JPS6231915B2

JPS6231915B2 -

Info

Publication number: JPS6231915B2
Application number: JP59101881A
Authority: JP
Inventors: Kureeman Akuseru; Marutensu Yurugen; Uaigeru Horusuto
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1983-05-25
Filing date: 1984-05-22
Publication date: 1987-07-10
Also published as: ATE20231T1; EP0126887A2; DE3318932C1; EP0126887A3; US4562152A; JPS6023354A; EP0126887B1

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、それぞれ乾燥物質に対して、Ｌ−ロ
イシン最低45重量、Ｌ−イソロイシン最高40重量
％、他のアミノ酸最高25重量％を含有するアミノ
酸混合物から純粋なＬ−ロイシンを得る方法に関
する。

従来の技術Ｌ−ロイシンは、薬学作用物質、たとえばアミ
ノ酸を主体とする注入液の成分である。今日まで
は、Ｌ−ロイシンの工業的製造はいわゆる抽出法
により行なわれる。このために、蛋白質をアミノ
酸混合物に加水分解し、これから分別結晶化およ
び／または分取クロマトグラフイー方法（イオン
交換、イオン排除および／またはモレキユラーシ
ーブ効果）により工業用Ｌ−ロイシンが得られ
る。

このようにして得られた工業用Ｌ−ロイシン
は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アン
モニウムまたは硫酸アンモニウムのような無機塩
のほかに、なお他のアミノ酸、殊にＬ−イソロイ
シンをも含有する。薬品質のＬ−イソロイシンの
製造のためにはこれらの不純物を除去しなければ
ならず、その場合殊にＬ−イソロイシンの分離は
困難であるが、その理由はイソロイシンはロイシ
ンと同じ分子式C₆H₁₃NO₂を有し、この双方のア
ミノ酸は脂肪族側鎖Ｒの構造によつて異なるから
である：この非常に類似する構造特徴によつて、これら
のアミノ酸は物理的および化学的挙動において非
常に類似の性質を示す。これは、市販のＬ−ロイ
シンがしばしばかなりの量のＬ−イソロイシンを
他のアミノ酸（たとえばＬ−バリン、しばしばＬ
−メチオニンも）とともに含有することの根拠で
ある。この事情をリチヤードJ.ブロツク
（Richard J.Block）〔“Arch.Bio chem”．第11巻
501号（1946年）第512ページ〕も指摘している。

工業用Ｌ−ロイシンの困難な後精製は、既に銅
錯体を経て実施されている。類似の方法で、アミ
ノ酸のコバルト錯体もアルコールでの抽出により
分離された。しかし、これらの方法では金属の回
収およびＬ−ロイシンをさらに精製する問題が生
じる。

他の研究者により、芳香族スルホン酸を用いて
ロイシンを沈殿させる事が記載されている。それ
で、Ｌ−ロイシンを沈殿させるのに２−ブロムト
ルオール−５−スルホン酸またはナフタリン−２
−スルホン酸を使用する事が提案された。ベンゾ
ールスルホン酸ならびにｐ−トルオールスルホン
酸も、工業用Ｌ−ロイシンから出発するＬ−ロイ
シンの製造に使用された。これらの方法では沈殿
物は数多くの再結晶により精製しなければなら
ず、しばしば強毒性沈殿剤の分離が特別な問題を
生じる。さらに、酸性の蛋白質加水分解物からの
Ｌ−ロイシン富有画分は、特定のPH価で水の添加
により約1.5％のＬ−イソロイシン濃度に調節
し、メチオニン含量の測定後、過酸化水素の添加
によりメチオニンを酸化する事により後精製され
た。これは、活性炭清澄化、1.0〜1.5にPH価調
節、冷却、粗精Ｌ−ロイシンの分離と続いた。こ
の粗製Ｌ−ロイシンは新たにPH0.5で溶解し、PH
1.0〜2.0で沈殿させる事によりさらに精製され
た。この方法を、Ｌ−ロイシンの所望の純度に達
するまで繰り返した。ヨーロツパ特許第14867号
明細書に記載されているこの方法では、非常に希
釈して作業しなければならず、さらに方法は、工
業的規模での適用がほとんど問題にならないよう
な多工程法である。

さらに、薬品質の純粋なＬ−ロイシンを得るた
めの工業用Ｌ−ロイシンの公知後精製方法は決定
的な欠点を有する：Ｌ−ロイシンの鏡像異性体の
純度については何も述べられていない。しかしロ
イシンは、通常の酸性蛋白質加水分解条件下で最
も早くラセミ化するアミノ酸に属する〔“Liebigs
Ann.Chem”．1981巻、第354〜365ページ〕。

