JPS6229986A - 生物工学的に製造した有用物質の分離方法 - Google Patents

生物工学的に製造した有用物質の分離方法

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JPS6229986A
JPS6229986A JP61102966A JP10296686A JPS6229986A JP S6229986 A JPS6229986 A JP S6229986A JP 61102966 A JP61102966 A JP 61102966A JP 10296686 A JP10296686 A JP 10296686A JP S6229986 A JPS6229986 A JP S6229986A
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permeate
liquid
membrane
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JP61102966A
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ヴィルフリート・レーゼ
フランツ−ヨゼフ・カルダック
ノルベルト・キューネ
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Henkel AG and Co KGaA
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Biochemie GmbH
Henkel AG and Co KGaA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は、生物工学的に製造した有用物質を細胞浮遊液
から分離する方法に関ずろちのであって、より詳細には
、０．Ｉ７ｚｍ、にり大きい（＞０．１μ＊）ミク「ノ
細孔を有する多孔質ポリマー管をメンブランとして使用
１７、これに毎秒２ｍより大きい（〉２ｍ／秒）流速で
発酵槽液を流通（７、その際、濃縮側および透過側の間
を５バールよ１・〕小さい１１゛力差て支配することに
よ−）で実施されるり〔ｌスフ「ノーミクロ濾過による
生物下学的に製造した（ｊ″用物質の分離方法に関ずろ
。
［従来技術］ 固液分離の分す１ＦにおＣＩ′ろ新しい発展（」、り［
１スフ〔ノーミクロ濾過である（［デベ［ｌノブメン）
・・スタディズ・オブ・クロスフロー・マイクロフィル
ｌ゛レーションＩＪ）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　　５ｔｕ
ｄｉｅｓ　　ｏｆＣｒｏｓｓＮｏｗ　　Ｍｉｃｒｏｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ）ｌ、バーテラ（ＲＢ　ｅｒＬｅｒａ
）、スチーブン（Ｊ−１、Ｓ　ｔｅｖｅｎ）、マトカル
フェ（Ｍ　、　Ｍａｔｃａｌｆｅ）、ザ・ケミカル・エ
ンジニア（Ｔｈｅ　　Ｃｔ＋ｅｍｉｃａｌ　　Ｅｎｇｉ
ｎｅｃｒ）、１９８４年６月、１０頁以下）。
このメンブラン・ミク［１濾過の適用可能な分！Ｉｊ／
は、細胞外の特に高分子量の有用物質を細胞体およびそ
の他の固体成分から分離することである。
例えば発酵槽液のような培養液十た（」培地溶液に溶解
している細胞外有用物質を、細胞、細胞残層、その他、
培地にｌ）１来４゛ろ固体成分から分離すること（Ｊ、
捕捉されるー・き固体成分および菌体細胞の人、きさか
０．２〜５／ＺＮと極めて微細であること、発酵槽液と
分離−４゛べき固定成分および菌体細胞との間の濃ｆ史
差が小さいこと、固体成分お３Ｊ−び菌体細胞の月縮＋
’ｌ、および比較的高粘性を有する発酵槽液に多い非二
、、、　−１−ン流動のたと）にきわｙ）で問題点が多
い。
そのため、工業規模の操業においては、経済性に限界が
