JPS62275690A - Ｌ−ロイシンとｌ−イソロイシンの分離法 - Google Patents

Ｌ−ロイシンとｌ−イソロイシンの分離法

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JPS62275690A
JPS62275690A JP62082786A JP8278687A JPS62275690A JP S62275690 A JPS62275690 A JP S62275690A JP 62082786 A JP62082786 A JP 62082786A JP 8278687 A JP8278687 A JP 8278687A JP S62275690 A JPS62275690 A JP S62275690A
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leucine
ester
isoleucine
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hydrolysis
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JP62082786A
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クリス・バルト・デ・ロース
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PFW Beheer BV
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/38—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

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  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明〕 本発明は蛋白質の加水分解物からＬ−ロイシン及びＬ−
イソロイシンを単離する方法に関する。
更に詳しくは、本発明はロイシン、イソロイシン及びバ
リンのエステルの混合物におけるロイシンエステルのエ
ステラーゼによる選択的触媒加水分解で前記アミノ酸の
混合物からＬ−ロイシンを分離する方法に関する。
ロイシンとイソロイシンは極めてよく似た化学的、物理
的性質を持つ異性体である。従って、それらの分離は非
常に困難である。イソロイシンからロイシンを分離する
最も初期の方法の１つは両アミノ酸の銅錯体が持つ異な
る溶解度を利用するものである〔エフ・エールリッヒ（
Ｆ、　Ｅｈｒｌｉｃｈ　）のＢｅｒ、３７．１８０９　
（１９０４）；　　ビー・ニーーｖ−ペン（Ｐ、Ａ、　
Ｌｅｖｅｎｅ　）及びダブリュー・ニー・ヤコボ（Ｗ、
Ａ、　Ｊａｃｏｂｏ　）のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ　ｒ９
，２３１　（１９０８）；ビーφヒルシュブルーナ（Ｐ
、Ｈｉｒｓｈｂｒｕｎｎｅｒ　）　　及びアール・ベル
ソレット（Ｒ，Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ　）　（−ｒツギ−
Ａ、Ｇ、社（Ｍａｇｇｉ　Ａ、Ｇ、　）　）の西独特許
公開公報第２．４１７，３７５号（１９７５）：）。ロ
イシンのコバルト錯体とイソロイシンのコバルト錯体は
同様の方法で分離することができる〔ケー・ハヤシ（Ｋ
、　Ｈａｙａｓｈｉ　）及びティー・ヒノ（Ｔ、Ｈｉｎ
ｏ）、味の素株式会社、日本、１５，１１８（１９６２
））。
両方法には両アミノ酸、母液及び廃水から金属塩を定量
的に除去しなければならな暦といったような重大な欠陥
がある。
ロイシンとイソロイシンとはまた芳香族スルホン酸によ
る選択沈殿で分離することができる。例エバ、ロイシン
はベンゼンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸〔シ
ー・ホンゴー（Ｃ，Ｈｏｎｇｏ　）等のＪ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　２９
゜１４５（１９７９））、ナフタレン−２−スルホン酸
〔エム争バーグー７７　（Ｍ、　Ｂｅｒｇｍａｎｎ　）
及びダブりニー・エーチφステーン（Ｗ、　Ｈ，Ｓ　ｔ
ｅｉｎ　）のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１２９．６０
９（１９３９）　：アール・ディー・ホッチキス（Ｒ，
Ｄ、　Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ）のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　１４１．１７１（１９４１）　；ディーのダブリュ
ー　＊　ト−マス（Ｄ、Ｗ、　Ｔｈｏｍａｓ　）及びシ
ーｅ　＝　−マン（Ｃ，Ｎｉｅｍａｎｎ　）のＪ、Ｂｉ
ｏｌ。
Ｃｈｅｍ、１７５，２４１（１９４８））又は２−ブｏ
