FR2605316A1 - Procede perfectionne de preparation de l-carnitine. - Google Patents
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Abstract
PROCEDE DE PREPARATION DE LA L-CARNITINE PAR REDUCTION DE LA DEHYDROCARNITINE AU MOYEN DE NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE (NADH), EN PRESENCE DE CARNITINE DESHYDROGENASE CDH, LE NAD FORME ETANT REDUIT PAR UN FORMIATE SOUS L'EFFET D'UNE FORMIATE DESHYDROGENASE FDH; LA SOLUTION AQUEUSE, CONSTITUANT LE MILIEU REACTIONNEL, PRESENTE UNE FORCE IONIQUE D'AU MOINS 0,5 M EN MOYENNE.
Description
L'invention concerne un procédé perfectionné pour la préparation de la carnitine1 c'est-à-dire de l'acide triméthylamino-4 hydroxy-3 butyrique, et en particulier de la L-carnitine, par voie biochimique. Ce procédé est décrit dans les exemples de la demande de brevet NO 86 04832 qui concerne la purification de la L-carnitine la présente division comporte des commentaires de ces exemples et les revendications des caractéristiques nouvelles qu'ils indiquent.
La carnitine est principalement employée pour des applications biologiques, notamment pharmacologiques, cosmétiques et alimentaires, en particulier comme stimulant de la sécrétion gastrique et pancréatique, ou comme antihyperlipoprotéinique. Comme les méthodes chimiques de sa préparation conduisent à des mélanges racémiques, alors que seul le stéréoisomère L est biologiquement actif, c' est surtout le procédé biochimique de préparation qui est intéressant, parce qu'il fournit l'isomère L. I1 est donc important de disposer d'un procédé de préparation permettant l'obtention économique de ce composé. C'est l'avantage intéressant qu'apporte le procédé suivant l'invention ; il permet de produire, par voie biochimique, la Lcarnitine avec bons rendements, pratiquement sans contamination par microorganismes.
Un procédé connu de préparation de la L-carnitine consiste à reduire la déhydrocarnitine au moyen du nicotinamide adénine dinucléotide réduit, NADH, en présence de l'enzyme carnitine déshydrogéna se (CDH) ; le NAD+ qui en résulte est réduit à son tour à l'état de NADH par un réducteur approprié, par exemple glucose, alcool, aldéhyde, dithionate de métal alcalin ou un formiate, en présence d'une déshydrogénase correspondante. Un tel procédé est notamment décrit dans le brevet français publié sous le NO 2 398 046.
En particulier la préparation de la L-carnitine est effectuée par l'action du nicotinamide adénine dinucléotide réduit, NDAH, sur la déhydrocarnitine, et réduction du NAD+ formé, au moyen du groupe formique avec de la formiate déshydrogénase FDH comme catalyseur ; un tel procédé est décrit dans l'exemple 5 du brevet précité.
Cependant la technique antérieure se prétait mal à des applications industrielles, surtout à cause de très fortes quantités d'enzymes qu'elle exigeait par mole de
L-carnitine à produire, et des productivités faibles par unité de capacité des réacteurs, par heure. L'utilisation de formiate comme réducteur du NARDS, tentante industriellement, a conduit jusqu'à présent à des rendements très bas, comme on peut le voir dans l'exemple 5 du brevet cité plus haut.
L-carnitine à produire, et des productivités faibles par unité de capacité des réacteurs, par heure. L'utilisation de formiate comme réducteur du NARDS, tentante industriellement, a conduit jusqu'à présent à des rendements très bas, comme on peut le voir dans l'exemple 5 du brevet cité plus haut.
La présente invention résulte de la constatation que le procédé biochimique susindiqué peut être réalisé avec des quantités d'enzymes considérablement réduites, ramenées à des proportions industriellement acceptables, si le milieu réactionnel contient des sels dissous, dont la concentration dépasse un certain minimum.
La présence d'une telle force ionique exerce un effet stabilisateur sur le système enzymatique présent, évitant sa contamination et destruction au cours de la réduction de la déhydrocarnitine.
Comme le montre l'analyse des exemples, donnée plus loin, le procédé suivant l'invention est caractérisé par le fait qu'au cours de la réaction le milieu aqueux, dans au cours ae bioconversion lequel elle a lieu, presente/une torce ionique moyenne a au moins 0,5 M et, plus particulièrement, 0,525 à 1,23 M dans la technique antérieure citée, elle ne dépasse pas 0,3 M.
