JPS62253388A - Ｌ−カルニチンの改良された製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカルニチン、すなわち４−トリメチルアミノ−
３−ヒドロキシ酪酸の改良された製造方法に関し、特に
生物化学的経路でＬ−カルニチンを製造する方法に関す
る。

カルニチンは主として生物学的用途、特に薬品、化粧品
および食品の用途に、とりわけ胃およびすい臓分泌の刺
激剤、または抗過脂肪タンパク質剤として利用されてい
る。その化学的製造方法ではラセミ混合物を生成し、一
方、Ｌ−立体異性体のみが生物学的に活性なので、特に
興味のある、その製造方法はＬ−異性体を与える生物学
的方法である。

従って、この化合物の経済的な製造を可能にする製造方
法を見出すことは重要なことである。

本発明による方法を適用することによって興味ある進歩
がもたらされ、生物化学的経路でＬ−カルニチンを良好
な収率で製造することができる。

Ｌ−カルニチンの既知の製造方法は、酵素のカルニチン
デヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）の存在下に、還元されたニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドＮＡＤＨによって
デヒドロカルニチンを還元することから成る。得られた
ＮＡＤ”は適切な還元剤、たとえばグルコース、アルコ
ール、アルデヒド、アルカリ金属、ジチオネートまたは
ホルメートによって、相当するデヒドロゲナーゼの存在
下にＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの形に還元される。

かかる方法は、フランス特許第２３９８０４６号に詳細
に記載されている。

特にＬ−カルニチンの製造は、還元されたニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドＮＡＤＨのデヒドロカルニチ
ンへの作用および触媒としてのデヒドロゲナーゼホルメ
ートＦＤＨのギ酸基による形成されたＮＡＤ”の還元に
影響される。

この製造の経路は下記のとおりである。

曜 ０）１　　　　　　　　　　　　　　　　　＜　ｉ　＞
使用したＣＤＨは一般にバクテリア、たとえばハ尼ル垣
懸１Ｌヱ痕１０−の培養抽出物である。ＣＤＨは２５０
ｇ／ｆの硫酸アンモニウム　（飽和の５５％）によって
粗抽出物から沈澱せしめられる。

しかしながら、従来技術は極めて多量の酵素をＬ−カル
ニチンのモル当りに必要とし、かつ時間当りの反応容器
の単位当りの生産性が低いので工業的用途には不適当で
ある。

ＮＡＤ”還元剤としてのホルメートの使用は、工業的に
魅力はあるが、上記した特許の実施例５に見られるよう
に、今日に至るまで極めて収率が低い。

本発明は、上記した生物化学的方法が工業的に許容され
る割合い内の、著しく少量の酵素によって行ないうろこ
とを見出したことにもとづくものであり、もしも反応媒
体が溶解した塩を含むときには、酵素濃度を更に少なく
することができる。

かかるイオン力（ｉｏｎｉｃ　ｆｏｒｃｅ）の存在は、
本発明における酵素系に安定化効果をもたらし、デヒド
ロカルニチンの還元中の酵素の汚染や死滅を回避する。

すなわち本発明による方法は、反応（１）が起る水系媒
体が少なくとも０．５モル、好ましくは０．６〜３モル
、とりわけ好ましくは０．８〜２．５モルのイオン力を
有する事実によって特徴づけられ、このイオン力は上記
した従来技術では０．３モルを越えなかった。

本発明の好ましい態様においては、デヒドロカルニチン
の溶液が要求される酵素の溶液中に次第にそそぎ込まれ
、従って反応媒体の容積は操作の始めから終りに向って
変化し、イオン力も同様に変化し、上記した制限が少な
くとも反応の終りにおいて達成される。