モトルエンー５−スルホン酸〔タフリュー・エーチΦス
テーンのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１４３．１２１（
１９４２））による選択沈殿で、またイソロイシンはｐ
−トルエンスルホン酸〔ティー争エム・ヘゲステッド（
Ｄ、　Ｍ、　Ｈｅｇｓｔｅｄ　）及びイ一番ディー・ワ
ードウェル（Ｅ、Ｄ、Ｗａｒｄｗｅｌｌ　：）のＪ、Ｂ
Ｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　１５３．１６７　（１９４４）　）又は２
−ナフトール−６−スルホン酸（アイ・シパタ（Ｉ　、
　Ｃｈ　１ｂａｔａ〕等の特開昭４８−１０３５１５　
（１９７３）（田辺製薬株式会社）〕による沈殿で単離
することができる。沈殿物は再結晶を繰り返して精製し
なければならない。特別の問題は最終生成物から往々に
し℃有毒なスルホネートを完全に除去しなければならな
いという点である。
ソ連の研究者はＬ−ロイシンをＬ−イソロイシンから分
離するのに色々なエステル化速度を用いて（する〔アイ
・カルニンス（１，Ｋａｌｎｉｎｓ　）等のｐｒｉｋｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、　１７．
８９６（１９８１）　：　Ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒ、　９
６．１４３２８７（１９８２）］。この方法によりＬ−
ロイシンとＬ−イソロイシンの混合物をエタノール中、
６０°Ｃにおいて１時間塩化チオニルで処理するとＬ−
ロイシンエチルエステルと遊離のイノロイシンの混合物
が得られた。中和と結晶化で純粋な形のし一イソロイシ
ンが得られた。そのｐ液をベンゼンで抽出し、抽出され
たＬ−ロイシンエステルを加水分解して純粋なＬ−ロイ
シンを得た。純粋なＬ−ロイシンとＬ−イソロイシンの
収率は８０〜８５％であるとされている。本発明者の研
究によると、しかしこの方法で得られる収率はエステル
化の選択性がかなり悪いことから上記の値より相当ニ低
かった〔ニス・ビー・コンパナ・フィロ−（Ｓ、Ｐ、Ｃ
ｏｍｐａｎａ　Ｆｉｌｈｏ　）及びジー命ガイヒス（Ｇ
、　Ｇｕｉｂｂｉａ　）のＦ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｌ
　、　２３６．１９７（１９８２）も参照されたい〕０ 更に、この方法には濃混合物にバリンが存在するとＬ−
イソロイシンを純粋な形で単離するのが困難であるとい
う欠点がある。
欧州特許出願ＥＰ第２２，８８０号から、ロイシン、イ
ソロイシン及びバリンの混合物からｐＨ１，５〜２．０
における沈殿でロイシンを単離することができることが
知られている。残った母液から、濃塩酸からの結晶化で
Ｌ−イソロイシン塩酸塩を単離することができる。しか
し、この方法で製剤用に十分に高い純度のＬ−ロイシン
及びＬ−イソロイシンを高収率で得ることはできない。
欧州特許出願ＥＰ第２６，８３２号にはロイシンとイソ
ロイシンの混合物の溶液を無水の有機溶剤中で濃塩酸で
処理することによってそのアミノ酸混合物からイソロイ
シンを単離する方法が記載されている。イソロイシンは
塩酸塩として沈殿する。
十分に純粋な生成物を得るためには塩酸による沈殿を繰
り返し行わなければならない。
最後に、ドイツ特許ＤＥ第３，３１８，９３３号Ｃｌに
はＬ−ロイシンとＬ−イソロイシンを分離する酵素法が
記載される。この方法において、両アミノ酸は非ラセミ
化条件の下でアセチル化され、得られたＮ−アセチル−
Ｌ−ロイシンとＮ−アセチル−Ｌ−イソロイシンの混合
物は触媒量のＣＯ２＋の存在下で豚腎のアミノアシラー
ゼにより処理される。この処理でＮ−アセチル−Ｌ−ロ
イシンのＬ−ロイシンへの選択加水分解が起る。Ｌ−ロ
イシンは反応混合物から結晶化し、純粋な形で戸別され
る。Ｐ液中のＮ−アセチル−Ｌ−イソロイシンは塩酸で
加水分解され、得られたし一イソロイシンは分別結晶化
で集められる。この方法には比較的高価な酵素を使用す
る必要があるという欠点がある。更に、この方法では蛋
白質の加水分解物カラのロイシン／イソロイシン画分に
しばしば存在する２種の疎水性アミノ酸であるバリンと
フェニルアラニンからロイシンとイソロイシンヲ分離す
ることはできない。
本発明の方法は（イ）Ｌ−ロイシンとＬ−イソロイシン
を含有する混合物をアルコールでエステル化し、（ロ）
その混合物のエマルジョン又は溶液をエステラーゼ活性
を有する酵素又は酵素コンプレックスで処理してＬ−ロ
イシンエステルを選択的に加水分解し、そして（ハ）か
くして得られた混合物からＬ−ロイシン及び／又はＬ−
イソロイシンエステルを回収する工程から成る。
出発アミノ酸混合物の複雑さに応じて、酵素による加水
分解に先き立って精製が必要になるかもしれない。酵素
加水分解に付されるアミノ酸エステル混合物はロイシン
エステル、イソロイシンエステル及びバリンエステル以
外のエステルを実質的な量で含まないのが好ましい。
Ｄ−及びＬ−アミノ酸エステル類の混合物中のＬ−アミ