Dans la forme de l'invention, où une solution de déhydrocarnitine est versée progressivement dans une solution des enzymes requises, et que - par conséquent - le volume du milieu réactionnel varie du début à la fin de l'opera- tion, la force ionique, variant en meme temps, doit atteindre les limites susindiquées au moins à la fin de la réaction. Quant au début, il peut n'y avoir, dans la solution des enzymes, que 0,1 à 0,5 M de sels ionisables.
La force ionique est obtenue, dans les exemples qui suivent, par la dissolution dans les liquides du milieu réactionnel de sels, notamment de chlorure et de formiate d'ammonium et de phosphates de métaux alcalins.
Comme il est commode d'employer la déhydrocarnitine sous la forme de chlorhydrate, la réalisation de la force ionique appropriée a été opérée par l'introduction d' une solution de base (ammoniaque), dans le milieu réactionnel, simultanément avec celle de la solution de déhydrocarnitine, ce qui donne lieu à la formation d'un sel, chlorure d'ammonium. La concentration en ions dans le milieu réactionnel dépend de celle du chlorhydrate de déhydrocarnitine dans la solution de cette dernière ; on peut donc agir sur la force ionique par l'ajustement de cette concentration ; ainsi les exemples montrent les concentrations de 0,8 M et 1,6 M.
Le résultat remarquable du réglage adéquat de la force ionique, suivant l'invention, est d'abord la possibilité de diminuer considérablement la proportion d' enzymes ; ainsi, au lieu des 3200 à 8700 unités de carnitine déshydrogénase (CDH) utilisée par mole de déhydrocarnitine traitée, dans les exemples du brevet français cité plus haut, il suffit de 180 à 900 unités, soit environ 5 à 10 fois moins, ce qui constitue un progrès technique très important. En outre, grace à la stabilité des enzymes assurée par la force ionique, on peut prolonger de beaucoup le temps de la réaction et arriver ainsi à des rendements beaucoup plus élevés que ne le permettait la technique antérieure. On peut également opérer sans antisepsie (exemple 4), la force ionique suffisante empêchant la prolifération de microorganismes.
La production horaire, par unité de volume de réacteur, est ainsi très fortement accrue.
Alors qu il n'était guère possible de laisser la réaction se poursuivre plus de 40 heures (exemples du brevet antérieur cité), la présente invention permet de dépasser largement 48 heures et atteindre par exemple 70 heures.
Un autre résultat intéressant est que les enzymes employées conservent encore la majeure partie de leur activité initiale, après une préparation de L-carnitine (dernières lignes de l'exemple 4) ; elles peuvent donc etre réutilisées pour une nouvelle opération.
Etant donné la fragilité des solutions aqueuses de déhydrocarnitine (DHC) aux températures supérieures à 100C, il n'est pas recommandable de mettre d'emblée la totalité de DHC dans le réacteur contenant une solution d'enzyme CDH. Aussi le mode opératoire décrit ici consiste-t-il à conserver la solution de DHC dans un réservoir à part, à température suffisament basse, par exemple à 40C, et n'en introduire progressivement, dans le réacteur, qu'un certain courant compatible avec la vitesse de réaction.
Cela conduit à la forme d'exécution du procédé de 1' invention décrite dans les exemples. Dans un réacteur, muni de moyens d'agitation et de réglage de la température, on introduit un volume déterminé d'une solution de
NADH et des deux enzymes, CDR et FDH, convenablement tamponnée à un pH voisin de 7. On y ajoute également, selon l'invention, un sel de manière à ce que la force ionique de la solution d'enzymes soit d'au moins 0,2 M. A cette solution maintenue à 300C, on ajoute progressivement, sous agitation, une solution aqueuse de déhydrocarnitine, venant d'un réservoir spécial où cette solution de DHC est stockée à plus basse température.
NADH et des deux enzymes, CDR et FDH, convenablement tamponnée à un pH voisin de 7. On y ajoute également, selon l'invention, un sel de manière à ce que la force ionique de la solution d'enzymes soit d'au moins 0,2 M. A cette solution maintenue à 300C, on ajoute progressivement, sous agitation, une solution aqueuse de déhydrocarnitine, venant d'un réservoir spécial où cette solution de DHC est stockée à plus basse température.
La DHC étant sous la forme de son chlorhydrate DHC.HCl, soit
on fait couler simultanément, dans le réacteur, un débit de solution basique, juste pour neutraliser le HCl de la
DHC introduite ; la solution basique, selon les exemples donnés est de l'ammoniaque qui donne du NH4Cl favorable à la force ionique du milieu.
on fait couler simultanément, dans le réacteur, un débit de solution basique, juste pour neutraliser le HCl de la
DHC introduite ; la solution basique, selon les exemples donnés est de l'ammoniaque qui donne du NH4Cl favorable à la force ionique du milieu.