反応開始の時点においては、酵素の溶液中にイオン化可
能な塩の０．１〜０．４モルのみを有すれば良い。

電解質によって与えられる、反応媒体の成分の安定性へ
の有益な効果にもかかわらず、電解質濃度は成る制限、
特に約３モルの値を越えないことが好ましい。

十分なイオン力は反応媒体液に有機または無機酸または
塩基の種々の塩を溶解することによって得られる。

この塩の選択は、６〜８の間、好ましくは６．８〜７．
８の間になければならない媒体のｐＨによって左右され
る。

使用可能な塩の非限定的例によれば、アルカリ金属、ア
ンモニウムおよびアミンの塩化物、硫酸塩およびリン酸
塩や、かかるカチオンの異なる有機酸の塩、たとえばギ
酸塩、酒石酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスル
ホン酸塩、フタル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、マ
ロン酸塩などを挙げることができる。

かかる電解質の反応媒体への導入は種々の方法で行なう
ことができる。すなわち、反応の始めに酵素の溶液への
添加、上記したように酵素溶液に次第にそそぎ込まれる
デヒドロカルニチンの溶液への添加、デヒドロカルニチ
ンの溶液とは別に反応媒体への直接添加である。

これらの添加様式の二つ、または三つの全てを同時に行
なうこともできる。

塩の形状の、特に塩酸塩の形のデヒドロカルニチンの使
用が便利なので、デヒドロカルニチンの溶液の添加と同
時に、反応媒体中に塩、たとえば塩化物の形成が可能な
塩基の溶液を加えることによって適切なイオン力の実現
化を行なうことができる。この点に関して、反応媒体中
におけるイオンの濃度は、後の溶液中のデヒドロカルニ
チンの塩酸塩または他の塩の濃度に依存することに注目
すべきである。すなわち、イオン力はこの濃度の調整に
よって導くことができる。

本発明によるイオン力の適切な調整の顕著な結果は、酵
素の比率を著しく低下することができたことである。

すなわち、上記したフランス特許の実施例における、処
理されたデヒドロカルニチンのモル当り使用したカルニ
チンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＩ）の３２００〜８７００
単位の代りに、２００〜１０００単位、極めてしばしば
４００〜９００単位、従って５〜１０分の１以下の使用
で十分であり、このことは極めて重要な技術的進歩であ
る。

また、イオン力によって実現された酵素の安定性によっ
て、反応時間を延長し、従来技術によって達成されたよ
りも著しく高い収率に到達することが可能である。反応
器の単位容積当り、時間当りの生産量は、この結果極め
て著しく増大した。

反応を４０時間以上も継続させることは通常では不可能
であったが、本発明によれば一般的に４８時間を越える
ことができ、たとえば１００時間も達成することができ
る。

一般的には４５〜８０時間の間中、反応させることが可
能である。

他の興味ある結果は、Ｌ−カルニチンの製造後も、使用
した酵素がその初期活性の大部分を保持することである
。

従って酵素は新しい製造に再び使用することができる。

好ましくは温度は３０℃を越えず、１０〜３０°Ｃの間
の範囲である。

本発明の方法に用いる酵素は従来から良く知られており
、従ってその製造について、ここに記述する必要はない
であろう。

ただ、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）はフルオ
レスセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　、セルギノー
サ（ｓｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびプチダ（ｐｕｔｉｄ
ａ）グループ（パストール研究所コレクションｌ１ｈＣ
ＩＰ５２１９１）のバクテリアＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏ培
養物の抽出物から得られることに注目すべきである。

デヒドロゲナーゼホルメート　（ＦＤＨ）は種々の微生
物から、特にＣａｎｄｉｄａ、　　Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ
。

Ｐｉｃｈｉａ、　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ等の族の酵母お
よびとりわけＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｄｉｉｎｉから既知
の方法で得ることができる。

デヒドロカルニチン（ＤＨＣ）の水溶液が１０℃以上の
温度で不安定であることから、全てのＤＨＣをＣＤＨ酵
素の溶液を含む反応器中に導入することは勧められない
。

好ましい操作の形態は、ＤＨＣ溶液を十分な低温下で、
たとえば０〜４℃の間で分離された貯蔵器に貯蔵し、反
応の速度に適合するある速度でのみ反応器中に次第に導
入することであり、この結果、ＤＨＣは実際には反応器
に導入される速度でＬ−カルニチンに変換される。

