している恐れ
が多い。従つて白血球から得られるインターフエ
ロン標品の安全性に対する監視は必ずしも容易で
はない。これに対して二倍体細胞にあつては一個
体由来のものを大量に培養することが可能である
ので、得られるインターフエロン標品の安全性の
確認は白血球由来の場合に比して容易であると考
えられている。
従来、二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養法
としては、ルー瓶もしくはローラ瓶を用いる培養
方法が知られているが、これらの方法により大量
の係留依存性細胞を培養することはかなり困難で
あると考えられている。これらの方法において
は、細胞はルー瓶の底面もしくはローラ瓶の側面
に単層に増殖するだけであるため大量ローラ瓶に
あたつては、極めて多数のルー瓶もしくはローラ
瓶を扱う必要があり、取り扱いが煩雑となること
を避け難い。
としては、ルー瓶もしくはローラ瓶を用いる培養
方法が知られているが、これらの方法により大量
の係留依存性細胞を培養することはかなり困難で
あると考えられている。これらの方法において
は、細胞はルー瓶の底面もしくはローラ瓶の側面
に単層に増殖するだけであるため大量ローラ瓶に
あたつては、極めて多数のルー瓶もしくはローラ
瓶を扱う必要があり、取り扱いが煩雑となること
を避け難い。
これに対し、最近、係留依存性細胞の大量培養
に適したミクロキヤリヤ培養法と称される培養法
が開発された（特開昭53―62889、米国特許第
4189534号）。
に適したミクロキヤリヤ培養法と称される培養法
が開発された（特開昭53―62889、米国特許第
4189534号）。
この培養法は、正に荷電した化学的残基を有す
るミクロキヤリヤ（以下、単にミクロキヤリヤと
呼称する）を懸濁させた培地中に種細胞を接種
し、懸濁状態で培養する方法であり、接種された
細胞はミクロキヤリヤ表面に付着し、そこで増殖
する。ミクロキヤリヤ培養法は、細胞付着表面積
を大きくすることが容易であり、かつ、その取り
扱いも容易であるため特に、係留依存性細胞の大
量培養に適した培養法である。
るミクロキヤリヤ（以下、単にミクロキヤリヤと
呼称する）を懸濁させた培地中に種細胞を接種
し、懸濁状態で培養する方法であり、接種された
細胞はミクロキヤリヤ表面に付着し、そこで増殖
する。ミクロキヤリヤ培養法は、細胞付着表面積
を大きくすることが容易であり、かつ、その取り
扱いも容易であるため特に、係留依存性細胞の大
量培養に適した培養法である。
一方、培養細胞にインターフエロンを産生させ
る技術として、スーパーインダクシヨン法と呼ば
れる、二重鎖RNA等のインターフエロン誘発剤
を用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミド、
アクチノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処
理することによりインターフエロン産生を一層増
強せしめる方法（米国特許第3773924号）、UV法
と呼ばれるインターフエロン誘発剤を用いて細胞
を刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を照射
して、インターフエロン産生を一層増強せしめる
方法、等の方法が知られている。かかるインター
フエロン産生方法はインターフエロン誘発剤とし
て例えばポリＩ：ポリＣ等の二重鎖合成核酸を用
いる場合に特にその効果が顕著である。
る技術として、スーパーインダクシヨン法と呼ば
れる、二重鎖RNA等のインターフエロン誘発剤
を用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミド、
アクチノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処
理することによりインターフエロン産生を一層増
強せしめる方法（米国特許第3773924号）、UV法
と呼ばれるインターフエロン誘発剤を用いて細胞
を刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を照射
して、インターフエロン産生を一層増強せしめる
方法、等の方法が知られている。かかるインター
フエロン産生方法はインターフエロン誘発剤とし
て例えばポリＩ：ポリＣ等の二重鎖合成核酸を用
いる場合に特にその効果が顕著である。
本発明者等は、二倍体細胞等の培養細胞由来の
インターフエロンを大量に産生させる方法とし
て、上記培養方法およびインターフエロン産生方
法に着目し、ミクロキヤリヤ培養法で培養した細
胞に、二重鎖合成核酸等をインターフエロン誘発
剤とするスーパーインダクシヨン法により、イン
ターフエロンを産生させることを試みてきた。か
かる方法の基本条件等については前記米国特許第
4189534号にすでに記載がある。
インターフエロンを大量に産生させる方法とし
て、上記培養方法およびインターフエロン産生方
