JPS62249061A - 特定成分の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分の分析方法に係ジ、特
に免疫学的測定法による生物学的流体試料中の特定微鼠
成分を分析する方法に関する０ 〔従来の技術〕 生物学的流体試料中に極微量含有される物質を検出する
方法として、各種分析法の開発がなされてきた。その分
析方法は、主として免疫反応をそのａ埋とするものであ
る。上記原理を用いる測定法として、種々のものが開発
されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫測定法
が知られている。

免役６１１１定法は、１９５８年、ベルンン（Ｂｅｒ−
ｓｏｎ　）とイアロク（ｙａｌｌｏＷ　）が、放射性ヨ
ードで標識した、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中
の抗インシュリン抗体を用いて、血清中のインシュリン
全測定することに成功して以来、放射免疫０（１１定法
が広く用いられている。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種々開発がなされてきた。他の標識化合物としては例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテ
リオファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍元性分子等
が挙けられる。

上記免疫測定法に関する技術上のＴＬ袂な問題の１つと
して、結合を起した物ｌｘ（以下、Ｂと略記する）と起
さなかつ友物質（ＤＬ下、Ｆと略記する）の分離（以下
ψ分離と略記する）がある。

該分１１１操作は煩雑かつ時間のかかるものであるため
、これを改良するために第１抗体同相法、２抗体法など
が開発されたが、これらの方法を用いても該分１ｌｌＩ
操作は分析者にとって依然大きな負担となっている。

また該分離操作を必要としない方法としてエミツト（米
国サイバー社登録商標）、エンザイムチャネリ／グイム
ノアツセイ、テトラザイム（米国アボット社登録商標）
などのいわゆるホモジニアスイムノアツセイが開発され
たがこれらの方法も、測定対象が限られていたり、感度
が不充分であるなどの欠点を有していて、広く一般の測
定対象に汎用されるには至っていない。

他に、標識化合物を用いない測定法として、レーザーネ
フエロメトリー、ラテックス近赤外比濁法などが開発さ
れているが、これらの方法は極めて高価な専用機械を必
要とし、用途も限られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

特開昭６０−６７８５７号公報には、「抗原又は抗体と
、酵素又はｌ！ｌ？素阻害もしくは活性化物質とが、担
体に各々の固定相が分離されて固定されている、抗原又
は抗体と＃、　＆阻害もしくは活性化物質の固定化物」
を用いる新しい測定法が開発されている。この方法は、
１分離を人為的に行う必要が無い点で注目される。

しかし、この＃１足法は非常に複雑な競合反応の結果と
して測定を行っているため、その検量線は極めて変動し
やすく、該抗体や阻害剤等の量のわずかな変化により測
定が不可能になる。

抗原、抗体、酵素などの生物由来物質は一般に純品が入
手不可能で、粗精製品はロフトによりその純度が大きく
変動する上に、こうし九生物由米物質は保存中において
しばしば活性が変化するので、前述の検ｔ＃の不安定性
は測定を行う吸入′ｆ！な障讐となる。

本発明の目的は、前述の問題点を解消し、操作が簡単で
かつ安定し次検量ｍを与え、汎用性のある分析方法ｔｌ
−提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

不発明を概説すれば、本発明は流体試料中の特定成分′
ｆ：分析する方法に関する発明であって、流体試料中の
特定成分を分析する場合に、該特定成分と免疫学的に結
合する抗原又は抗体と酵素阻害剤とを固定部位を分けて
担体に固定化した固定化物、及び測定対象である特定成
分と酵素とが結合した標識物を用い、該流体試料と一緒
に水ｌ＠液液中共存させた後、該酵素活性を測定するこ
とにより該特定成分を分析する方法において、該固定化
物として、該特定成分を実質上含有しない流体試料を用
いて所定の分析操作を終了した時点で、＃標識物の総量
のうち３〜７０％が該抗原又は抗体と結合し、かつ１１
〜１０％が該抗原又は抗体、及び酵素阻害剤に結合して
いないように、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤の固
定化１ｌｔ−設定した固定化物を用いることを特徴とす
る。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好筐しくに生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を１１１［、
ｔｍ液、羊水、乳、尿、汁、肉汁等が挙けられる。

不発明により測定しうる流体試料中での特定成分Ａとは
、その存在又は、その流体試料中での址が測定され、そ
の特定成分ＡＫ特異的に結合する物質が得５る物質又は
物質群でめる０すなわち、ポリペプチド、タンパク質、
被合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホル
セン類、ビタミン類、薬剤、抗庄′＃１ｌＪｉｉ１農楽
等が挙けられる。具体的には、下記の物質又は物′Ｘ群
を挙けることができるが、これらに限定されるものでは
ない。

（タンパク質、複合タンパク質） プレアルブミン、アルブミン、α１−酸性糖タンパク質
、α１−アンチトリズシン、αｓ　−ＩＩ　タフバク質
、トランスフルチン、α！−アンチキモトリプシン、α
１−リポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セル
ログラスミン、Ｚｎ−α鵞−楯タンパク質、Ｇｃ−グロ
ブリン、インター−α−トリズシンインヒビター、α１
−マクログロブリン、α雪−ＨＢ−糖タンハク質、α意
−マクログロブリン、ハプトグロビン、α！−リポタン
パク質、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リボタ
ンハク質、β鵞−糖タンパク質、Ａ２−マクログロブリ
ン、Ｃ−反応性タンパク質、ミオグロビン、エリトロマ
イシン、免疫グロブリン（ＩｇＧ。

