JP2002253293A - 光学活性L−tert−ロイシンの製造法 - Google Patents

光学活性L−tert−ロイシンの製造法

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Masaharu Dotani
正晴 銅谷
Takashi Kayama
考 加山
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 L−tert−ロイシンの工業的製造法を提
供する。 【解決手段】 D,L−tert−ロイシンアミドに、
L−tert−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解
する活性を有する微生物の生菌体あるいは該生菌体の処
理物を作用させて、L−tert−ロイシンおよびD−
tert−ロイシンアミドを得、次いで該D−tert
−ロイシンアミドを強塩基性物質の存在下で加熱するこ
とによりラセミ化してD,L−tert−ロイシンアミ
ドを生成し、再度立体選択的加水分解の原料として循環
使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、L−tert−ロ
イシンの製造法に関する。更に詳しくは、D,L−te
rt−ロイシンアミドを生化学的に不斉加水分解して対
応するL−tert−ロイシンを製造する方法に関す
る。L−tert−ロイシンは医薬品の製造中間体とし
て重要な物質である。
【0002】
【従来の技術】従来、L−tert−ロイシンの製造法
として、例えば、通常のストレッカー反応で容易に得ら
れるD,L−tert−ロイシンを原料とし、そのアミ
ノ基を無水酢酸等でアシル化し、立体選択的加水分解を
生化学的に行い、L−tert−ロイシンを得る方法が
特開昭60−105500に記載されているが、アシル
化工程が必要であり、また高価な副原料を使用するた
め、リサイクル工程が必要となり、工業的に有利とは言
えない。
【0003】また、例えばWO98/53088に記載
されている方法としてトリメチルピルビン酸を出発原料
とし、グルタミン酸、アスパラギン酸等の安価なアミノ
酸を用い、トランスアミダーゼによりアミノ基交換反応
を行い、L−tert−ロイシンを合成する方法が知ら
れている。この方法は、生成したアミノ酸と他のアミノ
酸との分離が困難という問題点がある。
【0004】一方、化学合成で容易に得られるD,L−
α−アミノ酸アミドを生化学的に加水分解してL−te
rt−ロイシンを製造する方法が特開平5−30992
に記載されているが、未反応のD−tert−ロイシン
アミドのラセミ化リサイクル工程がないため、そのまま
では工業的に成り立たないと考えられる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
技術に於ける上記のような課題を解決し、安価にL−t
ert−ロイシンを製造するための製造法を提供するこ
とにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、安価にL
−tert−ロイシンを製造するための製造法に関して
鋭意検討を行った結果、工業的に有利に得られるD,L
−tert−ロイシンアミドを生化学的に加水分解し、
未反応D−tert−ロイシンアミドをラセミ化後循環
するL−tert−ロイシンの一貫プロセスである本発
明を完成するに到った。
【0007】すなわち本発明は、化学式(1)で示され
るD,L−tert−ロイシンアミドに、L−tert
−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有
する微生物の生菌体あるいは該生菌体の処理物を作用さ
せて、化学式(2)で示されるL−tert−ロイシン
およびD−tert−ロイシンアミドを得、次いで該D
−tert−ロイシンアミドを強塩基性物質の存在下で
加熱することによりラセミ化してD,L−tert−ロ
イシンアミドを生成し、再度立体選択的加水分解の原料
として循環使用するL−tert−ロイシンの製造法に
関する。
【0008】
【発明の実施の形態】以下に本発明の詳細について説明
する。本発明の原料であるD,L−tert−ロイシン
アミドは、その製法および品質等に特に制限はない。
D,L−tert−ロイシンアミドの製法としては、例
えばピバルアルデヒドと青酸およびアンモニアとから得
られるD,L−α−アミノニトリルを部分加水分解する
方法などがある。この方法はD,L−α−アミノニトリ
ルを、工業原料として広く使用されているアルデヒド
類、青酸およびアンモニアから容易に製造することがで