発明が解決しようとする問題点Ｄ−ロイシンおよびＬ−ロイシンの異なる生物
学的作用は公知であり、従つて工業用Ｌ−ロイシ
ンからＤ−ロイシンおよび他の不純物を同時に分
離できる方法が非常に望ましい。

本発明の課題は、工業用Ｌ−ロイシンから、公
知方法の欠点をさけて、Ｄ−ロイシンおよび他の
不純物を同時に分離して、純粋なＬ−ロイシンを
得る事のできる方法を提供する事である。

問題点を解決するための手段ところで本発明による方法は、 (a) アミノ酸混合物の自体公知の方法でアセチル
化し、 (b) アセチル化生成物の粗製混合物から、鉱酸で
酸性にする事によつてＮ−アセチル−Ｌ−ロイ
シンに富むＮ−アセチルアミノ酸混合物を沈殿
させ、 (c) このＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンに富む混合
物をＮ−アセチル−Ｌ−ロイシン0.1〜1.5モ
ル／の濃度を有する水溶液で６〜８のPH、10
〜40℃の温度でエフエクターの存在においてＬ
−アミノ酸アシラーゼによるケン化を、使用さ
れたＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンの30〜95％が
遊離アミノ酸にケン化されるまで実施し、 (d) 粗製ケン化混合物からＬ−ロイシンを単離す
る事を特徴とする。

本発明による方法において使用すべきアミノ酸
混合物は一般に、蛋白質加水分解物からの既にＬ
−ロイシンに富む画分の形の工業用Ｌ−ロイシン
である。乾燥物質に対してＬ−ロイシン45〜90重
量％を含有するアミノ酸混合物が特に適当であ
る。特に適当な工業用Ｌ−ロイシンは乾血加水分
解物の分別からのもので、Ｌ−ロイシン70〜80重
量％、Ｌ−イソロイシン５〜15重量％、他のアミ
ノ酸最高25重量％を含有する。

アミノ酸混合物をまず自体公知の方法でアセチ
ル化する。アセチル化は塩化アセチルまたは無水
酢酸を用いるかまたは西ドイツ国特許出願公開第
2741081号明細書から公知の方法によりケテンを
用いて実施する事もできる。

引続き、アセチル化生成物の粗製混合物から鉱
酸、たとえば塩酸または硫酸で酸性にする事によ
りＮ−アセチルアミノ酸の混合物を沈殿させる。
この場合望ましくは0.5〜２のPHに酸性にする。
この場合、既にＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンの富
化が生じる。生じうる、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイ
シンおよびＮ−アセチル−Ｌ−イソロイシン以外
のＮ−アセチルアミノ酸の含量は減少する。引続
き、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノ
ール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノー
ル、イソブチルアルコールまたはtert.ブチルア
ルコールのような１〜４の炭素原子を有する水と
混合可能な脂肪族アルコール、または水とこのよ
うなアルコールとの混合物からの再結晶により、
他のＮ−アセチルアミノ酸の含量は通常乾燥物質
に対して４重量％よりも少なく、多くの場合１重
量％より少ない値に減少させる事ができる。

Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシンに富む混合物（場
合による再結晶後わずかにＮ−アセチル−Ｌ−イ
ソロイシンで不純化にされているにすぎない）
に、Ｌ−アミノ酸アシラーゼによるケン化を行な
う。６〜８の範囲へのPHの調節は、たとえばアン
モニア、しかし有利にはカ性ソーダ溶液により行
なう事が出来る。エフエクターとしては通常Ｌ−
アミノ酸アシラーゼを用いるＮ−アセチル−DL
−α−アミノカルボン酸のラセミ体分割の際に添
加されるもの、たとえばイオン・Ca²⁺、Fe²⁺、
Mn²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺および特にCo²⁺が使用され
る。これらは望ましくは、１×10^-5〜１×10^-1モ
ル／の濃度で、およびたとえば相当する塩化物
の形で添加される。多くの場合、反応混合物に付
加的に少量の殺菌剤、たとえばｐ−ヒドロキシ安
息香酸−ｎ−プロピルエステルを添加するのが有
利である。

Ｌ−アミノ酸アシラーゼとしては有利には腎ア
シラーゼが使用される。これは市販の天然の形で
適用するかまたは、橋かけされたアガロース、デ
キストランゲル、セルロース、ヒドロキシエチル
セルロースまたはアクリルアミドと橋かけコモノ
マーとの共重合体のような有機担持物質上かまた
は種々の多孔性の酸化物型材料または殊にガラス
小球のような無機担持物質上の固定層として適用
する事ができる。