このことは、下記するように本発明の方法の好ましい形
態をもたらす。攪拌器および温度調節器の付いた反応器
に予め決定された容積の、約７のｐＨに適宜調整された
ＮＡＤＨおよび二つの酵素（ＣＤ　ＨおよびＦＤＨ）の
溶液が導入される。

次いで本発明によれば、その酵素溶液に少なくとも０．
２モルのイオン力を与えるように塩が添加される。

１０℃と３０℃の間、特に２０℃に保たれたこの溶液に
攪拌しながら、低温下に保存された特別の容器から導か
れたデヒドロカルニチン（ＤＨＣ）の水溶液が徐々に加
えられる。

少なくとも下記反応の速度をほぼ知って、ＤＨＣ溶液の
導入を、ＤＨＣまたは少なくともその大部分が溶液中に
導入される速度で変換されるように調節する。

ＣＤＨ ＤＨＣ＋　　ＮＡＤＩＩ　　−−÷　　Ｌ一方ルニチン
　十　ＮＡＤ　　　　　（２）好ましくは、ＤＨＣはそ
の塩酸塩ＤＨＣ−ＨＣＩまたは ＣＩ−ＭｅＪ”−ＧＨｚ−Ｃ−ＣＨｔ−ＣＯＯＨＩ の形であり、導入されたＤＨＣの酸度を中和するのに十
分な塩基溶液の量が同時に反応器中にそそぎ込まれる。

塩基溶液は、たとえばＮａＯＨ，ＫＯＨ，ＮａＣ００Ｃ
Ｈｓなどであり、より好ましくはアンモニアであり、こ
れは媒体のイオン力にとって極めて好ましいＮＨ４，Ｃ
Ｉを与える。

使用した水溶液中のＤＨＣ濃度は広い制限範囲にわたる
が、最もしばしばは０．２〜２モルの範囲である。

この要因の一つの理由は、イオン力の調整との関係にお
いて説明される。

全てのＤＨＣが反応器中に導入されたときに、形成され
たＬ−カルニチンの媒体含有量が決定される。次いで既
知の技術に従って、その分離、精製が行なわれる。

本発明を下記する非限定的実施例によって説明する。

実施例１ 下記成分を含む水溶液５０ｒｎｌを２５０ｃｃ容積の反
応器中に導入した。

Ｐｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａ　ｐｕｔｉｄａから導かれた、
比活性度５５υ／■を有するカルニチンデヒドロゲナー
ゼ酵素ＣＤＨの４０Ｕ。

ＮＡＤ”の２ミリモル。

Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｄｉｉｎｉ酵母（ＥＣ１，２，１
，２，；ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲＭＡＮＮＨＥＩＭにより
販売）から導かれたデヒドロゲナーゼホルメートＦＤＨ
の４０Ｕ。

リン酸塩ＮａｚＨＰＯａ／ＫＨｚＰＯ４（ｐ　Ｈ７，５
）の５０ミリモル。

ギ酸アンモニウムＨＣＯＯＮＨ，の１５０ミリモル。

クロラムフェニコールの６■。

この出発溶液中に、攪拌しながら１．２ｍ！／ｈの割合
いで下記水溶液をそそぎ込んだ。

ＤＨＣ塩酸塩の０．８モルおよびギ酸の０．８モル。

この水溶液は、この水溶液が４℃に保持されていた貯蔵
容器から導かれたものである。

反応器における温度は３０℃に調整した。

ＤＣＨ溶液の導入と同時に、反応媒体のｐＨを２　Ｎ　
ＮＨ，０１１溶液の注入によって７に調整した。

７０時間後、反応容器中の溶液の容積は１５〇−であり
、Ｌ−カルニチンの濃度は４２８ミリモルであった。

従って、操作バランスは下記のとおりである。

ＤＨＣの０．０６７２モルを使用。

Ｌ−カルニチンの０．０６４２モル（１０，３ｇ）が形
成され、収率は９６％。

この結果、下記のことが得られる。

初期イオン力　　０．２０モル 最終イオン力　　０．９６モル ＤＨＣのモル当りのＣＤＩ単位数　　５９５実施例２ 生物学的変換の過程中の容積増加限界を求めるために、
デヒドロカルニチン、ギ酸およびアンモニアのより高濃
度溶液を使用した。一方、ＮＡＤ”の濃度を低下させた
。