あＣ）、生物工学のこの分野においてはごく低効率に１
２か達成１．得ないにもかかわらす、固液分離のため、
例えば高性能分離機または濾過装置を使用する濾過およ
び遠心分離のような古典的な方法および装置かいまノ買
ゴΦ用されている。
溶存１．ている高分子量成分を分離するのに好適なりロ
スフ［７−ミク［）濾過に関ｊ７て、例えば懸濁液の濃
縮や乳濁液の分離等、実験室の規模を脱した工業的な応
用例は、現在のところ僅かしか知られていない。
クロスフ［１−ミクロ濾過は、例えばアルカリ性プロテ
アーゼを単離して酵素を人手する場合のように、培養液
または発酵槽液から比較的高粘性計の細胞外有用物質を
分離または単離する用途に工業的な規模で応用すると、
前述の困難に直面ずろこととなる。生物下学のこの応用
分野におけろクロスフローミクロ濾過処理を工業的（こ
実施すると、メンブラン表面に被膜層が生じ、濃度分極
によって有用物質の膜透過性が阻害され、そのために貯
留（有用物質の滞留）が起こり、透過液の流れが制限さ
れる。特に、固体成分含量が比較的高い流体においては
、この被膜層の生成およびメンブラン細孔の目づまりが
きわめて早く、貯留は短時間でほぼ］００％？こ達し、
メンブランは有用物質を透過しなくなる。メンブラン細
孔の台用物質透過性を回復オろためには、本来、連続的
に行なわれろ処理を中断し、浄化措置を挿入しなければ
ならない。
し発明の目的］ ４一 本発明の目的は、生物工学的に製造した細胞外（ｆ用物
質を細胞浮遊液から分離する場合、特にアルカリ性プロ
テアーゼを分離して酵素を人手する場合に、生物工学に
おいて、満足すべき条件下で工業的にクロスフローミク
ロ濾過を可能とオろため、高い比透過率を達成し、それ
と同時に、はぼ０％に近い貯留状態をできるだけ長く持
続することにある。
［発明の構成］ この目的は、ミクロ細孔平均直径が０３〜０゜５７ｚｚ
のポリスルボン製の管を使用し、発酵槽液をメンブラン
表面と平行に３〜６ｍ／秒の流速で流し、濃縮側と透過
側との圧力差を２バールとすることにより、高分子量の
アルカリ性プロテアーゼ、特に２０．００’０ダルトン
以」二の酵素を発酵槽液から分離し、その際、濃縮液中
に残存する微生物の大きさに対ずろメンブラン細孔の平
均直径の割合を０．１５〜０８５とすることにより解決
される。
本発明の方法によって、クロスフローミクロ濾過をＦ業
的に使用−４゛ろこと力荀Ｉ能となろ。即１３、この方
法（ｊ、経済的に許容し得ろ条件下で、フィルターよ）
こはメンブラン表面が一般に１０ｍ２より大きいり〔１
スフローミクＣ１濾過を生物工学的な分離装置に１１１
込むご七を可能とずろ。特に、前記の生物工学的用途に
り［Ｊスフローミクロ濾過を適用する場合、比透過率お
よび貯留率が昔しく収得される。この場合、特に濾材を
ポリスルホンとし、ミクロ細孔の平均直径を０．３〜０
　、５　ｊｔ　ｍとし、流速を３〜６ｍ／秒どし、また
圧力差を２バールとずろ選げれた選択を行なうことによ
って目的が達成される。
クロスフローミクロ濾過技術条件Ｆに組込まれて達成し
得ろ透過流量値および貯留値の点で、ポリスルポンメン
ブランは最も好適である。例えば、テフロンメンブラン
、ポリプロピレン・チコーブメンブランまたは限外濾過
メンブランは、クロスフローミクロ濾過の技術条件下に
おいて不充分な透過流量しか得られず、また短い処理時
間で貯留値が既に５０％以上を示すのに反して、対応す
るポリスルポンメンブランでは、明らかに一層長い処理
時間の間、（Ｊぼ０％に近い貯留値を確保することがで
きろ。
最適な透過流量お、）−び少ない貯留値を達成し得ろ決
定的な条件は、細ｒ（、の平均直径で示されるポリスル
ポンメンブランの孔径分布である。クロスフ〔ノーミク
ロ濾過を前記の用途に大工業規模で適用−４゛ろには、
ミクロ細孔が０．３〜０．５７ｚｇの平均直径を有し、
その場合、濃縮液に残留ずろ微生物の大きさに対するメ
ンブラン細孔の平均直径比が０１５〜０．８５であるこ