きる点で有利である。この他、D,L−tert−ロイ
シンアミドは、後述のように、D−tert−ロイシン
アミドを強塩基性物質の存在下で加熱し、ラセミ化する
方法によっても得ることができる。
【0009】本発明のD,L−tert−ロイシンアミ
ドの生化学的加水分解に使用される微生物は、目的とす
るL−tert−ロイシンに対応するL−tert−ロ
イシンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する
微生物であれば良く、このような微生物として例えば、
シュードモナス属、クリプトコッカス属、ロツデロマイ
セス属、ロドスポリジウム属、ミコプラナ属、ミコバク
テリウム属、セラチア属およびバチソレン属等に属する
微生物、具体的にはシュードモナス ロゼア(Pseu
domonas rosea) NCIB 1060
5、クリプトコッカス ラウレンテイ(Cryptoc
occus laurentii) ATCC 188
03、クリプトコッカス ネオホルマンス(Crypt
ococcus neoformans) ATCC
32045、ロツデロマイセス エロギスポラス(Lo
dderomyces elogisporus) I
FO1676、ロドスポリジウム トルロイデス(Rh
odosporidiumtoruloides) I
FO 0871、ロドスポリジウム ジオボバタム(R
hodosporidium diobovatum)
IFO 1828、ミコプラナ ディモルファ(My
coplana dimorpha) IFO 132
91(ATCC 4279)、ミコプラナ ディモルフ
ァ(Mycoplana dimorpha) NCI
B 9439、ミコプラナ ディモルファ(Mycop
lana dimorpha) IFO 13213、
ミコプラナ ブラタ(Mycoplana bulla
ta) IFO 13290(ATCC 4278)、
ミコプラナ ブラタ(Mycoplana bulla
ta) NCIB 9440、ミコプラナ ブラタ(M
ycoplana bullata) IFO 132
67、ミコプラナ sp(Mycoplanasp)
IFO 13240、ミコバクテリウム スメグマティ
ス(Mycobacterium smegmati
s) ATCC 19420T、セラチア マルセッセ
ンス(Serratia marcescens) I
AM 1106、バチソレン タンノフィラス(Pac
hysolen tannophilus) IFO
1007が挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。
【0010】これらの微生物の培養は、通常資化しうる
炭素源、窒素源、各微生物に必須の無機塩、栄養等を含
有させた培地を用いて行われるが、高い酵素活性を得る
ために、培地に予めD,L−α−アミノ酸アミドを添加
することも効果的である。この際に添加されるD,L−
α−アミノ酸アミドは、目的とするL−tert−ロイ
シンに対応するD,L−tert−ロイシンアミドを用
いることが好ましいが、一般的なD,L−α−アミノ酸
アミド、例えばD,L−アラニンアミド、D,L−バリ
ンアミド等でも良く、特に制限はない。培養時のpH
は、4〜10の範囲であり、温度は20〜50℃であ
る。培養は1日〜1週間程度好気的に行われる。このよ
うにして培養した微生物は、培養液、分離菌体、菌体破
砕物、さらには精製した酵素として反応に使用される。
また、常法に従って、菌体又は酵素を固定化して使用す
ることもできる。
【0011】D,L−tert−ロイシンアミドの生化
学的加水分解反応の条件は、D,L−tert−ロイシ
ンアミド濃度1〜40wt%、D,L−tert−ロイ
シンアミドに対する微生物の使用量は、乾燥菌体として
重量比0.005〜3、反応温度20〜70℃、pH5
〜13の範囲である。
【0012】D,L−tert−ロイシンアミドの生化
学的加水分解反応で生成したL−tert−ロイシン
は、反応終了液から、例えば遠心分離あるいは濾過膜な
どの通常の固液分離手段により微生物菌体を除き、減圧
濃縮後、有機溶媒を加えてL−tert−ロイシンを析
出させたのち濾取するといった方法、あるいは微生物菌
体を除いた後、減圧下で水を除去し、残査固体に有機溶
媒を加えて未反応のD−tert−ロイシンアミドを溶
解し、不溶のL−tert−ロイシンを濾取するといっ
た方法により、容易に分離することができる。この時L
−tert−ロイシンを析出させるため、あるいは未反
応のD−tert−ロイシンアミドを溶解させるために
加える有機溶媒は、L−tert−ロイシンの溶解度が