ノ酸エステルをエナンチオ選択（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌ
ｅｃｔｉｖｅ）加水分解するのにエステラーゼを使用す
ることは文献で周知である。〔例えば、オー・ワーバー
グ（０，Ｗａｒｂｕｒｇ　）のＺ。
Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　４８．２０５　（１９
０６）及びアイ・ニー・ヤムス−ｒ　７　（１，Ａ、　
Ｙａｍｓｋｏｖ　）等のｐｎｚｙｍｅ　　Ｍｉｃｒｏｂ
、　　Ｔｅｃｈｎｏｌ、３，１４１　（１９８１）を参
照されたい０〕これは影響を受けないＤ−アミノ酸エス
テルから生成Ｌ−アミノ酸を簡単に分離するのを可能に
する。しかし、ロイシンとイソロイノンのような構造異
性体の分離にエステラーゼを使用することはこれまでな
かった。
本発明による疎水性アミノ酸混合物からＬ　−ロイシン
を分離する方法はＬ−ロイシン及びＬ−イソロイシ／を
含むアミノ酸混合物を用意し、そのアミノ酸混合物をア
ルコールでエステル化してＬ−ロイシンエステル及びＬ
−イソロイシンエステ群から選ばれる酵素剤でそのエス
テル混合物を処理することによってＬ−ロイシンエステ
ルを選択的に加水分解してＬ−ロイシン及びＬ−イソロ
イシンエステルを含む加水分解混合物を形成し、その加
水分解混合物からそのＬ−ロイシンを分離して精製され
たＬ　−ロイシンを形成する工程を含む。
本発明の方法によりロイシン及びイソロイシンを単離す
るのに適当な出発物質は多くの供給源から得ることがで
きる。魅力的な低価格の出発物質は市販の粗製ロイシン
、所謂蛋白質の加水分解物からのロイシン両分であって
、これはロイシン及びイソロイシンと少量の他のアミノ
酸の混合物から成る。
事実、ロイシン及びイソロイシンを妥当な収率で回収す
るのを可能にするように十分に高いロイシン及びイソロ
イシン含量を有する蛋白質の加水分解物は全てＬ−ロイ
シン及びＬ−イソロイシンを単離するための出発物質と
して役立つ。ロイシンとイソロイシンの総含量は加水分
解物中の全アミノ酸量に対して少なくとも１０％である
ことが望ましい。
疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン、フ
ェニルアラニン及び／又はチロシン）ノ混合物は沈殿及
び抽出で容易に蛋白質加水分解物から分離することがで
きる。例えば、蛋白質加水分解物からその疎水性アミノ
酸を分離する効果的な方法は加水分解物の水溶液をｐＨ
２未満においてアルコール、例えばｎ−ブタノール又は
インブタノールにより向流抽出することから成る。
アミノ酸混合物のエステル化はこの技術分野で周知の方
法で行うことができる。例えば、アミノ酸混合物は適当
なアルコール中で塩化チオニル又は塩化水素と共に還流
することによってエステル化することができる。アミノ
酸混合物が蛋白質加水分解物の溶液の水と非相溶性（ｎ
ｏｎｗａｔｅｒ　−ｍｉｓｃｉｂｌｅ　）のアルコール
によるｐ）（２未満における抽出で得られるものである
場合、エステルは抽出物を加熱することによって得られ
る。その場合、エステル化速度を上げるために追加量の
アルコールを加え、同時にエステル化を完結させるため
にヘテロアゼオドロープ（ｈｅｔｅｒｏａｚｅｏｔｒｏ
ｐｅ）蒸留で水を連続除去するのが好ましい。
出発物質が疎水性アミノ酸の複雑な混合物である場合、
得られるアミノ酸エステル混合物には精製が必要になる
かもしれない。この精製は真空下でのフラッシュ蒸留で
行うのが好ましい。この蒸留でバリン、ロイ７ン及びイ
ソロイシンの各エステルを含有する留出液とフェニルア
ラニン及びチロシンの両エステルを含有する残液が得ら
れる。
アミノ酸エステルの熱で誘発される分解を回避するには
蒸留を、例えばフィルムエバポレーター（ｆｉｌｍ　ｅ
ｖａｐｏｒａｔｏｒ　）を用いて連続式で行うのが好ま
しい。
合計３０〜１００％のロイシンエステルとイソロイシン
エステルを含有するアミノ酸エステル混合物を次にエス
テラーゼにより触媒する加水分解に供してＬ−ロイシン
エステルの選択的加水分解を行う。
加水分解は次のようにして行う。すなわち、エステル混
合物５〜５０チの水エマルジョンを調製し、このエマル
ジョンのｐＨを塩酸溶液又は水酸化ナトリウム溶液の添
加でＩ）Ｈ５〜１ｏに調整する。中性又は酸媒体中では
、清澄な溶液が通常得られる。清澄な溶液が得られる正
確なｐＨはエステルの性状及びそれらの反応混合物中濃
度に依存する。例えば、エチルエステルに関してはｐＨ
約８ですでに清澄な２０％溶液が得られるが、ブチルエ
ステルに関してはそのエステルを完全に溶解させるには
ｐＨを約７まで下げなければならない。
ロイシンエステルの加水分解は一５〜６０℃の温度にお
いて、酵素が高活性を示すｐＨ範囲で行うのが好ましい
。反応温度と酵素の使用量及び活性に依存してロイシン
エステルを５０〜９５１ｍ水分解する所要時間は１時間
未満から２４時間以上にわたって変わるだろう。
本発明において、用語番エステラーゼはカルボン酸エス
テルの加水分解を触媒し得る酵素に対して使用される。