Ｌ−アミノ酸アシラーゼを比較的大量に使用す
る場合、ケン化に必要な反応時間を短縮できる。
より長い反応時間を甘受すれば、Ｌ−アミノ酸ア
シラーゼの使用量を著しく減少させる事ができ
る。従つて、反応時間とＬ−アミノ酸アシラーゼ
の使用量との間には、顕著な相互従属関係が生じ
る。

ケン化、つまり反応工程(c)は、始めに存在して
いたＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンの30〜95％、特
に45〜85％、殊に50〜80％が遊離Ｌ−ロイシンに
ケン化されたときに中断する。ケン化反応は、た
とえば高圧液体クロマトグラフイーを用いるかま
たはアミノ酸分析器を用いて分析により追跡す
る。

ケン化反応は非連続的かまたは連続的に実施す
る事ができる。非連続的反応実施のために、かく
はん釜または循環系を有するタンク中で作業す
る。連続的な反応実施はたとえば酵素−膜反応器
を用いて実施する事ができる。

ケン化反応に使用される混合物がたとえば1.0
〜1.5モル／の比較的高いＮ−アセチル−Ｌ−
ロイシン濃度を有する場合には、既に短時間後、
純粋なＬ−ロイシンから成る無色の沈殿物が晶出
しはじめる。混合物をより低い濃度で使用する場
合には、粗製ケン化混合物を穏和な条件下で濃縮
するのが有利である。この場合にも同様に純粋な
Ｌ−ロイシンが晶出する。いずれの場合にも、純
粋なＬ−ロイシンを、場合によりあらかじめたま
たま使用され、固定されたＬ−アミノ酸シアラー
ゼを分離するために分別した後、濾過または遠心
分離により単離する。

天然のＬ−アミノ酸アシラーゼによるケン化を
行なう場合には、該アミノ酸アシラーゼを、Ｌ−
ロイシンの分離後、たとえば中空繊維膜での限外
濾過によつて回収し、新たに使用する事ができ
る。

場合によつては、Ｌ−ロイシンを多くの画分で
単離する。即ち最初の画分の分離後ケン化を続
け、Ｌ−ロイシンの他の画分を得るのが有利であ
る。場合により望ましい、分離されたＬ−ロイシ
ンの個々の画分または全量をさらに精製するの
は、水からの再結晶により行なう事ができる。

Ｌ−ロイシンおよび場合によりＬ−アミノ酸ア
シラーゼの分離後に残留する溶液中では、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−イソロイシンはかなり富化されてい
る。この溶液は、望ましくは高圧液体クロマトグ
ラフイーによるかまたはアミノ酸分析器を用いて
その組成を測定した後、アセチル化工程に戻すか
またはＬ−イソロイシンに後処理する事ができ
る。

実施例本発明を次例により詳述する。これらの例には
次の事がいえる：Ｌ−アミノ酸アシラーゼの活性は単位（Ｕ）で
記載する。1Uは、PH7.0および25℃で毎時Ｎ−ア
セチル−Ｌ−メチオニン１μMolをケン化する。

Ｌ−ロイシンにつき記載された旋光度〔α〕^２５ _Ｄ
は6N塩酸中ｃ＝４で測定する。薬品質の純粋な
Ｌ−ロイシンの旋光度は、この条件下で米国薬局
方によれば〔α〕^２５ _Ｄ＝＋14.9゜〜＋17.3゜である。

使用されたアミノ酸混合物の組成の測定は、ア
ミノ酸分析器を用いて行なわれる。

酵素によるケン化のために使用された、Ｎ−ア
セチルアミノ酸混合物の組成の測定は、旋光度に
より行なわれる。

パーセント表示は別記しないかぎり、重量％を
表わす。

例１大豆加水分解の副生成物として生じる、次の相
対的なアミノ酸組成の工業用ロイシンをアセチル
化した： Ile 12.4％ Leu 83.2％ Val 0.9％ Met 2.4％ Ala 0.5％ Ser 0.2％他のアミノ酸全部で0.4％そのためにこの混合物525ｇを2Nカ性ソーダ溶
液２に溶解し、０℃で１時間内に同時に無水酢
酸450mlおよび5Nカ性ソーダ溶液850mlを滴加
し、その場合PH価がPH10〜12の範囲にあるように
注意した。添加終了後、さらに１時間＋５℃でか
くはんした。褐色の溶液をPH１に達するまで濃塩
酸とかくはんした。吸引濾過し、水で洗浄し、乾
燥する事によつて、固形物580ｇを得た。この粗
生成物を含水メタノールから再結晶し、その際Ｎ
−アセチル−Ｌ−ロイシン90％およびＮ−アセチ
ル−Ｌ−イソロイシン10％から成る無色の混合物
435ｇが生じた。この混合物86.6ｇを0.5Nカ性ソ
ーダ溶液１に溶解し、PH価を7.4に調節した。
触媒として豚腎臓からの腎アシラーゼ（1200U／
mg）40mgおよびCoCl₂×6H₂O 60mgを添加した。
澄明な溶液を39℃に加熱した。２ 3/4時間後に、
最初の結晶が形成した。10時間後20℃に冷却し、
かさ張つた沈殿物を吸引濾過し、水で洗浄した。