低く、未反応のD−tert−ロイシンアミドの溶解度
が高い溶媒であれば良く、特に制限はないが、エタノー
ル、2−プロパノール、2−メチル−1−プロパノー
ル、1−ブタノールおよび2−ブタノール等のアルコー
ル類が好適に使用される。また、微生物菌体を分離した
反応終了液から、未反応のD−tert−ロイシンアミ
ドを溶媒抽出などの方法により除いた後、残液から晶析
などの方法によってL−tert−ロイシンを分離する
こともできる。このときD−tert−ロイシンアミド
を抽出する溶媒として、例えばヘキサン、ベンゼン、ト
ルエン、およびキシレン等の非極性溶媒が挙げられる。
このほか、反応終了液から微生物菌体を除いた後、イオ
ン交換電気透析によりL−tert−ロイシンだけを選
択的に分離回収する方法も有効である。
【0013】未反応のD−tert−ロイシンアミド
は、前記のD,L−tert−ロイシンアミドの生化学
的加水分解反応終了液からL−tert−ロイシンを分
離した後の液の濃縮、あるいは微生物菌体分離後の反応
終了液から、溶媒抽出などの方法により容易に回収され
る。
【0014】D−tert−ロイシンアミドは、例えば
アルカリで加水分解することにより、対応するD−te
rt−ロイシンへ変換することができる。
【0015】また、D−tert−ロイシンアミドは、
強塩基性物質の存在下で加熱することにより、容易にラ
セミ化し、D,L−tert−ロイシンアミドとする事
ができる。D−tert−ロイシンアミドのラセミ化反
応で使用されるD−tert−ロイシンアミドは、前記
のD,L−tert−ロイシンアミドの生化学的加水分
解反応終了液から回収されたD−tert−ロイシンア
ミドをそのまま、または必要に応じて再結晶等の操作に
よって精製を行った後に用いることができる。あるいは
反応終了液から微生物菌体を除去し、次いでイオン交換
電気透析によりL−tert−ロイシンだけを選択的に
分離回収した後の、D−tert−ロイシンアミドを含
む液をラセミ化反応の原料にしても良い。
【0016】D−tert−ロイシンアミドのラセミ化
反応に使用される強塩基性物資とは、有機または無機の
強塩基性物質であれば良く、代表例として水酸化テトラ
メチルアンモニウムおよび水酸化テトラエチルアンモニ
ウムなどの有機第四級アンモニウム化合物ならびに水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラー
ト、ナトリウムアミドおよびナトリウムハイドライドな
どのアルカリ金属化合物、および水酸化バリウムなどの
アルカリ土類金属化合物が挙げられる。なお、反応系内
において上記の強塩基性物質に変化しうる物質、例えば
ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属単体、な
らびにバリウムなどのアルカリ土類金属単体などをそれ
ぞれ添加することも可能である。これら強塩基性物質の
使用量は、D−tert−ロイシンアミド1モルに対し
て0.001〜0.5モルの割合であり、好適には0.
01〜0.1モルの割合である。
【0017】D−tert−ロイシンアミドのラセミ化
反応は、溶媒を使用しないで行うこともできるが、溶媒
を使用した場合には反応温度を低くすることができ、そ
のため副生成物が生成する危険性を低くすることがで
き、より好適である。この際に使用される溶媒として
は、D−tert−ロイシンアミドおよび強塩基性物質
のそれぞれに対して不活性であれば良く、例えばヘキサ
ン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンお
よびキシレン等の炭化水素類、2−プロパノール、2−
メチル−1−プロパノール、2−ブタノール、1−ブタ
ノールおよび1−ペンタノール等のアルコール類、イソ
プロピルエーテル、n−ブチルエーテル、ジオキサン、
エチレングリコールモノブチルエーテル、2−エトキシ
エタノール、ジエチレングリコールジメチルエーテル、
アニソール、フェネトールおよびジメトキシベンゼン等
の脂肪族または芳香族エーテル類、ならびにイソブチロ
ニトリルなどがある。
【0018】溶媒の使用量に特に制限はないが、実用
上、D−tert−ロイシンアミドの重量に対して10
0倍より多くする必要はなく、1〜20倍程度が好まし
い。ラセミ化反応液中の水分は少ないほど好ましいが、
1wt%程度以下ならばほとんど支障はなく、0.5w
t%以下であれば実質的に支障はない。ラセミ化反応の
温度は20〜200℃、好適には50〜150℃であ
る。ラセミ化反応は、通常、常圧下で行われるが、減圧
下または加圧下で行うことを妨げない。ラセミ化反応終
了後、生成したD,L−tert−ロイシンアミドを分