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs donnés ci-après.
EXEMPLE 1
La préparation de la L-carnitine est effectuée par l'action du nicotinamide adénine dinucléotide réduit,
NADH, sur la déhydrocarnitine, et réduction du NAD+ formé, au moyen du groupe formique avec de la formiate déshydrogénase FDH comme catalyseur.
La préparation de la L-carnitine est effectuée par l'action du nicotinamide adénine dinucléotide réduit,
NADH, sur la déhydrocarnitine, et réduction du NAD+ formé, au moyen du groupe formique avec de la formiate déshydrogénase FDH comme catalyseur.
(L-Carnitine) CDR = carnitine déshydrogénase
La CDR utilisée provenait d'un extrait de culture de Pseudomona putida. Elle était précipitée au sulfate d'ammonium à 250 g par litre d'extrait brut (55% de la saturation).
La CDR utilisée provenait d'un extrait de culture de Pseudomona putida. Elle était précipitée au sulfate d'ammonium à 250 g par litre d'extrait brut (55% de la saturation).
Le culot, obtenu à partir de 20 ml d'extrait, était redissous dans 7 ml de tampon de Na2HP04/KH2P04 50mld de pH=7,0, la solution passée sur gel filtration (G200), puis chromatographiée sur 5'AMP - Sépharose 4B (enzyme fixée par affinité puis éluée avec NAD lOmM) et enfin passée sur gel filtration ACA 44 pour récupérer l'enzyme dépourvue de NAD et du NaN3 (lequel avait été mis dans les tampons d'élution pour se protéger des contaminations).
L'enzyme pure, ainsi obtenue, avait une activité spécifique de 55 U/mg ; on en a introduit 40 U dans un réacteur de 50 ml.
Ce réacteur contenait en outre : 2mM de NAD+, 150 mM de
HC02NH4 , 6 mg de chloramphénicol et 40 U soit 60 mg de lyophilisat commercial de formiate déshydrogénase, FDH, provenant de la Candida bodiini (EC 1.2.1.2. -- commercialisée par BOEHRINGER MANNHEIM).
HC02NH4 , 6 mg de chloramphénicol et 40 U soit 60 mg de lyophilisat commercial de formiate déshydrogénase, FDH, provenant de la Candida bodiini (EC 1.2.1.2. -- commercialisée par BOEHRINGER MANNHEIM).
Le réacteur était alimenté par une solution maintenue à 40C, contenant du chlorhydrate de déhydrocarnitine cristallisé, dissous à la concentration 0,8 M, ainsi que de l'acide formique à 0,8 M. Le débit d'injection était de 1,2 ml/h. La température dans le réacteur était réglée à 300C et le pH maintenu à 7,0 par addition d'ammoniaque 2 N contrôlée par un système de régulation de pH.
Après 230 h on a atteint un volume final de 315 ml et une concentration en L-Carnitine de 477 mM correspondant à un rendement de 98%.
EXEMPLE 2 (Comparatif)
Toutes les opérations de l'exemple 1 sont répétées avec la seule différence que la FDH employée provenait de la levure Torulopsis candida (GFP 206) comme décrit dans l'exemple 5, page 8, du brevet français 2 398 046.
Toutes les opérations de l'exemple 1 sont répétées avec la seule différence que la FDH employée provenait de la levure Torulopsis candida (GFP 206) comme décrit dans l'exemple 5, page 8, du brevet français 2 398 046.
Le rendement en L-carnitine purifiée était alors de 58% seulement, et la pureté du produit final n'était que de 92%. Cela montre l'intérêt de la FDH provenant de la
Candida bodiini, correspondant à la forme préférée de la présente invention.
Candida bodiini, correspondant à la forme préférée de la présente invention.
EXEMPLE 3
Cherchant à limiter l'augmentation de volume au cours de la bioconversion, on a mis en oeuvre des réactifs en solutions plus concentrées en déhydrocarnitine, acide formique et ammoniaque. D'autre part, on a réduit la concentration en NAD+.
Cherchant à limiter l'augmentation de volume au cours de la bioconversion, on a mis en oeuvre des réactifs en solutions plus concentrées en déhydrocarnitine, acide formique et ammoniaque. D'autre part, on a réduit la concentration en NAD+.
Ainsi a-t-on chargé dans le réacteur 50 ml de solution contenant
Na2H04/KH2P04 50 mM pH : 7,5
24L
NAD+ 0,2 mM
6 mg chloramphénicol
40 U de CDR sommairement purifiée comme décrit ci
après
25 U de FDH BOEHRINGER-MANNHEIM provenant de la
Candida bodiini.
