JPS62253379A - 脱側鎖酵素製品、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプルラナーゼ型の新規なデブランチング（脱側
鎖）酵素を含む脱側鎖酵素製品、その製品の製法、なら
びにその製品を用いてデンプンをグルコース及び／また
はその他の糖に糖化する方法に関する。

近年、デンプンを酵素作用により加水分解して糖含有シ
ロップ、殊にグルコース含有７０ンプとする方法に多大
な注意が向けられてきている。そのよ゛うなデンプンの
酵素加水分解の効率的方法の開発に可成りの研究努力が
なされてきている。

デンプンは、実質的には、アルファ１，４−グリコシド
９結合によりグルコース単位が鎖状に結合したものであ
り、そのアルファ１，４−グリコシド結合により側鎖が
形成されている。デンプンの酵素加水分解に一般的に用
いられている方法においては、液化及び糖化の逐次工程
が、それぞれアルファ・アミラーゼ酵素及びグルコアミ
ラーゼ酵素を用いて実施される。アルファ・アミラーゼ
は、１．４−グリコシド結合を破壊してオリゴサツカラ
イドを生じさせ、一方グルコアミラーゼはそのようなオ
リゴサツカライド９中の１，４−グリコシド結合を破壊
して個々のグルコース分子を生じさせる。

しかし、アルファ・アミラーゼはアルファー１，６−グ
リコシト９結合を破壊せず、アルファー１．６−グリコ
シド結合はグルコアミラーゼでゆっくつト破壊されるに
すぎない。β−アミラーゼは、マルトースを生成させよ
うとするときに、グルコアミラーゼの代りに使用される
。このようにすると、グルコース分子以外に、アルファ
ー１，６−グリコシド結合により形成された側鎖を含有
する小群のグルコース単位をも含む製品がもたらされる
。

１．６−結合の完全な加水分解を達成するために反応時
間を長くしたり、グルコアミラーゼの濃度を増加するな
らば、イソマルトースのような縮合生成物の形成の望ま
しくない結果となり、従ってこのような手段ではグルコ
ースの収率を向上させることができない。縮合生成物の
形成は、デンプンをグルコースに転化する際の方法の効
率を低下させる。グルコース生産者は迅速な消化及びグ
ルコースの最大の可能収率な望むから、縮合生成物の形
成は重大な不利、欠点である。

プルラナーゼは、プルラン中のアルファー１．６−グリ
コシド結合を破壊しうる酵素である。デンプンをアルフ
ァ・アミラーゼで処理し、次いでグルコアミラーゼとプ
ルラナーゼとの組合せで処理して、グルコースに転化す
ることが提案されてきている。この方法は、プルラナー
ゼがオリゴサツカライド９中のアルファー１．６−グリ
コシド結合を一層効率的に破壊するので、アルファ・ア
ミラーゼにより作られたオリゴサツカライドを一層効率
的にグルコース分子へ転化することとなろう。米山特許
第３８９７３０５号明細書には、グルコアミラーゼの使
用を、アエロバクチル・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）　（クレブシェラ・シュ
ウモニアエ：　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）の使用と組合せて実施する方法が提案されてい
る。しかし、この方法の重大な欠点は、提案された特定
のプルラナーゼ酵素についての最適の温度及びｐＨの操
作条件がそれぞれ６０℃以下及びｐＨ７であり、一方グ
ルコアミラーゼについての最適ｐＨがｐＨ４〜ｐＨ５で
あることである。雑菌汚染を防止するには糖化工程度を
６０℃（またはそれよりもわずかに高い温度）で実施す
るのが望ましい。英国特許第２０９７４０５号明細書に
は、バシルス・アシビプルリチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）から誘導され
たプルラナーゼを用いてデンプンをグルコース及び／ま
たはその他の簡単な糖に転化する方法が提案されており
、この方法に使用されるプルラナーゼについての最適の
温度及び…の操作条件は前述のものよりも好適であるこ
とが強調されている。