すなわち、５０ｍ／反応器に下記を含む溶液を仕込んだ
。

ＮａｚＨＰＯａ／に１１ｚＰＯ４５０ミリモル、ｐＨニ
ア、５゜ＮＡＤ”　０．２ミリモル。　ＨＣＯＯＮＨ第
１５０ミリモル。

クロラムフェニコール　６■。

概要を下記するようにして精製したＣ　Ｄ　Ｈの４０Ｕ
。

Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｄｉｉｎｉから導かれたＦ　Ｄ　
ＨＢＯＥＨＲＩＮＩＪＲ−ＭＡＮＮＨＥＩＭの２５Ｕ。

Ｐ、Ｐｕｔｉｄａから抽出されたＣＤＩを硫酸アンモニ
ウム（５５％飽和）で沈澱させ、遠心分離し、固形物を
再びｐＨ７，５の５０ミリモルリン酸塩緩衝液に再び溶
解させた。

得られた溶液を同一の緩衝液に対して１６時間透析した
。

共に１．６モルの濃度のデヒドロカルニチンおよびギ酸
を含む、４℃に保持された溶液を反応器に供給した。

供給割合は０．６ｍ（／ｈであった。

反応器の温度を３０℃に、また８Ｎアンモニアの制御さ
れた添加によってｐＨを７．５に保持した。４８時間後
に、最終容積９０ｍ１および５００ミリモルのＬ−カル
ニチン濃度または収率９８％が得られた。

初期イオン力　−一−−−−−−−・−・−・　０．２
０最終イオンカ　ｍ＝−−−−−−−−・−・・　１．
１３ＣＤＨ単位／ＤＨＣモル　−−−−−−−・・−・
　８６８実施例３ 下記の初期条件の溶液１１をはじめに用いて、Ｌ−カル
ニチンの合成を行なった。

ＮａＪＰ０４／ＫＨｚＰＯ４５０ミリモル、　ｐＨニア
、５゜ＨＣＯ□ＮＨ，１５０ミリモル。

ＮＡＤ　　　　　　　　Ｏ，６ミリモル。

り■ラムフェニコール　　　　　　　１２０■。

概略実施例２と同様にして精製したＣＤＨ８００Ｕ。

ＦＤＨ５００ＵまたはＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ−ＭＡＮＮ
ＨＥＩＭによって販売されたりイオフィリセート　（ｌ
ｙｏρｈｉ１ｉｓａｔｅ）７５０ｎｇ。

反応器に実施例１と同様の０．８モル溶液を０．４−７
分の割合いで供給した。反応器に取付けられた調整器を
用い、２ＮアンモニアによってｐＨを７．５に保った。

また温度を３０℃に維持した。機械的な撹拌によって反
応系を均一化した。

６７時間の後、３．２１の容積が得られ、３９０ミリモ
ルのＬ−カルニチン濃度または収率９７％が得られた。

この実施例においては、下記結果が得られた。

初期イオン力　−・−−−−−−−−−−−・−０，２
０最終イオンカ　−・・−・−・−一一一一一・　０．
８６ＣＤＩ車位／ＤＨＣモルの比率　・・−・−・６２
２反応器中定在在するＣＤＨの測定結果は、７０４Ｕま
たは８８％の残存活性を与えた。

ＦＤＨでは、測定結果は３８４Ｕまたは８０％の残存活
性を与えた。ＮＡＤ”は酵素手段によって全体としてＮ
ＡＤＨに変形され、次いで分光測光法によって３４０ミ
リモルと測定された。希釈を考慮すれば０．２ミリモル
が得られ、これは１００％の活性に相当する。