離回収する方法は、例えば減圧下で溶媒を留去した後、
冷却して結晶を析出させ、濾取または遠心分離などの通
常の固液分離操作により分離回収する方法、あるいはラ
セミ化反応終了液へ水を添加してD,L−tert−ロ
イシンアミドを水相へ溶出し、そのまま、あるいはpH
調整後立体選択的加水分解工程へ循環する方法がある
が、後者の方が工業的には、より合理的である。このよ
うにしてD−tert−ロイシンアミドをラセミ化し、
D,L−tert−ロイシンアミドとし、立体選択的加
水分解反応系へ循環することにより、D,L−tert
−ロイシンアミドを全量L−tert−ロイシンに変換
することができる。
【0019】
【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例1 (a)L−tert−ロイシンの製造 次の組成の培地を調製し、この培地200mlを1L三
角フラスコに入れ、滅菌後、ミコバクテリウム スメグ
マティス(Mycobacterium smegma
tis) ATCC 19420Tを接種し、30℃で
48時間振盪培養を行った。 培地組成(pH7.0) グルコース 2g ポリペプトン 1g 酵母エキス 1g KH2 PO4 0.4g MgSO4 ・7H2 O 80mg MnCl2 ・4H2 O 6mg FeSO4 ・7H2 O 6mg H2 O 200ml 培養終了時、培養液の菌体濃度は5g/kgであった。
この培養液100gから、遠心分離により、乾燥菌体
0.5gに相当する生菌体を得た。この生菌体を40m
lの蒸留水に懸濁し、300ml三角フラスコに入れ、
ここにD,L−tert−ロイシンアミド10g(77
mmol)を加えて、30℃で48時間振盪して加水分
解反応を行った。反応後、反応液から遠心分離によって
除菌し、エバポレータで減圧にて水を除去した後、2−
メチル−1−プロパノール100mlを加えて未反応の
D−tert−ロイシンアミドを溶解し、不溶のL−t
ert−ロイシンを白色固体として濾取した。得られた
固体の乾燥後の重量は4.6g(35.1mmol)、
D,L−tert−ロイシンアミドに対する収率は4
5.6モル%、仕込んだD,L−tert−ロイシンア
ミド中のL−tert−ロイシンアミドに対する収率は
91.2モル%であった。また、生成したL−tert
−ロイシンを光学分割用キラルカラム(CHIRALP
AK WH、ダイセル化学工業製)を用いた液体クロマ
トグラフィーにより分析した結果、光学純度は99%
e.e.以上であった。
【0020】(b)D−tert−ロイシンアミドのラ
セミ化 D−tert−ロイシンアミド1.0g(7.7mmo
l)を5mlの2−メチル−1−プロパノールに溶解
し、ここに水酸化ナトリウム0.03g(0.8mmo
l)を加えて120℃で1時間撹拌した。反応終了後、
反応液を冷却し、ジイソプロピルエーテルを加え、析出
した固体を濾取し、D,L−tert−ロイシンアミド
を得た。乾燥後の重量は0.88g(6.8mmol)
であり、回収率は88モル%であった。この固体を光学
分割用キラルカラム(CROWNPAK CR、ダイセ
ル化学工業製)を用いた液体クロマトグラフィーにより
分析した結果、D−tert−ロイシンアミドのラセミ
化率は92%であった。なおラセミ化率は次のようにし
て算出した。 ラセミ化率(%)=L−アミド/(L−アミド+D−ア
ミド)×2×100 ラセミ化率100%とは、L−tert−ロイシンアミ
ドとD−tert−ロイシンアミドとが互いに等量であ
ることを示す。
【0021】
【発明の効果】医薬品原料として有用なL−tert−
ロイシンを、安価に製造することができる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 化学式(1)で示されるD,L−ter
    t−ロイシンアミドに、L−tert−ロイシンアミド
    を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の生菌
    体あるいは該生菌体の処理物を作用させて、化学式
    (2)で示されるL−tert−ロイシンおよびD−t
    ert−ロイシンアミドを得、次いで該D−tert−
    ロイシンアミドを強塩基性物質の存在下で加熱すること
    によりラセミ化してD,L−tert−ロイシンアミド
    を生成し、再度立体選択的加水分解の原料として循環使
    用することを特徴とするL−tert−ロイシンの製造
    法。 【化1】 【化2】
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