本発明によれば、 （ａ）　　Ｎ　Ｃより第１２２３５号菌株から誘導され
、あるいはＮＣＩＢ第１２第１２丹３５ 側鎖酵素の酵素化学的性質と実質的に同じ酵素化学的性
質を示し、 （’ｂＪ　　４〜５の範囲内の聞及び５５〜６５℃の範
囲内の温度において最適活性を示し、そして（Ｃ１　　
アクチノマイセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅ
ｓ　）目に属する細菌の菌株を適切な栄養培地で培養す
ることにより作られる培養物から得られる、プルラナー
ゼ型の新規脱側鎖酵素を含む脱側鎖酵素製品が提供され
る。

さらに、本発明によれは、ＮＣより第１２２３５菌株か
ら誘導され、またはＮＣより第１２２３５号菌株から誘
導された脱側鎖酵素の酵素化学的性質と実質的に同じ酵
素化学的性質を示し；そして４〜５の・範囲内のｐＨ及
び５５〜６５℃の範囲内の温度において最適活性を示す
：プルラナーゼ型の脱側鎖酵素を含む脱側鎖酵素製品の
製法であって：アクチノマイセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔａｌｅＦり目に属する細菌の菌株を、炭素源及
び無機栄養源を含む適当な栄養培地中で、該脱側鎖酵素
の産生に適当な条件下で培養し、そして該脱側鎖酵素製
品を回収することからなる上記製法を提供する。

さらに本発明によれば、デンプンまたはデンプン加水分
解生成物を糖化して糖含有シロップを製造する方法であ
って、デンプンまたはデンプン加水分解生成物をグルコ
アミラーゼまたはベータ・アミラーゼで処理する工程を
含み、その工程の前またはその工程中に、デンプンまた
はデンプン加水分解生成物を；ストレプトマイセス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｍｙ−ｃｅｓ）属に属する細菌の菌株を炭素
源及び無機栄養源を含む適当な栄養培地中で脱側鎖酵素
の産生に適当な条件下で培養することにより産生され、
４〜６の範囲内の−及び５５〜６５℃の範囲内の温度で
最適活性を示すプルラナーゼ型の脱側鎖酵素を含む脱側
鎖酵素製品で、処理することを特徴とする上記糖化方法
も提供される。

さらに本発明は、ＮＣＩＢ第１２第１２母３５変異体の
生物学的に純粋な培養物も提供される。

本発明の糖化方法は、ストレプトマイセス属のいずれか
の適当な細菌菌株から誘導された脱側鎖酵素製品を用い
て実施することができる。特に適当な菌株は我々が葉脈
（リーフ・リンター）から単離した新規なストレプトマ
イセスであり、その培養物はＮＣＩＢ、受託番号第１２
２３５号として英国スコツトランド９、アバディーンの
トーリイ・リサーチ・ステーションの「す・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・ア／ビ・マ
リーン・バクテリア（ＮＣ工ＭＢ）　Ｊに１９８６年３
月２７日に寄託されている。この新規菌株はｐＨ　５及
び６０℃でプルラン（Ｐｕ１１ｕｌａｎ）で生胃し、プ
ルラナーゼ活性を示す。

ストレプトマイセス菌株ＮＣより第１２２３５号の性質
は下記の通りである。

形態学的性質 コロニイ、クリーム状、散在高所菌糸、灰／白色高所胞
子マス。

分解試験 陽：ゼラチン、ヒｙｔ？キサンチン、Ｔｗｅｅｎ　２０
　、　４　０及び６０、チロシン 陰：エラスチン、キサンチ／ 利用性（唯一の炭素源として） １０ｇ／ｆｆｉ 陽：Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコ
ン酸、Ｄ−グルコサミンＨ（Ｊ。

Ｄ−グルコース、Ｄ−ラクトース、マルトース、Ｄ−メ
ソビオース、グリセロール、グリコゲン、Ｄ−ラフィノ
ース、Ｄ−トレハロース。

陰＝Ｄ−アミグダリン、メソ−エリトリット、メン−イ
ノシトール、イヌリン、Ｄ−メレシトース、α−メチル
−Ｄ−グルコシドゝ、Ｌ−ラムノース、Ｄ−リボース、
Ｄソルビトール。

１９＃！ 陽：Ｌ−アラミン、Ｌ−アスパルチ／酸、Ｄ−グルタミ
ン酸、Ｌ−イソ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、ス
クシン酸ナトリウム。