法に着目し、ミクロキヤリヤ培養法で培養した細
胞に、二重鎖合成核酸等をインターフエロン誘発
剤とするスーパーインダクシヨン法により、イン
ターフエロンを産生させることを試みてきた。か
かる方法の基本条件等については前記米国特許第
4189534号にすでに記載がある。
ポリＩおよびポリＣからなる複合物を用いてイ
ンターフエロン産生を誘発させる場合、一般的に
はポリＩ中のヒポキサン塩基とポリＣ中のシトシ
ン塩基のモル比（Ｉ／Ｃ比）が１であり過不足な
く塩基対を形成している２重鎖RNAの形で用い
ることが多い。事実FulcoffらはＩ／Ｃ比とイン
ターフエロン産生能を調べた結果、Ｉ／Ｃ比が１
の点でインターフエロン産生が最高値を示すこと
を報告している。（Biochem.Biophys.Acta.174，
108―116，69）。
ンターフエロン産生を誘発させる場合、一般的に
はポリＩ中のヒポキサン塩基とポリＣ中のシトシ
ン塩基のモル比（Ｉ／Ｃ比）が１であり過不足な
く塩基対を形成している２重鎖RNAの形で用い
ることが多い。事実FulcoffらはＩ／Ｃ比とイン
ターフエロン産生能を調べた結果、Ｉ／Ｃ比が１
の点でインターフエロン産生が最高値を示すこと
を報告している。（Biochem.Biophys.Acta.174，
108―116，69）。
本発明者等はミクロキヤリヤ培養法で培養した
ヒト２倍体細胞等でインターフエロンを大量に産
生させる際に、ポリＩおよびポリＣを構成成分と
して含む核酸物質をインターフエロン誘発剤とし
て用いる場合、Ｉ／Ｃ比がインターフエロン産生
能に著るしく影響をおよぼすことを見出し、本発
明に到達した。即ち、ガラス面上やポリスチレン
面上等に増殖した細胞ではＩ／Ｃ比＝１でインタ
ーフエロン産生が最高値を示すのに対し、正に荷
電した化学的残基を有するミクロキヤリヤ上で増
殖した細胞ではＩ／Ｃ比＞１でインターフエロン
産生が最高値を示すことを見出した。更に具体的
に説明するとミクロキヤリヤ上に増殖した細胞を
用いてインターフエロン産生を行なわせる場合、
Ｉ／Ｃ＝１の２重鎖ポリＩ：ポリＣをインターフ
エロン誘発剤として用いるより、Ｉ／Ｃ＞１、よ
り好ましくはＩ／Ｃ＝1.05〜1.33、特に好ましく
はＩ／Ｃ＝1.1〜1.3の範囲で用いることにより明
らかに高力価のインターフエロン産生を行なわせ
ることが可能であることを見出した。
ヒト２倍体細胞等でインターフエロンを大量に産
生させる際に、ポリＩおよびポリＣを構成成分と
して含む核酸物質をインターフエロン誘発剤とし
て用いる場合、Ｉ／Ｃ比がインターフエロン産生
能に著るしく影響をおよぼすことを見出し、本発
明に到達した。即ち、ガラス面上やポリスチレン
面上等に増殖した細胞ではＩ／Ｃ比＝１でインタ
ーフエロン産生が最高値を示すのに対し、正に荷
電した化学的残基を有するミクロキヤリヤ上で増
殖した細胞ではＩ／Ｃ比＞１でインターフエロン
産生が最高値を示すことを見出した。更に具体的
に説明するとミクロキヤリヤ上に増殖した細胞を
用いてインターフエロン産生を行なわせる場合、
Ｉ／Ｃ＝１の２重鎖ポリＩ：ポリＣをインターフ
エロン誘発剤として用いるより、Ｉ／Ｃ＞１、よ
り好ましくはＩ／Ｃ＝1.05〜1.33、特に好ましく
はＩ／Ｃ＝1.1〜1.3の範囲で用いることにより明
らかに高力価のインターフエロン産生を行なわせ
ることが可能であることを見出した。
以下に実施例でミクロキヤリヤ上で増殖した細
胞を用いて行なつた本発明方法の一例を説明す
る。併わせてプラスチツク平面上で増殖した細胞
を用いて行なつた実験を参考例として示す。
胞を用いて行なつた本発明方法の一例を説明す
る。併わせてプラスチツク平面上で増殖した細胞
を用いて行なつた実験を参考例として示す。
実施例
仔牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有す
る架橋デキストランミクロキヤリヤ0.25％を含む
イーグルMEM培地1.6にヒト２倍体細胞を1.0
×105ケ／mlの割合いで接種し、ガラス製スピナ
ーフラスコでゆるく撹拌しながら37℃で７日間培
養した。途中１回培養培地を仔牛血清５％を含む
新しいイーグルMEM培地と交換した。到達細胞
数は8.0×105ケ／mlであつた。次に細胞およびミ
クロキヤリヤを沈降させ上清培地を捨て、インタ
ーフエロン100国際単位／mlおよび仔牛血清２％
を含むイーグルMEM培地を捨てた培地量に等し
い量加え、37℃で20時間培養を継続した。次に細
胞およびミクロキヤリヤを含む培養液をミクロキ
ヤリヤ量がなるべく均等に分配されるように200
mlづつ８本の小型スピナーフラスコに分注した。
細胞およびミクロキヤリヤを沈降させ、上清培地
を捨てた後、シクロヘキシミド、10μｇ／mlおよ
びそれぞれ定められたＩ／Ｃ比でボリＩ＋ポリＣ
を両ヌクレオチド中のりん酸含量として
115mμmol／mlを加え、37℃で４時間培養し、更
にアクチノマイシンＤを4μｇ／mlになるように
加え、１時間細胞を処理した後、細胞およびミク