実施例４ １ｊ２の溶液から出発して、Ｌ−カルニチンの合成を下
記の初期条件で行なった。

リン酸塩緩衝液　５０ミリモル、　　ｐＨニア、５゜Ｈ
ＣＯ□Ｎ＋（、０，５モル。

ＮＡＤ　　　　　　　　Ｏ，４ミリモル。

ＣＤＩ＋　　８２００．実施例２のように精製。

ＦＤＩＩ　　５０３０．　Ｐｉｃｈｉａ　Ｐａ５ｔｏｒ
ｉｓの培養物から抽出し、硫酸アンモニウム（飽和の５
０％）で沈澱させ、遠心分離し、残渣を ｐＨ７，５のリン酸塩緩衝液の５０ミリモル中に再溶解
し、得られた溶液を同一 の緩衝液に対して１６時間、透析した。

反応器に実施例２と同じＤＨＣ溶液を１２ｍ／ｈの割合
いで供給した。

４９時間後に、１．７！Ｍの容積およびＬ−カルニチン
の５２６　ミリモル濃度または収率９８％が得られた。

ＣＤＩおよびＦＤＨについて残留活性を測定したところ
、４５９Ｕおよび１１１Ｕを夫々与えた。

この製造の間の反応媒体のイオン力は下記のとおりであ
った。

反応開始時　　　０．５０５ 反応終了時　　　１．３６３ またＣ　Ｄ　Ｈ／Ｄ　ＣＨモル比率は８７２単位１モル
であった。

この製造によって、最終液体容積のｌ当り、時間当り１
．７２ｇのＬ−カルニチンが得られた。

塩（ギ酸塩、リン酸塩、塩化アンモニウム）によって与
えられたイオン力は十分に高められて、全てのバクテリ
ア汚染を妨げ、クロラムフェニコールのような抗バクテ
リア剤なしで操作することができた。

実施例５ Ｌ−カルニチンのより高い最終濃度を得る目的で、下記
組成の溶液５０ｍ／をはじめに反応器に供給した。

リン酸塩緩衝液　５０ミリモル、　　ｐＨニア、５゜Ｎ
ＡＤ”　　　　　　　　０．４ミリモル。

ＨＣＯ，ＮＨ，０，５モル。

ＩＣＯ□ＮＨ４，０，５モル。

ＣＤＨ：実施例２におけるようにして精製した８０Ｕ。

ＦＤ）Ｉ　　Ｆ実施例４のようにして精製した５０Ｕ。

反応器に３．２モルのギ酸と混合した３、２モルのデヒ
ドロカルニチンの水溶液を時間当り０．５５−の割合い
で供給し、反応器中のｐＨをアンモニアによって７．５
に保持した。

４７時間後に８２ｒ１１１の最終容積および８８０ミリ
モルのＬ−カルニチン濃度または収率８７％が得られた
。

ＣＤＨおよびＦＤＨの活性は夫々２１Ｕおよび１０Ｕで
あった。

この試験におけるイオン力は初期に０．５０５モル、終
了期には２．３モルであった。

ＣＤＨ単位／ＤＨＣモルの比率は９６７であり、最終容
積のｌ当り時間当り３ｇが得られた。

この増加した生産性が収率のわずかな低下の犠牲で得ら
れることが確立された。

実施例４におけるように、全てのバクテリア汚染を防止
する、媒体のより高いイオン力によって抗バクテリア剤
を必要としないことが正当化された。

実施例６ ＤＨＣ＋ギ酸混合物の溶液を０．１モルのみとした以外
は実施例３と同様に操作をした。媒体のイオン力は希釈
が生物学的変換の間の塩の添加を埋め合わせたので、初
期における０、２０モルから、６７時間の反応後には０
．１６モルに変化した。