陰：アセトアミド、アジピン酸、プロパン−１−オール
、シュウ酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ピバ
リン酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、 １９／旦 ！：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン。

陰：アセトアミド、ヒプリン酸ナトリウム。

耐性：ゲンタマイシンサルフェートＣ３２、リンコマイ
シン塩酸（１阻ネオマイシンサルフェ−）（３２、オレ
アンビマイシンボスフェート（４）、ペニシリンＧ（ナ
トリウム塩、２）、ストレフトマイシンサルフェート（
４）、トブラマイシンサルフェート（３ｚ０ 感受性：セファロリジン塩酸（２）、クロルテトラサイ
クリン塩酸（２）、ビメクロサイクリン（２）、オレア
ンビマイシンホスフェート（３３、ペニシリンＧ（ナト
リウム塩、１６）、リファンピシン（４）、バンコマイ
シン塩酸（２）。

生育 ｐＨ４，５〜６において１０℃、１５℃及び３０℃。

生育：下記の成分（μ９／ｒｔｔｌ）の存在下硫酸銅ａ
■、クリスタルバイオレット（１）、硫暇第−鉄６０１
、酢酸鉛（９）、硫酸マンガン（９）、チルリン酸カリ
ウムら■。

菌株ＮＣＩＢ第１２２３５号のために適当な生育培地は
下記の組成をもつ（濃度は特記した場合を除きｇ／ρ）
： に２Ｓｏ４ｏ、■ Ｋ　ＨＰ○　　　　　　　　　　　　０．３Ｆ　ｅ　Ｓ
Ｏ４０，０５ 「ディ７：＋（Ｄｉｆｃｏ）Ｊカシトーン２．０「オキ
ソイド（Ｏｘｏｉａ）Ｊ酵母エキス　　　　１．０１．
１Ｍ燐酸　　　　　　　　　　１１．２だ２ＭｇＳＯ４
−７Ｈ２００，８ 微量金属溶液　　　　　　　　　１８だｌマルトース　
　　　　　　　　　１５ｍ／水酸化アンモニウムの添加
によりｐＨを４．５に調節した。寒天を１５９／ｆｆｉ
の量で添加して固型培地とした。

上記の培地以外に、菌株ＮＣより第１２２３５号は、グ
ルコース、マルトースまたはデンゾ／をカシトーン及び
酵母エキスと一緒に添加した場合には、はとんどの塩溶
液で生育しうると信じられる。

本発明の糖化方法は、グルコース含有シロップ、すなわ
ち主たる糖成分としてグルコースを含むシロップを製造
するのに使用するのが好ましい。しかし、本発明方法は
、主たる糖成分としてその他の糖、殊にマルトースを含
むシロップを製造するのにも使用できる。（もしマルト
ースが主要生成物であるときには）、新規脱側鎖酵素及
びグルコアミラーゼまたはベータ・アミラーゼでの処理
の前に、デンプンを液化工程に付してデンプン加水分解
物を作るのが好ましい。デンプンまたはデンプン加水分
解物は、グルコアミラーゼまたはイータ・アミラーゼで
の処理の前に、新規脱側鎖酵素で処理しうるが、好まし
くは、脱側鎖酵素及びグルコアミラーゼまたはベータ・
アミラーゼで同時に処理される。本発明方法の好ましく
・操作様式においては、デンプンを最初にアルファ・ア
ミラーゼで処理し、得られる加水分解物を次いでグルコ
アミラーゼまたはイータ・アミラーゼ、及び本発明の新
規脱側鎖酵素で一緒に処理する。好ましくは、グルコア
ミラーゼ、またはば−タ・アミラーゼと、本発明の新規
脱側鎖酵素とは、少なくとも３０重量％の乾燥固形分含
量のデンプン加水分解物の処理に使用する。好ましくは
、糖化は５５〜６５℃の範囲内の温度及び４〜５の範囲
内の−で行なう。最も好ましい温度の範囲は５５〜６０
℃であり、この場合には、この範囲内の温度で最適活性
を有する酵素を使用する。