ロキヤリヤを沈降させ、上清液を捨て、イーグル
MEM培地を捨てた量と同量加え、更にこの操作
をもう一度繰り返した。最終的にメチルセルロー
ス0.05％を添加したイーグルMEM培地を捨てた
量（約180ml）と同量加え、37℃で24時間培養を
継続した。最終的に用いた培地中に産生されたイ
ンターフエロンの量をFL細胞およびVesicular
stomatitis virusを用いたCPE―Inhibition法で
測定し、国際単位に換算した。結果を図１に示
す。
る架橋デキストランミクロキヤリヤ0.25％を含む
イーグルMEM培地1.6にヒト２倍体細胞を1.0
×105ケ／mlの割合いで接種し、ガラス製スピナ
ーフラスコでゆるく撹拌しながら37℃で７日間培
養した。途中１回培養培地を仔牛血清５％を含む
新しいイーグルMEM培地と交換した。到達細胞
数は8.0×105ケ／mlであつた。次に細胞およびミ
クロキヤリヤを沈降させ上清培地を捨て、インタ
ーフエロン100国際単位／mlおよび仔牛血清２％
を含むイーグルMEM培地を捨てた培地量に等し
い量加え、37℃で20時間培養を継続した。次に細
胞およびミクロキヤリヤを含む培養液をミクロキ
ヤリヤ量がなるべく均等に分配されるように200
mlづつ８本の小型スピナーフラスコに分注した。
細胞およびミクロキヤリヤを沈降させ、上清培地
を捨てた後、シクロヘキシミド、10μｇ／mlおよ
びそれぞれ定められたＩ／Ｃ比でボリＩ＋ポリＣ
を両ヌクレオチド中のりん酸含量として
115mμmol／mlを加え、37℃で４時間培養し、更
にアクチノマイシンＤを4μｇ／mlになるように
加え、１時間細胞を処理した後、細胞およびミク
ロキヤリヤを沈降させ、上清液を捨て、イーグル
MEM培地を捨てた量と同量加え、更にこの操作
をもう一度繰り返した。最終的にメチルセルロー
ス0.05％を添加したイーグルMEM培地を捨てた
量（約180ml）と同量加え、37℃で24時間培養を
継続した。最終的に用いた培地中に産生されたイ
ンターフエロンの量をFL細胞およびVesicular
stomatitis virusを用いたCPE―Inhibition法で
測定し、国際単位に換算した。結果を図１に示
す。
図１から明らかなようにＩ／Ｃ＝1.05―1.33の
範囲ではインターフエロン産生はＩ／Ｃ＝１の場
合のインターフエロン産生量を上まわり、Ｉ／Ｃ
＝1.2付近ではＩ／Ｃ＝１の場合のインターフエ
ロン産生量の2.7倍にも達した。
範囲ではインターフエロン産生はＩ／Ｃ＝１の場
合のインターフエロン産生量を上まわり、Ｉ／Ｃ
＝1.2付近ではＩ／Ｃ＝１の場合のインターフエ
ロン産生量の2.7倍にも達した。
参考例
培養面積25cm2のポリスチレン製組織培養フラス
コに実施例で用いたと同じヒト’倍体細胞４×
105ケ／フラスコを仔牛血清５％を加えたイーグ
ルMEM培地８mlに加え、37℃で６日間培養し
た。到達細胞数は2.5×106ケノフラスコであつ
た。古い培養液を捨て、インターフエロン100国
際単位／mlおよび仔牛血清２％を含むイーグル
MEM培地８ml／フラスコを加え、37℃でおよそ
20時間培養を継続した再び培養液を捨てる。シク
ロヘキシミド5μｇ／mlおよびそれぞれ定められ
た割合いでポリＩ＋ポリＣを両又クレオチド中の
りん酸含量として23mμmol／mlを加え、37℃で
４時間培養し、更にアクチノマイシンＤを4μ
ｇ／mlになるように加え１時間細胞を処理する。
上清液を捨て、メチルセルロース0.05％を添加し
たイーグルMEM培地を８ml／フラスコ加え37℃
で48時間培養を継続した。最終的に用いた培地中
に産生されたインターフエロンの量をFL細胞お
よびVesicular stomatitis virusを用いたCPE―
Inhibition法で測定し国際単位に換算した。結果
を図２に示す。
コに実施例で用いたと同じヒト’倍体細胞４×
105ケ／フラスコを仔牛血清５％を加えたイーグ
ルMEM培地８mlに加え、37℃で６日間培養し
た。到達細胞数は2.5×106ケノフラスコであつ
た。古い培養液を捨て、インターフエロン100国
際単位／mlおよび仔牛血清２％を含むイーグル
MEM培地８ml／フラスコを加え、37℃でおよそ
20時間培養を継続した再び培養液を捨てる。シク
ロヘキシミド5μｇ／mlおよびそれぞれ定められ
た割合いでポリＩ＋ポリＣを両又クレオチド中の
りん酸含量として23mμmol／mlを加え、37℃で
４時間培養し、更にアクチノマイシンＤを4μ
ｇ／mlになるように加え１時間細胞を処理する。
上清液を捨て、メチルセルロース0.05％を添加し
たイーグルMEM培地を８ml／フラスコ加え37℃
で48時間培養を継続した。最終的に用いた培地中
に産生されたインターフエロンの量をFL細胞お
よびVesicular stomatitis virusを用いたCPE―
Inhibition法で測定し国際単位に換算した。結果
を図２に示す。
図２から明らかなように平面培養細胞ではＩ／