用語・エステラーゼはかなり非特異性のものを意味し、
グロテナーゼ及びリパーゼを含めて広範囲の酵素をカバ
ーする。イソロイシンエステルと混合されているロイジ
ノエステルの加水分解に好ましいエステラーゼは、例え
ばトリプシン、キモトリフ゛シン、サフ゛チリシンカー
ルスペルグ（５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｃａｒｌｓｂｅｒ
ｇ　）　　（サブチリシンＡ、アルカラーゼノボ［Ａｌ
ｃａｌａｓｅ　Ｎｏｖｏ］）、サブチリ７ンノボ（５ｕ
ｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｎｏｖｏ　）、エスペラーゼノボ（
Ｅｓｐｅｒａｓｅ　Ｎｏｖａ　　）及んプロナーゼ（Ｐ
ｒｏｎａｓｅ　）のごとき所謂セリンプロテナーゼで、
それらが高い活性と選択性を持っているからである。し
かし、エステラーゼ活性を持つ他の酵素、例えばノポイ
ンダス１Ｊ−Ａ／Ｓ社（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ
／Ｓ　）の実験上のリパーゼ製剤５ｐ２２５も使用する
ことができる。
酵素は精製された形で、又は粗製酵素製剤の形で使用さ
れる。更に、遊離の天然形又は固定化された形の酵素を
使用することも可能である。酵素は、例えば固体支佇体
に対する結合、半透過性ポリマーゲルへの閉じ込み、又
は酵素ＭＩＪアクター中への収納で固定化することがで
きる。置屋化には酵素が容易に再使用することができ、
酵素のコストを低減するという利点がある。更に、固に
化は加水分解を連続式で行うのを可能にする。
ロイシンエステルの加水分解を触媒するのにエステラー
ゼを産生ずる生きている微生物を使用することも可能で
ある。微生物は遊離形でも、あるいは固定化された形で
も使用することができる。
加水分解はロイ７ンエステルの元の量の７０〜１００係
がＩ、−ｏイシンに転化された時に通常上められる。加
水分解の過程はガスクロマトグラフィーで残留エステル
分を分析するか、又は高性能の液体クロマトグラフィー
で放出アミノ酸を定量することによってモニターするこ
とができる。
Ｌ−ロイシンは反応混合物からそのＰＩ（を８〜１０に
調整し、非加水分解エステルを、例えば塩化メチレン、
メチルｔ−ブチルエーテル、トルエン又は水と非相溶性
の揮発性アルコールのような有機溶剤で抽出することに
よって単離するのが有利である。その水性溶液を次にｐ
Ｈ６まで中和し、濃縮する。分離した結晶性り一ロイシ
ンをｐ過又は遠心分離で集める。非ｐＨ調整反応混合物
から［、−ｏイシンは有機溶剤で沈殿し、及び／又は真
空共沸蒸留により水及び非加水分解アミノ酸エステルを
除去することによって単離することもできる。残ったエ
ステル分からのイソロイシンエステルの単離はそのエス
テル分の組成に依存する。エステル分が実質的量のバリ
ンエステルを含有している場合、エステル類をまず効率
的な蒸留カラムによる真空蒸留で分離する。はとんどの
他のアミノ酸エステルと対照的に、イソロイシンエステ
ルとバリンエステルは極めて安定で、従って目につくよ
うな分解なしで真空蒸留により精製することができる。
イソロイシンエステルはこの技術分野において周知の方
法で加水分解することができる。例えば、イソロイシン
エステルは水又は稀酸水溶液中で還流するか、あるいは
昇温下でアンモニア又は水酸化す）　ＩＪウム若しくは
水酸化カリウム溶液で処理することによって加水分解す
ることができる。水又はアンモニアによる加水分解には
塩を含まないイソロイシンの溶液が生成し、従って結晶
化によりほとんど定量的なＬ−イソロインの回収が可能
になるという利点がある。
Ｌ−バリンニステルハイソロイシンエステルの精製の純
粋な副生成物として通常得られ、同様に加水分解するこ
とができ、結晶化で純粋なＬ−バリンを生成させる。
本発明の方法はＬ−ロイシンとＬ−イソロイシンの他の
分離法を越える重要な利点を有する。すなわち、（イ）
蛋白質の加水分解中にはＬ−ロイシンのラセミ化が一部
起る。これらの加水分解物から本発明の方法を用いてロ
イシンを回収するとき、本発明で使用される酵素はＤ一
体及びＬ一体の両者を含有する混合物中のＬ−ロイシン
エステルの加水分解を選択的に触媒するので光学的に純
粋なＬ−ロイシンが通常得られる。（Ｏ）アミノ酸エス
テルの酵素触媒作用加水分解はアミノ酸の構造に対して
極めて選択性があり、従ってロイシンはイソロイシンか
らきれいに分離される。Ｇ−）　Ｎ−アセチル−し−ア
ミノ酸のアシラーゼ触媒作用分離に比較して、アミノ酸
エステルのエステラーゼ触媒作用分離には材料及び酵素
のコストが一層低いという利点がある。本発明の方法に
よれば、洗剤に大規模に応用するために開発された、例
えばアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ　）　２．４　Ｌ
又はエスペラーゼ（ｐｓｐｅｒａｓｅ　）　８．　ＯＬ
　（両者共ノボインダスト１）−Ａ／Ｓ社製）のような
非常に安価な酵素が好ましく使用される。（ニ）本発明
の方法にはロイシン及びイソロイシンの回収に加えて最