Na2H04/KH2P04 50 mM pH : 7,5
24L
NAD+ 0,2 mM
6 mg chloramphénicol
40 U de CDR sommairement purifiée comme décrit ci
après
25 U de FDH BOEHRINGER-MANNHEIM provenant de la
Candida bodiini.
La CDH, extraite de P. Putida, avait été précipitée au sulfate d'ammonium (55% de la saturation), centrifugée et le culot redissous dans le tampon phosphate 50 mM pH : 7,5 ; la solution obtenue dialysée pendant 16 h contre ce même tampon.
Le réacteur était alimenté avec une solution maintenue à 40C, contenant la déhydrocarnitine et l'acide formique à la concentration, l'un et l'autre, de 1,6 M. Le débit était de 0,6 ml/h. La température du réacteur maintenue à 300C et le pH 7,5 par addition contrôlée d' ammoniaque 8N. Après 48 heures, on atteint un volume final de 90 ml et une concentration en L-Carnitine de 500 mM, soit un rendement de 98%.
La purification, effectuée comme dans l'exemple 1, donne le même résultat.
EXEMPLE 4
Le même essai que dans l'exemple 3 a été mené avec de la FDH de Pichia Pastoris avec les modifications suivantes
NAD 0,4 mM
HC02NH4 500 mM absence de chloramphénicol qui a été omis, parce que la forte salinité dûe à la concentration initiale élevée en formiate d'ammonium limite les risques de contamination.
Le même essai que dans l'exemple 3 a été mené avec de la FDH de Pichia Pastoris avec les modifications suivantes
NAD 0,4 mM
HC02NH4 500 mM absence de chloramphénicol qui a été omis, parce que la forte salinité dûe à la concentration initiale élevée en formiate d'ammonium limite les risques de contamination.
FDH extraite d'une culture de Pichia Pastoris précipitée au sulfate d'ammonium (50% de la saturation), centrifugée et le culot redissous dans du tampon phosphate 50 mM pH 7,5 , la solution obtenue dialysée 16 heures contre ce tampon.
Les autres paramètres du réacteur étaient ceux de l'exemple 3.
Après 49 h le volume final est de 60 ml et la concentration en L-carnitine de 700 mM ce qui correspond à un rendement de 93%.
Le dosage des enzymes a montré une activité résiduelle de 90% en CDR et de 90% en FDH.
La purification de la L-carnitine obtenue, effectuée de la même façon qu'à l'exemple 1, a donné le même résultat; il en résulte que la FDH de la Pichia pastoris donne des résultats équivalents à ceux de la FDH de Candida bodiini, bien meilleurs des résultats obtenus avec la FDH de Torulopsis candida (exemple 2).
ANALYSE DES RESULTATS
Calcul de la force ionique pour l'exemple 1. Puisque la solution 0,8 M de chlorhydrate de DHC (déhydrocarnitine) fut débitée à raison de 1,2 ml/h, pendant 230 heures, le nombre de moles DRC total, utilisé, était (0,8 x 1,2 x 230) : 1000 = 0,2208 mol
Il y avait donc autant de moles HCl et autant de NH40H employées pour neutraliser ce HCl.
Calcul de la force ionique pour l'exemple 1. Puisque la solution 0,8 M de chlorhydrate de DHC (déhydrocarnitine) fut débitée à raison de 1,2 ml/h, pendant 230 heures, le nombre de moles DRC total, utilisé, était (0,8 x 1,2 x 230) : 1000 = 0,2208 mol
Il y avait donc autant de moles HCl et autant de NH40H employées pour neutraliser ce HCl.
D'autre part, la solution de DRC était également 0,8 M en l'acide formique , ainsi a-t-on introduit dans le réacteur, avec la DHC
0,2208 mole de NH4Cl et
0,2208 " " NH400CH (formiate de NH4)
soit 0,4416 " " de sels
Le volume final étant de 315 ml, la force ionique finale, en moles par litre, était
(0,4416 : 315) x 1000 = 1,402 M.
0,2208 mole de NH4Cl et
0,2208 " " NH400CH (formiate de NH4)
soit 0,4416 " " de sels
Le volume final étant de 315 ml, la force ionique finale, en moles par litre, était
(0,4416 : 315) x 1000 = 1,402 M.
La concentration en sels initiale (formiate d'ammonium 150 ml4) ayant été de 0,15 M dans 50 ml, sa part à la fin, dans les 315 ml, ressort à
(0,15 x 50) : 315 = 0,024 M.
(0,15 x 50) : 315 = 0,024 M.
Ainsi avait-on en fin d'opération
1,402 + 0,024 = 1,426 M
contre 0,15 M au début.