Ｃ比＝１でインターフエロン産生は最高値を示す
がＩ／Ｃ比の変化に対するインターフエロン産生
量の変化の割合いはミクロキヤリヤ培養細胞の場
合に比べて低い。
Ｃ比＝１でインターフエロン産生は最高値を示す
がＩ／Ｃ比の変化に対するインターフエロン産生
量の変化の割合いはミクロキヤリヤ培養細胞の場
合に比べて低い。
図１はミクロキヤリヤ培養細胞をＩ／Ｃ比の異
なるポリＩおよびポリＣの混合物でインターフエ
ロン産生させた場合のＩ／Ｃ比（横軸）とインタ
ーフエロン産生量（縦軸）の関係を示した線図で
あり、図２は平面培養細胞をＩ／Ｃ比の異なるポ
リＩおよびポリＣ混合物でインターフエロン産生
させた場合のＩ／Ｃ比（横軸）とインターフエロ
ン産生量（縦軸）の関係を示した線図である。
なるポリＩおよびポリＣの混合物でインターフエ
ロン産生させた場合のＩ／Ｃ比（横軸）とインタ
ーフエロン産生量（縦軸）の関係を示した線図で
あり、図２は平面培養細胞をＩ／Ｃ比の異なるポ
リＩおよびポリＣ混合物でインターフエロン産生
させた場合のＩ／Ｃ比（横軸）とインターフエロ
ン産生量（縦軸）の関係を示した線図である。
Claims (1)
- １ 正に荷電した化学的残基を有するミクロキヤ
リヤ上に増殖した動物細胞をポリリボイノシン酸
およびポリリボシチジル酸を構成成分として含む
インターフエロン誘発剤を用いて刺激しインター
フエロン産生を行なわせるに際し、ポリリボイノ
シン酸中のヒポキサン塩基のモル分率がポリリボ
シチジル酸中のシトシン塩基のモル分率を上まわ
る範囲で使用することを特徴とするインターフエ
ロン産生方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7669080A JPS572220A (en) | 1980-06-09 | 1980-06-09 | Production of interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7669080A JPS572220A (en) | 1980-06-09 | 1980-06-09 | Production of interferon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS572220A JPS572220A (en) | 1982-01-07 |
| JPS641119B2 true JPS641119B2 (ja) | 1989-01-10 |
Family
ID=13612453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7669080A Granted JPS572220A (en) | 1980-06-09 | 1980-06-09 | Production of interferon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS572220A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59179095A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Yamasa Shoyu Co Ltd | インタ−フエロンの製造法 |
| JPS61163763A (ja) * | 1985-01-14 | 1986-07-24 | Fujitsu Ltd | 搬送波再生方式 |
| WO2006131023A1 (en) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Newbiomed Pika Pte Ltd | Polyinosinic acid-polycytidylic acid-based adjuvant |
| US20070166800A1 (en) | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Haixiang Lin | Immunogenic substances comprising a polyinosinic acid-polycytidilic acid based adjuvant |
| RU2678981C2 (ru) | 2014-12-23 | 2019-02-05 | Йишенг Байофарма (Сингапур) Пте Лтд | Композиция от бешенства, содержащая адъювант pika |
-
1980
- 1980-06-09 JP JP7669080A patent/JPS572220A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS572220A (en) | 1982-01-07 |
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