少限の努力でバリン、フェニルアラニン及びチロシンも
単離できるという利点がある。これはこれらアミノ酸の
エステルの分離が蒸留で行えるということによる。蛋白
質の加水分解物から単離された粗製ロイシン分は相当の
量の他の疎水性アミノ酸を含有していることが往々にし
であるので、上記のことは実際には重要な利点である。
（ホ）それらの単離に含まれる蒸留工程と溶剤抽出工程
に基因して回収されたアミノ酸は重金属汚染物を実際上
含んでいない０ 単離されたアミノ酸の純度は高性能液体クロマトグラフ
ィーで、又は揮発性誘導体（エステルか、又はトリフル
オロアセチル化エステル）のガスクロマトグラフ分析で
コントロールした。単離されたアミノ酸の光学的な純度
はアミノ酸の稀薄塩酸溶液の比旋光度を測定することに
よって、又は偏光性固定相（ｃｈｉｒａｌ　５ｔａｔｉ
ｏｎａｒｙ　ｐｈａｓｅ）に対する高性能液体クロマト
グラフィーで廼量した。
実施例１ 乾燥イソブタノール中Ｈｃｌ！　３Ｍの液体１．２５０
−中のＬ−ロイシン（２０ｇ）、Ｌ−イソロイシン（４
０ｇ）及びＬ−バリン（４０ｇ）の混合物を効率的な蒸
留カラムを介して反応容器に接続された共沸蒸留カラム
ヘッドを使用して水を連続除去しつつ６時間還流させた
。冷却後、氷を加え、そして激しくかき混ぜながら３３
％水酸化ナトリウム溶液を連続添加することによってｐ
Ｈ９に調整した。全アミノ酸エステルの約９９％を含有
する有機相を水性相から分離し、２００ｍｍＨＦで濃縮
してロイシンインブチルエステル２６．８！ｉ、イソロ
イシンインブチルエステル５１゜４ｇ及びバリンイソブ
チルエステル５５．０ｇを含有する油状残分１３８ｇを
得た。
イゾブチルエステルの混合物に４００ｇの水を加え、そ
の混合物を激しくかき混ぜた。得られたエマルジョンを
濃塩酸を添加してｐＨ８に調整した。アルカラーゼ２．
４Ｌ（ノボインダストリーＡ／Ｓ社；１．００ｇ）を加
え、その反応混合物の総重量を水を添加して６７０りに
した。その混合物を次に室温で４時間かき混ぜた。その
間にロイシンエステルの８９チが加水分解された。次い
で、この反応混合物にｐＨが９になるまで水酸化ナトリ
ウム溶液を加え、加水分解されなかったエステルをメチ
ルｔ−ブチルエーテル（２Ｘ２００ｉ）による抽出で反
応混合物から除去した。その水性相をｐＨ６に中和し、
そして無色の結晶の濃い懸濁液が分離されるまで真空下
で濃縮した。この懸濁液を冷却しく氷水）、濾過して結
晶性物質を集めた。母液を濃縮すると第２の結晶性物質
が得られた。両両分を合せて再結晶すると、得られた純
り一ロイシンの総収量は１４．８ｇで、これはエステル
から回収できる最大アミノ酸量の７９係である０ アミノ酸分析による純度　：１００％ ＨＰＬＣによる光学的純度：１００％ 実施例２ １．００９のアルカラーゼ２．４Ｌの代りに１，７５ｇ
の同アルカラーゼを用いた点を除いて実施例１を繰り返
した。室温で４時間後、ロイシンエステル０９４％が加
水分解された。
実施例３ 等量のロイシンイソブチルエステル、イソロイシンイソ
ブチルエステル及びバリンイソブチルエステルの混合物
（１００Ｌ）を４００ｇの水に加え、激しくかきまぜて
微細に分散されたエマルジョンを得た。アルカラーゼ０
．６Ｌ（３，０ｇ）を加え、その混合物を室温で４時間
かき混ぜた。その時間後にロイシンエステルの８９％が
加水分解された。そのとき、バリンエステルの加水分解
率は０．１１１、イソロイシンエステルのそれは０１２
％未満に過ぎなかった。インフリノール（５０ａ／）を
加え、沈殿したＬ−ロイシンを濾過で集めた。ｐ液の２
つの相を分離し、そして溶解したイソブタノールとアミ
ノ酸エステルを共沸蒸留で除去するために水性相を真空
下（５０ｍｍ）で濃縮した。濃縮中にＬ−０イシンの無
色の結晶が分離した０結晶性物質は３回の分離操作で集
められた。純し−ロイシンの総収量は１９．１９．すな
わちエステルから回収可能の全アミノ酸量の８２チであ
った。
〔α〕舌０二＋１５°（Ｃ＝２，５ＮＨＣＪ）実施例４ 酵素加水分解をｐＨ７，２で行った点を除いて実施例３
を繰り返した。このｐＨにおいてエステルは完全に溶解
された。室温で４時間後、ロイシンイソブチルエステル
の８８係が加水分解された。
バリンエステルは１．１多加水分解され、またイソロイ
シンイソブチルエステルは０．２５％加水分解された。
実施例５ アルカラーゼ０．６Ｌの代りにエスペラーゼ８、ＯＬ（
ノボインダストリーＡ／Ｓ社）を用いた点を除いて実施
例４を繰り返した。室温で４時間後、ロイシンイソブチ
ルエステルの８６％が加水分解された。バリンエステル
は４０％、イソロイシンエステルは０．６４％加水分解
された。
実施例６ 等量の新しく製造したロイシンｎ−ブチルエステル、イ
ソロイシンｎ−ブチルエステル及びバリンｎ−ブチルエ
ステルの混合物（総重量５ｇ）を１９．８５ｇの水に加
え、激しくかき混ぜて微細に分散したエマルジョンを得
た。アルカラーゼ０．６Ｌ（０，１５５ｉ）を加え、そ
の混合物を室温で更に４時間かき混ぜた。その時間後に
ロイシンエステルの約６８係が加水分解された。バリン
エステルは１．１％、イソロイシンエステルは０．１係