とが肝要である。この選び抜かれた０、３〜０．５７ｚ
ｉの平均孔径によってこそ、２４時間までの処理時間で
ほぼ０％に近い貯留値を示すことが保証される。それに
対して、それより小さい平均孔径の場合では、３時間後
に既に生成ずろ被膜層のため、４０％以」ユの貯留値を
示すことが判明した。一層大きいミクロ細孔を選ぶと、
その孔にひっ川かった細菌細胞によって、短い処理時間
で、既に細孔の１ゴづまりを生した。
貯留値が４０％以−」―の高値を示すことはクロスフロ
ーミクロ濾過を経済的に実施するのに好ましくないので
、クロスフローミクロ濾過の際には、通常、必要な浄化
措置を行なう）こめ、本来連続して行なわれろべき操作
を丁度３時間毎に中断オろ必要がある。本発明方法では
、そのような高い貯留値は２４時間後において初めで生
じるので、浄化措置はそれから実施すればよい。このこ
とによって、本発明方法は明らかに高い経済効果を生じ
る。
また、筒状の分離用ポリスルホンメンブラン内の流速は
重要な影響を及ぼず。発酵槽液を流入する際、比較的高
い流速だけが低い貯留値を達成することができ、経済的
に３〜６ｍ／秒の場合だけである。その際に、主な問題
点はメンブラン表面に被覆層を生じることであるが、乱
流比によってのみその発生を回避することができる。筒
状のメンブランでは粘度比が発酵槽液内を支配している
ので、乱流比は高い流速によってのみ到達され、それに
よって、一方ではレイノルズ数か増大し、また一方では
剪断応力が高まることにより、非ニユートン流体の実効
粘度ができるだけ低く保たれる。
処理の行なイつれろ間に、特に一部逆流する発酵槽液ま
たは濃縮液が再濃縮され、それによって結合粘度が」−
昇づ−るので、この乱流比を確保できるのは一般にり［
１スフローミクロ濾過の開始時だけである。一方で、流
速の第３推進力に必要なポンプエネルギーを高め、また
一方で、ポンプ駆動に際して熱の形で発生するエネルギ
ーをふたたび熱交換器を介ｊ７て放出しな（すればなら
ないので、Ｔ業規漠の運用においては、経済性および処
理技術の見地から、流速をいくらでも高ぬるきいうわけ
にはいかない。このような理由で、該ミクロ濾過の用途
分野に属ずろ二「集的な細胞外有用物質の分離において
、筒状の分離用メンブランに適用される最適流速の範囲
は３〜６ｍ／秒である。
本発明方法の実施にｊ−リ、経済的に更に有意義なこと
は、濃縮側と透過側との圧力勾配を２バールとする点で
ある。圧力勾配を２バール以Ｊ−に高めるとポリスルホ
ンメンブランは不可逆的な股の目づまりを起こす。反対
に、圧力勾配を２バールより低く下げろと、透過液流量
の不必要な低下が避けられろ。
好ましい態様と１．て、透過流量比（Ｊ、粒度５００）
１１１以下（１５００１１ｍ）の固体成分０．０５−１
重Ｍ％を添加ずろことによって敗訴される。即ら、例え
は微粉化したセルロース、特に、粒度≦５００７１ｕの
繊維状セル１ノースを０．０５〜１重量％添加すること
により、透過液流量は２〜３倍に土で１−昇する。この
透過液流量の増加は、セル［ノース添加によって発酵槽
液粘度が更に１−昇するにムかかイつらず、特に処理操
作を実施して一定時間後、即ち、一層高い再濃縮の時期
に特に顕著となる。
添加固体成分のこの好ましい作用は、＾し流化をもはや
保持１．得なくなったときに、特に明らかとなる。最ム
好適な添加十４月はセル［１−スである。例えばアルミ
ニウム珪酸ナトリウムまたは水酸化鉄のようなその他の
固体添加材ネ」は、発酵槽液では添加液流用を増加しな
い。
更にまた、界面活性剤を添加４−ろことによって、発酵
槽液の透過液流量および貯留比が都合よく改善される。
本発明の方法のムう一つの態様と１．て、有用物質の富
化のため、クロスフローミク〔ｌ濾過の後に限外濾過装
置を配設した設（ｎＮを提９１；する。接続１゜た限外
濾過装置では通常のメンブランを使用し、それによ−）
で有用物質を捕集し、残りの透過液成分、例えば水、塩
類、低分子物質のような成分を通過させ、従って該限外