好ましくは、使用アルファ・アミラーゼ酵素はバシルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株から誘導される。好ましい
グルコアミラーゼ酵素は菌類菌株から誘導されるが、ベ
ータ・アミラーゼ酵素は麦芽から、または細菌源から誘
導できる。

実施例１ １００　ｍＭの酢酸塩緩衝剤及び５ｍＭの塩化カルシウ
ムを含む液中の市販液化デンプン（１’−Ｍａｌｄｅｘ
　１５　Ｊ　：商標）の３０％ｗ／ｗ溶液に、グルコア
ミラーゼ（デンプン１ｇ当り０，９μＱの「０ｐｔｉｄ
ｅｘ　２００４Ｌ　Ｊ　：商標）及び本発明のプルラナ
ーゼ（デンプン１ｇ当り１単位）を添加して、６０℃及
びｐＨ４，２でインキュイードした。７２時間に至るま
で時々試料を採取して、グルコース濃度（全糖に対する
チ）を高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により測
定した。結果を添度図に示す。

この図においてこれらの測定値は四角形の点のグラフ曲
線である。この図はグルコアミラーゼを単独で用いた場
合の比較実験で得られた結果（黒丸点のグラフ曲線）、
バシルス・アシビプルリチクス（Ｂ　、　ａｃｉｄｏｐ
ｕｌｌｕｌｙｔｉｃ日）から得られた、プルラナーゼ（
本発明のものと同じ活性を有す）を用いた場合の結果（
悪玉角点のグラフ曲線）も示して〜する。

この図は、本発明のプルラナーゼの使用によって、最高
プルコース濃度の約１．５チの増加が得られ、この最高
濃度は、プルラナーゼを用いない場合またはパシルス・
アシビプルリチクスからのプルラナーゼを用いた場合の
４８〜７２時間ではな（、約２４時間で達成されること
を示している。

バシルマ・アンドブルリチウスからのプルラナーゼはこ
の実施例での条件下で効率が悪（、グルコース産生収率
は、プルラナーゼを用いない場合よりも、わずかに良い
値であるにすぎない。

実施例２ 実施例１に記載のものと同様な一連のインキュベーショ
ンを実施した。この場合の唯一の相異点は、聞を４．５
に上昇させたことであった。プルラナーゼを用いないで
得られた結果及び本発明のプルラナーゼを用いて得られ
た結果は、実施例１のものと同様であった。しかし本例
の高い…値において、バシルス・アシビプルリティクス
からのプルラナーゼは、本発明のプルラナーゼを用いて
得た結果と比肩しうる結果をもたらした。

実施例３ 実施例１に記載のものと同様な一連のインキュは−ショ
クを実施した。唯一の相異は、−を４．０にまで低下さ
せたことであった。この低い−値でバシルス・アシド９
プルリテイクスからのプルラナーゼを用いての結果は、
プルラナーゼを用いない場合の結果と同じであった。本
発明のプルラナーゼは最高ダルコース収率の約１．１チ
の増加をもたらした。その最大値は３６〜４８時間の間
で達成された。

実施例４ １００　ｍＭの酢酸塩緩衝剤と５ｍＭの塩化カルシウム
とを含む液中の市販液化デンプン（「Ｍａｌｄｅ：ｃ　
１５　Ｊ　：商標）の３０１　ｗ／ｗ　　溶液を、大麦
イータ・アミラーゼ（デンプン１ｇ当１：）Ｑ、７５ｔ
ｔｌ　）　（「Ｓｐｅｚｙｍｅ　ＢＢＡ　　１５００　
ｊ　：市販品）及び本発明のプルラナーゼ（デンプン１
ｇ当り１単位）と共に６０℃で−５，０においてインキ
ュー＜−）　した。このインキ：Ｌ”？−シコン開始６
時間後に、アル７７−アミラーゼ（市販品「Ｏｐｔｉｔ
ｈｅｒｍ　２４２０　Ｊを基質（デンゾ／）１ｇ当り０
．５μＩの割合比で添加した。７２時間に至るまで時々
試料を採取して、ＨＰＬＣによって試料の組成を測定し
た。プルラナーゼを用いない比較試験、及びバシルス・
アシビプルリチクスからのプルラナーゼを用いての比較
試験も実施した。すべての場合に２４時間を経過すると
、生成物の組成にはさらに変化が生じないことが判った
。結果を下表に示す。この表には２４時間の時点の組成
（炭水化物）を示しである。これらの結果は、両者のプ
ルラナーゼが液化デンプン乞消化してマルトースを作る
際には同等な促進効果を示すことを明かにしている。