Ｌ−カルニチンの収率は６０℃以上ではなく、酵素の残
存活性は媒体の汚染によってゼロとなった。

生産量は最終容積のｌ当り０．０７ｇ／ｈであった。

実施例７ 初期ギ酸塩濃度を０．１５モルの代りに３．０モルとし
た以外は、実施例１と同様に反応を行なった。

ＤＨＣの溶液はＨＣＯＯＩ＋を含まなかった。

初期のイオン力３．０５モルは末期には３．４５モルに
変化した。収率は４０％であった。汚染は発生しなかっ
たが、ＣＤＨの活性はその初期値の１５％に低下した。

生産量は最終容積のｌ当り１．０３ｇ／ｈであった。

実施例のまとめ 下記の表に上述した実施例の主要結果をまとめた。

下記の略号を用いた。

Ｆ、ｉ、ｉ　　−・−・−ｌ当りのモルで示した初期イ
オン力。

Ｆ、ｉ、ｆ　　−−−−−−・−モルで示した最終イオ
ン力。

ＣＤＨ／ＤＨＣ−−−−−・ＤＨＣのモル当り用いたＣ
ＤＨの単位数。

Ｒｄｔ、％−・−・消費したＤＨＣに対するし−カルニ
チンの収率。

Ｐｒｏｄ、・−・−最終溶液のｌ当り、時間当り得られ
たＬ−カルニチンのダ ラム。

実施例ＮＩ　　　Ｆ、ｉ、ｉ　　　Ｆ、ｉ、ｆ　　　Ｃ
ＤＩＩ／ＤＩＩＣＲｄｔ、χ　　Ｐｒｏｄｌ　　　　０
．２０　　０．９６　　５９５　　９６　　０．９８２
　　　０．２０　　１．１３　　８６８　　９８　　１
．６７３　　　０．２０　　０．８６　　６２２　　９
７　　０．９３４　　　　Ｑ、５（１１，３６８７２９
Ｂ　　　１．７２５　　０．５０　２．３０　　．９６
７　　８７　　３．０６　　　０．２０　　０．１６　
　４９７５　　６０　　０．０７７　　　３．０５　　
３．４５　　５９５　　４０　　１．０３゛　実施例１
〜５は最適条件の場合を明らかに示し、一方、実施例６
および７はイオン力が極めて低い（実施例６）か、また
は極めて高い（実施例７）場合の収率の低下を示す。

一方、実施例５は操作の速度のある限界を示す。より急
速な生産（３ｇ／　１２　／ｈ）が収率（８７％）の低
下の犠牲において得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）の存在下に
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に
   よってデヒドロカルニチンを還元し、形成されたＮＡＤ
   ＾＋をデヒドロゲナーゼホルメート（ＦＤＨ）の作用下
   にホルメートによって還元するＬ−カルニチンの製造方
   法であり、反応媒体を構成する水溶液が少なくとも０．
   ５モルのイオン力を有することを特徴とするＬ−カルニ
   チンの改良された製造方法。 ２、反応媒体のイオン力が少なくとも操作の末期におい
   て０．６〜３モルである特許請求の範囲第１項記載のＬ
   −カルニチンの改良された製造方法。 ３、デヒドロカルニチンの水溶液が酵素の溶液中に次第
   にそそぎ込まれ、反応媒体が操作の初期において０．１
   〜０．４モルの、末期においては０．８〜２．５モルの
   イオン力を有する特許請求の範囲第１項記載のＬ−カル
   ニチンの改良された製造方法。 ４、イオン力が主としてギ酸アンモニウムによって形成
   される特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載
   のＬ−カルニチンの改良された製造方法。 ５、デヒドロカルニチンが塩酸塩の形において用いられ
   、反応媒体がアンモニアによって中和され、ギ酸の溶液
   がこの媒体にデヒドロカルニチンの溶液と同時にそそぎ
   込まれる特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または
   第４項記載のＬ−カルニチンの改良された製造方法。 ６、反応媒体が全体として用いられたデヒドロカルニチ
   ンのモル当り２００〜１０００単位のＣＤＨ酵素を含む
   特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項または
   第５項記載のＬ−カルニチンの改良された製造方法。 ７、デヒドロカルニチンの溶液が０．２〜２モルの濃度
   を有する特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
   項、第５項または第６項記載のＬ−カルニチンの改良さ
   れた製造方法。 ８、デヒドロカルニチンの溶液が酵素の溶液中に到着し
   た割合いでデヒドロカルニチンがＬ−カルニチンに変換
   される速度で、この溶液が酵素の溶液中にそそぎ込まれ
   る特許請求の範囲第７項記載のＬ−カルニチンの改良さ
   れた製造方法。