未満加水分解された。アンモニアを加えてそのｐＨを９
〜９．５に調整し、非加水分解エステルをメチルｔ−ブ
チルエーテルで抽出した。アンモニア、溶解した有機溶
剤及びアミノ酸エステルを共沸蒸留で除去するために水
性相を真空下（５０ｍｍ）で濃縮した。濃縮中にＬ−０
イシンの無色の結晶が分離した。水性相からのＬ　−ロ
イシンの回収はほとんど定量的であった。
実施レリ７ ０．１５９のアルカラーゼ０．６Ｌの代りに１部ｍｙの
プロナーゼＥ　（ｐｒｏｎａｓｅ　Ｅ　）　（シグマケ
ミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）〕
を用いた点を除いて実施例６を繰り返した。室温で４時
間かき混ぜり後、ロイシンｎ−ブチルエステルの８９チ
が加水分解された。イソロイシンエステルは１．６係、
バリンエステルは０．１１未満加水分解された。
実施例８ エステル化のためにインブタノールの代りに二級ブタノ
ールを用いた点を除いて実施例１を繰り返した。エステ
ル化の収量は１２０ｇであった。
ロイシン二級ブチルエステルの酵素加水分解は対応する
イソブチルエステルの加水分解よりはるかに遅かった。
室温で２４時間後に、ロイシンエステルの５９チが加水
分解された：すなわち、一方の異性体の加水分解率は７
５チで、他方のそれは４４％であった（エステル化にラ
セミ体の二級ブタノールを用いたので、各Ｌ−アミノ酸
について２種の異性体エステルが得られた。） 実施例９ Ｌ−ロイシン（５０１及びＬ−イソロイシン（５０１０
２Ｍメタノール性ＨＣ１！１，２５０ｉ中混合物を１０
時間還流させた。冷却後、氷を加え、そして３３％水酸
化ナトリウム溶液を注意深く添加してそのｐＨを９に調
整した。メチルエステルをその水溶液から塩化メチレン
（３Ｘ３００ｄ）による抽出で回収した。抽出物を合せ
、減圧下で濃縮してＬ−ロイシンメチルエステルとＬ−
インロイ７ノメチルエステルの混合物７５ｇを得た。そ
の酵素加水分解を実施例１に記載される通り行った。イ
ソブチルエステルとは対照的にメチルエステルはｐＨ８
で完全に溶解された。室温で４時間かき混ぜ後、ロイシ
ンエステルは９９チ以上加水分解された。エステルから
のＬ−ロイシンの回収は９０％以上であった。
実施例１０ 実施例９を繰り返した。但し、メタノールの代りに無水
エタノールをエステル化のために用いた。
室温で４時間かき混ぜ後にロイシンエチルエステルの酵
素加水分解は完結した（すなわち、９９％以上が加水分
解されていた）。
実施例１１ ケラチン加水分解物のｐＨ２における向流抽出で得られ
た疎水性アミノ酸のインブタノール溶液を常圧蒸留で乾
燥物質含量１０％まで濃縮Ｉ−だ。
濃塩酸を加え（抽出物２０部に対して１部）、その溶液
を約２５チの乾燥物質含量まで更に濃縮した。エステル
化を完結させるために、効果的な蒸留カラムを介して反
応容器に接続された共沸カラムヘッドを使用して水を連
続除去しながら加熱を６時間続けた。
冷却後、氷を加え、そして激しくかき混ぜながら水酸化
ナトリウム溶液を連続添加してｐＨ９に調整した。疎水
性アミノ酸エステルの約９９係を含有する有機相を水性
相から分離し、２００　ｍｍＨｇで濃縮した。残分をフ
ラッシュ蒸留に付してバリン、ロイシン及びイソロイシ
ンのニス７−ル類（Ｗ出液）ヲフェニルアラニン及びチ
ロシンのエステル類（残分）から分離した。
留出液ははソ次の組成を有していた： ロイシンイソブチルエステル　　　３３％イソロイシン
イソブチルエステル　２１φバリンインブチルエステル
　　　　３３チプロリンインブチルエステル　　　　５
係その他の少量成分　　　　　　　　　８％激しくかき
まぜられている、上記アミノ酸エステル混合物１００ｇ
の水３００ｇ中エマルジョンに清澄な溶液が得られるま
で濃塩酸を加えた。溶液のｐＨはそのとき７，２であっ
た。アルカラーゼ２．４Ｌ（０，７５ｇ）を加え、そし
て水の添加によりその反応混合物の総重量を５００ｇに
した。室温で４時間かき混ぜ後、ロイシンエステルの８
６係が加水分解された。水酸化ナトリウム溶液を加えて
その反応混合物をわずかにアルカリ性にしくｐＨ約９）
、その混合物からｔ−ブチルメチルエーテル（２Ｘ１５
０ｉ）による抽出で非加水分解エステルを回収した。以
後の操作は実施例１に記載の操作と同様であった。
Ｌ−ロイシンの収量は１６．５９で、これはロイシンエ
ステルからの回収率７１チに相当する。
アミノ酸分析による純度　：　９９％以上ＨＰＬＣによ
る光学的純度：１００％ 実施例１２ 重量で約３５％のイソロイシンイソブチルエステル及び
５５％のバリンエステルを含有する実施例１１の疎水性
アミノ酸エステルの回収された混合物を還流ヘッドを備
える１００Ｘ１．ＩＣ７ｒＬのビクロークス力ラム（Ｖ
ｉｇｒｕｘ　ｃｏｌｕｍｎ　）による真空蒸留で分離し
た。還流−留出比（ｒｅｆｌｕｘ　−ｄｉｓｃｈａｒｇ
ｅ　ｒａｔｉｏ　）は１０：１であった。１３朋Ｈｇで
５３．５〜５６℃で沸とうする留分は混合物中に元々存
在していたバリンイソブチルエステルの量の９０％を含
有し、９０チ以上の純度を有していた。１．３　ｍｒｉ
Ｈ＆　で６５〜６７℃において集められた留分は混合物