濾過装置において、透過液に溶存している有用物質は有
利に富化され、再濃縮される。このように、クロスフ〔
Ｊ−ミク（１ａ過と限外濾過（ｊ経済的にコス）・を低
減し得ろ連動処理方法を構成する。
アルカリ性プ［ｌテアーセのり〔１スフローミクロ濾過
を行なう場合、一層高い貯留値を達成するため、発酵槽
液のｐＩｌ値を６．２〜７．２に調節ずろことが得策で
ある。ｐＩｒ値を更に高く−１ろとアルカリ性ブ［Ｊテ
アーゼの酵素活性およびその粘度は、それたＩＪツに有
利となるが、但し、ｐｈｉ値を７２以」−に高めろこと
は、貯留値をたちまち好ましくない高値に上昇するので
不可である。
本発明（」また、アノ化物、特にアジ化ナトリウムの仔
（Ｆ下、および塩化ナトリウムの存在下に、５５℃の７
１．に度で、なお発育可能な細菌培養から酵素を分離す
る工業規模で経済的なりロスフ「ノーミクロ濾過の方法
を提供する。
添付図面により、本発明の具体的な態様例について更に
詳細に説明を行なう。
第１図は、培養液または発酵槽液から細胞外含有成分を
分離し、ｍ離するたぬのクロスフローミクロ濾過の原理
を示しており、 第２図は、クロスフローミクロ濾過装置の１例の流れ図
である。
生物工学的に製造した細胞外有用物質をクロスフローミ
クロ濾過によって細胞浮遊液から分離する本発明方法の
原理は、筒状の分離装置ｌを使用ずろことにある。筒状
の分離装置１は支持管２によって構成され、この支持管
２にはポリエステルから成る送液管３がはぬ込まれてい
る。送液管３の筒本体の内側表面には、分離機能を備え
た厚さ約５０〜ｌ００７１ｍのポリスルポン製メンブラ
ン層（分離メンブラン層）４が取り付けである。この筒
状分離装置ｌの直径は５〜！５ｍｍである。
培養液または発酵槽液５は、分離メンブラン層４を通っ
て矢印の方向に３〜６ｍ／秒の流速で誘導され、ここに
おいて有用物質は分離メンブラン層４を放射線状に透過
し、一方、細胞、細胞断片および固体成分は分離メンブ
ラン層４によって捕集される。液状の濃縮液６および液
状の透過液７が生成し、濃縮液６には細胞、細胞断片、
固体成分が含まれ、透過液７には分離された有用物質が
存在する。発酵槽液５およびそれに溶存している有用物
質の流体が分離メンブラン層４を通過するための推進力
として、圧力勾配が作動する。濃縮側と透過側との平均
圧力勾配は平均２バールである。透過側では、日周的な
気圧および流出開口部の地理的高度によって支配される
。ポリスルホン製の分離メンブラン４は平均孔径０３〜
０．５１１ｍのミクロ細孔を有する。濃縮液６に残存し
、培養液または発酵槽液５とともに誘導されて来た微生
物類、特にアジ化す）・リウムの存在および塩化ナトリ
ウムの存在下においても約５５℃の温度で発育可能な細
菌培養の菌体の大きさに対ずろメンブラン４のこの＼［
均孔径の割合ｔ、ｉｎ　　１５〜０８５である。
分離した透過液において、特にアルカリ性ブ「Ｊテアー
ゼの場合、得られろ有用物質は２０，０００ダルトンよ
り大きい分子量を有４−ろ酵素と１２で示される。
筒状の分離装置１は、第２図に示した本発明方法のクロ
スフｏ　−ミク〔１濾過装置の簡易流れ図の要部に配設
されている。ここにおいて、発酵槽液５は導管８を通っ
て加熱可能な貯蔵容器９へ誘導され、導管１０にあるポ
ンプ１２お、Ｊ−び導管１１にあろポンプ１２ａの働き
によって、容器９から導管ＩＯおよび１１を通過して筒
状の分離装置１へ到達する。相げに接続している３乱の
筒状の分離装置１は分離段階を構成づ−る。３基の筒状
の分離装置１のそれぞれにおいて、培養液または発酵槽
液５は濃縮液６および透過液７に分離され、その際、濃
縮液は導管を介してそれぞれ次の装置ｌに送られ、ある
いは最後の装置１から導管１３を通って、大部分（Ｊ流
入導管１１へ還元され、一方、透過液は各分離装置１か
ら流出導管１４へと流出する。濃縮液６の１部は少楕づ
つ分岐ｉｓ管１３ａおよび導管８へ送られ、容器９へ還
流される。このために、ポンプ１２ａのポンプ駆動を、