表

【図面の簡単な説明】

図面は実施例１の結果を示すグラフであり、横軸は時間
（ｈｒ）、縦軸はグルコース濃度（チ）である。 （外５名）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）ＮＣＩＢ第１２２３５号菌株から誘導され
   、あるいはＮＣＩＢ第１２２３５号菌株から誘導された
   脱側鎖酵素の酵素化学的性質と実質的に同じ酵素化学的
   性質を示し、 （ｂ）４〜５の範囲内のｐＨ及び５５〜６５℃の範囲内
   の温度において最適活性を示し、そして（ｃ）アクチノ
   マイセタレス目に属する細菌の菌株を適切な栄養培地で
   培養することにより作られる培養物から得られる、 プルラナーゼ型の脱側鎖酵素を含む脱側鎖酵素製品。
2. （２）ＮＣＩＢ第１２２３５号菌株、またはその菌株か
   ら誘導された変種もしくは突然変異体、の純粋培養物。
3. （３）ＮＣＩＢ第１２２３５号菌株から誘導され、また
   はＮＣより第１２２３５号菌株から誘導された脱側鎖酵
   素の酵素化学的性質と実質的に同じ酵素化学的性質を示
   し；そして４〜５の範囲内のｐＨ及び５５〜６５℃の範
   囲内の温度において最適活性を示す；プルラナーゼ型の
   脱側鎖酵素を含む脱側鎖製品の製法であって；アクチノ
   マイセタレス目に属する細菌の菌株を、炭素源及び無機
   栄養源を含む適当な栄養培地中で該脱側鎖酵素の産生に
   適当な条件下で培養し、そして該脱側鎖酵素生成物を回
   収することからなる上記製法。
4. （４）デンプンまたはデンプン加水分解物を糖化して糖
   含有シロップを製造する方法であって：デンプンまたは
   デンプン加水分解物をグルコアミラーゼまたはベータ・
   アミラーゼで処理する工程を含み、その工程の前または
   その工程中にデンプンまたはデンプン加水分解物を；ス
   トレプトマイセス属に属する細菌の菌株を炭素源及び無
   機栄養源を含む適当な栄養培地中で脱側鎖酵素の産生に
   適当な条件下で培養することにより産生され、４〜６の
   範囲内のｐＨ及び５５〜６５℃の範囲内の温度で最適活
   性を示すプルラナーゼ型の脱側鎖酵素を含む脱側鎖酵素
   製品で；処理することを特徴とする上記糖化方法。
5. （５）メルコアミラーゼを使用し、生産される糖含有シ
   ロップがその主要糖成分としてグルコースを含む特許請
   求の範囲第４項に記載の方法。
6. （６）ベータ・アミラーゼを使用し、生産される糖含有
   シロップがその主要糖成分としてマルトースを含む特許
   請求の範囲第４項に記載の方法。
7. （７）デンプンをアルファ・アミラーゼで処理してデン
   プン加水分解物を作り、次いでこれを脱側鎖酵素とメル
   コアミラーゼまたはベータ・アミラーゼとで一緒に処理
   する特許請求の範囲第４〜６項のいずれかに記載の方法
   。
8. （８）脱側鎖酵素及びグルコアミラーゼまたはベータ・
   アミラーゼで処理されるデンプン加水分解物は少なくと
   も３０重量％の固形分含量を有する特許請求の範囲第７
   項に記載の方法。
9. （９）脱側鎖酵素での処理は５５〜６０℃で行なう特許
   請求の範囲第４〜８項のいずれかに記載の方法。
10. （１０）アルファ・アミラーゼはバシルス属の菌株から
    誘導され、グルコアミラーゼは菌類菌株から誘導され、
    そしてベータ・アミラーゼは麦芽または細菌源から誘導
    されるものである特許請求の範囲第７または８項に記載
    の方法。