1,402 + 0,024 = 1,426 M
contre 0,15 M au début.
On a donc travaillé avec
une force ionique initiale F.i.i. de 0,15 M I' II " finale F.i.f. " 1,426 M soit " " " moyenne F.i.m. " 0,788 M
Calcul du nombre d'unités d'enzyme CDR utilisées par mole de DHC convertie
Le réacteur contenait 40 U de CDH, et on a traité, comme calculé plus haut, 0,2208 moles de chlorhydrate de déhydrocarnitine DHC.
une force ionique initiale F.i.i. de 0,15 M I' II " finale F.i.f. " 1,426 M soit " " " moyenne F.i.m. " 0,788 M
Calcul du nombre d'unités d'enzyme CDR utilisées par mole de DHC convertie
Le réacteur contenait 40 U de CDH, et on a traité, comme calculé plus haut, 0,2208 moles de chlorhydrate de déhydrocarnitine DHC.
Le rapport Unités CDH/mole DHC était donc de 40 : 0,2208 = 181.
Récapitulation des exemples
En répétant les calculs exposés ci-dessus pour les exemples 3 et 4 (exemple 2 était semblable à 1), ainsi que pour l'art antérieur, représenté par l'exemple 5 du brevet 2 398 046, on arrive aux résultats réunis dans le tableau suivant.
En répétant les calculs exposés ci-dessus pour les exemples 3 et 4 (exemple 2 était semblable à 1), ainsi que pour l'art antérieur, représenté par l'exemple 5 du brevet 2 398 046, on arrive aux résultats réunis dans le tableau suivant.
Exemple F.i.i F.i.f F.i.m CDH/DHC Rendement
1 0,15 1,426 0,788 181 98%
3 0,05 1,051 0,525 867 98%
4 0,50 1,960 1,230 425 93%
Art anté- 0,25 0,30 0,28 8700 14% rieur
1 0,15 1,426 0,788 181 98%
3 0,05 1,051 0,525 867 98%
4 0,50 1,960 1,230 425 93%
Art anté- 0,25 0,30 0,28 8700 14% rieur
Claims (8)
1. Procédé de préparation de la L-carnitine par réduction de la déhydrocarnitine au moyen de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), en présence de carnitine déshydrogénase (CDH), le NAD formé étant réduit par un formiate sous l'effet d'une formiate déshydrogénase (FDH), caractérisé en ce que la solution aqueuse, constituant le milieu réactionnel, présente,au cours de bioconversion, une force ionique d'au moins o,5 M en moyenne.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la force ionique du milieu réactionnel est de 1,05M à 1,96 M au moins à la fin de l'opération.
3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel une solution aqueuse de déhydrocarnitine est versée progressivement dans une solution des enzymes, caractériséen ce que le milieu réactionnel présente une force ionique de 0,05 à 0,5 M au départ et 1,05 à 1,96 à la fin de l'opération.
4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la force ionique est formé principalement par du formiate d'ammonium.
5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, dans lequel la déhydrocarnitine est prise sous la forme de chlorhydrate, le milieu réactionnel étant neutralisé avec de l'ammoniaque, caractérisé en ce qu'une solution d'acide formique est versé dans ce milieu en même temps que la solution de déhydrocarnitine.
6. Procédé. suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu réactionnel contient 180 à 870 unités d'enzyme CDR par mole de déhydrocarnitine employée au total.
7. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de déhydrocarnitine a une concentration de 0,8 à 1,6 M.
8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que cette solution est versée dans la solution des enzymes en 48 à 230 heures.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8703878A FR2605316B1 (fr) | 1986-04-04 | 1987-03-20 | Procede perfectionne de preparation de l-carnitine. |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR868604832A FR2596756B1 (fr) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | Procede de purification de la carnitine |
FR8703878A FR2605316B1 (fr) | 1986-04-04 | 1987-03-20 | Procede perfectionne de preparation de l-carnitine. |
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FR2605316A1 true FR2605316A1 (fr) | 1988-04-22 |
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FR8703878A Expired - Fee Related FR2605316B1 (fr) | 1986-04-04 | 1987-03-20 | Procede perfectionne de preparation de l-carnitine. |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2398046A1 (fr) * | 1977-07-18 | 1979-02-16 | Inst Francais Du Petrole | Synthese enzymatique de la l-carnitine |
-
1987
- 1987-03-20 FR FR8703878A patent/FR2605316B1/fr not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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FR2398046A1 (fr) * | 1977-07-18 | 1979-02-16 | Inst Francais Du Petrole | Synthese enzymatique de la l-carnitine |
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