ポンプ１２と対応してそれよりも高くなるように調節す
る。
更にもう１つの態様として、有用物質を富化するために
、透過液７を流出導管１４から、例えば限外濾過膜（１
１ｊのような調製設備へと誘導するように配設すること
ができろ。
また、導出導管１４の分岐点から透過液を、所望により
中間に集合受器を接続Ｗろことによって、導管１０また
はＩＩへ供給し、ふたたび精製工程を反復ずろことがで
きろ。その間、貯蔵容器９がらの発酵槽液の供給は停止
１−される。
クロスフローミクロ濾過処理を実施するに当たって、分
離装置１から成る分離段階は当然１段階以上設置してよ
く、また、分離装置１は当然３個以」−相互に接続でき
るのは自明のことである。また、１５一 本方法において、貯蔵容器９の使用は１個に限定される
ものではない。
特に、濃縮液６を、例えば水で抽出し、また透過液で到
達１．ｋｌＦｉＬ流比を調流化ろために、液体の追加を
目的とするバッチ式透析濾過を組合わせたクロスフ［１
−ミクロ濾過を行なうことが可能である。また、筒状の
分離装置１の形状に関連して示したその直径範囲は、必
ずしも５〜１５ｍｍに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、クロスフローミク［１濾過の原理を示す略図
、第２図は、クロスフローミクロ濾過装置の流れ図であ
る。 １・・・分離装置、２・・支持管、３　・送液管、４メ
ンブラン層、５・・発酵槽液、６　濃縮液、７　・透過
液、８・・導管、９・・・貯蔵容器、Ｉｎ、Ｉ　１．１
３　・導管、１２．１２ａ・ポンプ、１４・・・流出導
管。 特許出願人　ヘンケル・コマンデイットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン ほか１名 代　理　人　弁理士　青白　葆　ほか２名−１６＝ ＦＩＧ、２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、０．１μｍより大きいミクロ細孔を有する多孔質ポ
    リマー管をメンブランとして使用し、毎秒２ｍより大き
    い流速で発酵槽液をこれに流通し、この際、濃縮側およ
    び透過側の間を５バールより小さい圧力差で支配するこ
    とによって実施されるクロスフローミクロ濾過によって
    生物工学的に製造した有用物質を細胞浮遊液から分離す
    る方法であって、該クロスフローミクロ濾過が、ミクロ
    細孔平均直径０．３〜０．５μｍのポリスルホン製の管
    を使用し、発酵槽液をメンブラン表面と平行に３〜６ｍ
    ／秒の流速で流し、濃縮側と透過側との圧力差を２バー
    ルとすることにより、高分子量のアルカリ性プロテアー
    ゼ、特に２０，０００ダルトン以上の酵素を発酵槽液か
    ら分離し、その際、濃縮液中に残存する微生物の大きさ
    に対するメンブラン細孔の平均直径の割合を０．１５〜
    ０．８５とすることから成る生物工学的に製造した有用
    物質を細胞浮遊液から分離する方法。 ２、粒度５００μｍ以下の固体成分０．０５〜１重量％
    を添加する第１項に記載の方法。 ３、界面活性剤を添加する第１項または第２項に記載の
    方法。 ４、有用物質の富化のために限外濾過をクロスフローミ
    クロ濾過の後に配設する第１〜３項のいずれかに記載の
    方法。 ５、発酵槽液のｐＨ値を６．２〜７．２に調節する第１
    〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、アジ化物、特にアジ化ナトリウムの存在下、および
    塩化ナトリウムの存在下に、５５℃の温度でなお発育能
    を有する細菌培養から酵素分離を行なう第１〜５項のい
    ずれかに記載の方法。
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