乾燥した後、純粋なＬ−ロイシン35.6ｇが生じ
た。旋光度〔α〕^２５ _Ｄは＋15.3゜であつた。

濾液を20℃で24時間放置し、その際新たに結晶
が沈殿した。吸引濾過し、水で洗浄しかつ乾燥し
た後、旋光度〔α〕^２５ _Ｄ＝＋16.2゜を有する純粋な
Ｌ−ロイシンさらに9.3ｇが生じた。

例２蛋白質加水分解物のクロマトグラフイー分離か
ら得られた、中性アミノ酸の画分は次の組成を有
していた： Leu 49.8％ Ile 36.1％ Val 3.5％ Met 3.5％ Tyr 2.5％ Ala 2.1％ Phe 1.6％ Gly 0.9％この混合物525ｇを2Nカ性ソーダ溶液２に溶
解し、０℃に冷却した。１時間内に、無水酢酸
410mlおよび同時に5Nカ性ソーダ溶液850mlをか
くはん混入し、その際PH価がPH10〜12の範囲内に
あり、温度が＋５℃を越えないように注意した。
添加終了後、５℃でさらに１時間かくはんした。
褐色溶液を、PHが1.5に達するまで濃塩酸とかく
はんした。吸引濃過し、水で洗浄し、乾燥する事
によつて、弱褐色の粉末としてアセチル化合物
530ｇを得た。この粗生成物をｎ−ブタノールか
ら再結晶し、その際Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン
65％およびＮ−アセチル−Ｌ−イソロイシン35％
から成る無色の混合物335ｇが生じた。

この混合物86.6ｇを水500mlに懸濁させ、50％
のカ性ソーダ溶液と共に、PH7.6の澄明溶液が生
じるまでかくはんした。これに、CoCl₂×6H₂O
50mgおよび2000U／mgの活性を有する豚腎臓から
のアミノアシラーゼ５mgを加えた。溶液は38℃で
30分間放置した。その後、生じた懸濁液を20℃に
冷却し、濾過した。〔α〕^２５ _Ｄ＝＋15.7℃の旋光度を
有する純粋なＬ−ロイシン24.6ｇが生じた。

発明の効果本発明によれば、工業用Ｌ−ロイシンからＤ−
ロイシンおよび他の不純物を同時に分離して、純
粋なＬ−ロイシンを得る事ができる。

Claims

【特許請求の範囲】１それぞれ乾燥物質に対して、Ｌ−ロイシン最
低45重量％、Ｌ−イソロイシン最高40重量％およ
び他のアミノ酸最高25重量％を含有するアミノ酸
混合物から純粋なＬ−ロイシンを得る方法におい
て、 (a) アミノ酸混合物を自体公知の方法でアセチル
化し、 (b) アセチル化生成物の粗製混合物から、鉱酸で
酸性にする事によつてＮ−アセチル−Ｌ−ロイ
シンで富化されたＮ−アセチルアミノ酸の混合
物を沈殿させ、 (c) このＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンで富化され
た混合物をＮ−アセチル−Ｌ−ロイシン0.1〜
1.5モル／の濃度を有する水溶液で６〜８の
PH、10〜40℃の温度で、エフエクターの存在に
おいてＬ−アミノ酸アシラーゼによるケン化
を、使用されたＮ−アセチル−Ｌ−ロイシンの
30〜95％が遊離アミノ酸にケン化されるまで実
施し、 (d) 粗製ケン化混合物からＬ−ロイシンを単離す
る事を特徴とする純粋なＬ−ロイシンの製造
法。２工程(b)において沈殿したＮ−アセチルアミノ
酸の混合物を、工程(c)の実施前に、水、１〜４の
炭素原子を有する水と混合可能な脂肪族アルコー
ルまたは水とこのようなアルコールの混合物から
再結晶する、特許請求の範囲第１項記載の方法。