中に元々存在していたイソロイシンイソブチルエステル
の量の約９０％を含有し、その純度は約９０チであった
。遊離アミノ酸は対応するエステルから酸触媒、塩基触
媒又は自触媒の各加水分解で回収することができる。塩
基触媒加水分解がその速度と完全性の故に好ましい。例
、ｔば、イソロイシンイソブチルエステルはそのエステ
ルのＩＮ水酸化ナトリウム溶液中１５チェマルジョンを
４５分間還流させた稜完全に加水分解された。これらの
条件下でのイソロイシンのラセミ化率は約０．５％であ
った。
本発明の他の特徴、利点及び特定の実施態様は前記開示
を読めば轟業者には容易に明らかになるだろう。この点
に関し、本発明の特定の実施態様をかなり詳しく記載し
たが、本明細書に開示され、かつ特許請求される本発明
の精神と範囲から逸脱しないかぎりそれら実施態様は様
々に変更、改変が可能である。
（外４名）

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（イ）Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを含む
    アミノ酸混合物を用意し、（ロ）該アミノ酸混合物をア
    ルカノールでエステル化してＬ−ロイシンエステル及び
    Ｌ−イソロイシンエステルを含むエステル混合物を形成
    し、（ハ）エステラーゼ活性を有する酵素及び酵素コン
    プレックスより成る群から選ばれる酵素剤で該エステル
    混合物を処理することによつて該Ｌ−ロイシンエステル
    を選択的に加水分解してＬ−ロイシン及びＬ−イソロイ
    シンエステルを含む加水分解混合物を形成し、該加水分
    解混合物から該Ｌ−ロイシンを分離して精製されたＬ−
    ロイシンを形成することを特徴とする疎水性アミノ酸の
    混合物からＬ−ロイシンを分離する方法。
  2. （２）蛋白質の加水分解物をｐＨ２未満において水と非
    相溶性のアルコールで抽出して抽出物を形成することに
    よつて該エステル混合物を得、該エステル化は該抽出物
    を加熱してＬ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを該アル
    カノールによりエステル化することから成る特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  3. （３）該エステル混合物を蒸留により精製してＬ−ロイ
    シン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの各エステルよ
    り本質的に成る留分を得る特許請求の範囲第１項又は第
    ２項記載の方法。
  4. （４）該加水分解混合物がエステラーゼによる触媒加水
    分解後に残つた非加水分解エステル類を更に含んでおり
    、そして該加水分解混合物にアルカリを添加してアルカ
    リ性混合物を形成し、これを有機溶剤で抽出物を形成す
    ることによつて該加水分解混合物から該非加水分解エス
    テル類を抽出する工程を更に含む特許請求の範囲第１項
    、第２項又は第３項記載の方法。
  5. （５）該抽出に引き続いて濃縮、中和及び結晶化を行つ
    て該アルカリ性混合物からＬ−ロイシンを回収する特許
    請求の範囲第４項記載の方法。
  6. （６）該抽出に引き続いて蒸留で該イソロイシンエステ
    ルを精製し、単離された該イソロイシンエステルを水又
    は酸若しくはアルカリ水溶液と共に還流させて加水分解
    し、そして得られた溶液を濃縮、中和して放出されたＬ
    −イソロイシンを結晶化させることによつて、回収され
    たアミノ酸エステル混合物からＬ−イソロイシンエステ
    ルを単離する特許請求の範囲第４項記載の方法。
  7. （７）該アミノ酸混合物が１０〜９０重量％のロイシン
    、１０〜９０重量％のイソロイシン、０〜８０重量％の
    バリン及び０〜４０重量％のその他のアミン酸を含む特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. （８）該アルコールが炭素原子数１〜１０個のものであ
    る特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の方法
    。
  9. （９）該酵素剤がエステラーゼである特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
  10. （１０）該酵素剤がセリンプロテナーゼである特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  11. （１１）該セリンプロテナーゼがキモトリプシン、トリ
    プシン、サブチリシンカールスペルグ（サブチリシンＡ
    、アルカラーゼノボ）、サブチリシンノボ、エスペラー
    ゼノボ又はプロナーゼである特許請求の範囲第１０項記
    載の方法。
  12. （１２）該エステル混合物がアミノ酸エステルの５〜５
    ０％エマルジョンであり、該エマルジョンを酵素加水分
    解に付す特許請求の範囲第１項記載の方法。
  13. （１３）該エステル混合物がアミノ酸エステルの５〜５
    ０％溶液であり、該溶液を酵素加水分解に付す特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  14. （１４）該加水分解を遊離の天然形態の酵素で触媒する
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
  15. （１５）該加水分解を固定化された形態の酵素で触媒す
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  16. （１６）該加水分解をそれを触媒するために遊離酵素か
    又は固定化酵素を用いてバッチ式で行う特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  17. （１７）アミノ酸エステルの溶液を固定化酵素の充填床
    を通して送つて該加水分解を連続式で行う特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  18. （１８）該加水分解を酵素は保持するが、塩、アミノ酸
    及びアミノ酸のエステルのような低分子量化合物は通す
    酵素膜反応器を用いて連続的に行う特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  19. （１９）（イ）Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを含
    むアミノ酸混合物を用意し、（ロ）該アミノ酸混合物を
    アルコールでエステル化してＬ−ロイシンエステル及び
    Ｌ−イソロイシンエステルを含むエステル混合物を形成
    し、（ハ）エステラーゼ活性を有する酵素及び酵素コン
    プレックスより成る群から選ばれる酵素剤で該エステル
    混合物を処理することによつて該Ｌ−ロイシンエステル
    を選択的に加水分解してＬ−ロイシン及びＬ−イソロイ
    シンエステルを含む加水分解混合物を形成し、該加水分
    解混合物から精製されたＬ−ロイシンを形成するために
    該Ｌ−ロイシンを、また精製されたＬ−イソロイシンを
    形成するためにＬ−イソロイシンエステル混合物を分離
    することを特徴とする疎水性アミノ酸の混合物からＬ−
    ロイシン及びＬ−イソロイシンを分離する方法。
JP62082786A 1986-04-03 1987-04-03 Ｌ−ロイシンとｌ−イソロイシンの分離法 Pending JPS62275690A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63170343A (ja) * 1987-01-07 1988-07-14 Ajinomoto Co Inc ロイシンの分離方法
DK0383405T3 (da) * 1989-02-17 1993-12-06 Unichema Chemie Bv Esterfremstilling
DE4103828C2 (de) * 1991-02-08 1994-02-10 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Aminocarbonsäureestern

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH580058A5 (ja) * 1974-01-21 1976-09-30 Maggi Ag
SU715572A1 (ru) * 1978-05-24 1980-02-15 Предприятие П/Я Г-4740 Способ выделени -изолейцина из смеси солей аминокислот
SU715573A1 (ru) * 1978-08-15 1980-02-15 Предприятие П/Я Г-4740 Способ выделени -изолейцина из смеси аминокислот
US4205183A (en) * 1978-12-08 1980-05-27 Beckman Instruments, Inc. Facile method for isolating resolved amino acids
DE3318933C1 (de) * 1983-05-25 1984-06-07 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur Trennung von L-Leucin und L-Isoleucin
JPS6131550A (ja) * 1984-07-23 1986-02-14 株式会社長谷工コーポレーション 炭素繊維補強コンクリ−ト構造物

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