ＩｇＭ　、　ｒｇＡ　、　ＩｇＤ　、　ｒｇＥ　）、補
体系成分（ｃｌｑ　ａ　ｃｌｒ　ｅｃ、、　ｅ　ｃ、　
ｅ　Ｃｍ　＊　ｃ、　ｓ　ｃｓ　＃　ａｓ　＃　Ｃ？　
＊　Ｃｍ　ｅ　ｃｏ等）、フィブリノーゲン、ヘモグロ
ビン、グリコヘモグロビン、血ｇ凝固因子、ＨＢａ抗原
、ＨＢｓ抗体、酵素（例えば、酸性ホスファターゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼア
イソエンザイム、α−アミラーゼ、アミラーゼアイソエ
ンザイム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレア
チンホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソ
エンザイム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ　、　ＧＰＴ
　）、乳改脱水素ｒ１￥素、乳酸脱水素酵素アイソエン
ザイム、ｒ−ＧＴＰ。

リパーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ロイシンアミノペ
プチダーゼ、ブドウ抛６リン酸脱水素酵素等）等。

（ホルモン及びホルモン様物’ｊ［） 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）　、黄体刺激ホルモン（Ｌ
Ｈ）　、成長ホルモン（ＧＨ）　、甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラ
ニン刺激ホルモン（ＭＳＨ）、バンプレッシン、オキシ
トシン、インシュリン、グルカゴン、アンギオテンシン
ｌ及び田、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セ
ロトニン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ４）、ト
リヨードサイロニン（Ｔり、ガストリン、フルチゾール
、アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン、グロ
ゲステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロピン、
飴盤性うクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子（Ｔ囲、
　ＦＳＨ−冊、　ＣＲＨ、ＬＨ−四等）等。

（ビタミン類） ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１　ビタミンＢ２、ビ
タミンＢ＠、ビタミンＥｌｔｚ　％　　ビタミンｃ１ビ
タミンＤ、ビタミンＥ１ビタミンに１葉酸等。

（Ｍ掲マーカー） α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、臓癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、Ｍ
−タンパク、前立ＩｙＡ＆　性ホスファターゼ、糖鎖性
抗原（ＣＡ１９−９　、ＣＡ　１２５叫）、ガングリオ
サイズ （谷穐の薬剤及び代謝産物） ペンソイルエクゴニン、コカイン、コテイン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチンマ
イセチン、カナマイシン、クロラムフェニコール、クロ
ロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイ
シン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミキ
シンＢ１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプト
マイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド、
フェノバルビタール、プリミドン、セコバルビタール、
アセタミノフエン、アミトリブチリン、カルバマゼピン
、ジゴキシン、ジンピラミド、リドカイン、メントレキ
セート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、フェニトイン、
プロカイナミド、プロプラノロール、テオフィリン、カ
ナピノール、テトラヒドロカナピノール、コリン抑制薬
剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、フ゛チロフェノン、
カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリン、グリセ
オフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、メペリジン、
メブロバメート、メタトン、ナルセイン、ノルトリブチ
リン、オキサゼパム、パパベリン、グロスタグランジン
、テグレトール、バルプロン酸等及びこれらの代謝産物
。

（微主物表面マーカー） バクテリア抗原、菌類抗原、寄失虫抗原、ウィルス抗原
。

（Ｍｋ薬） ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

（その他） 血液型物質、カルシオリビン、アレルゲン等。

不発明で用いる「流体試料中の特定成分と免投字的に結
合する抗原又は抗体」とは、該特定成分が抗体であれば
、該抗体が特異的に結合する抗原を意味し、該特定成分
が抗原であれば、該抗原に対する抗体を意味する。

後者の場合、使用する抗体は、その由来を特に限定され
るものではなく、哺乳動物等に抗原全投与、免疫して得
られる抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知
の方法である（右田俊介胴「免疫化学」中山査店第７４
〜８８頁参照）硫酸す）　ＩＪウム沈殿法、硫酸アンモ
ニウム沈殿法、セファデックスゲルによるグル濾過法、
イオン交換セルロースクロマトグラフィー法、電気泳動
法等で精製して用いることができる０ あるいは抗原で感作した哺乳動物等←例えばマウス）肺
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑ｓｉ＃Ｊ胞
（ハイプリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっ
ても良い。

また、これらの抗体は工ｇＧ　、　ＩｇＭ　、　工ＥＡ
　、　ＩｇＤ　。

ＩｇＥ各分画を用いることができ、あるいはこれらの抗
体を酵素処理してＦａｂ％Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２
といった活性抗体７ラグメントにして使用してもよい。

更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組
合せ使用してもよい。

本発明において、標識として使用しうるｒ！＃素として
は、醸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱ｌ＠酵
素、異性化酵素、合成酵素のうち任意の＃素が使用でき
るが、代表的な具体例として鉱、下記に示される酵素を
挙げることができる。

ＥＣ，１，１，１，１アルコールデヒドロゲナーゼ１、
１．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ１、１
．１．　ｓ　　　グリセロール−３−リン酸テヒドロゲ
ナーゼ（ＮＡＤ”） １、１．１．２７　　乳酸デヒドロゲナーゼ１、１．１
，５７　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１、１．１．４０
　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ”）ｔ　１．
１．４７　　グルコースデヒドロゲナーゼ１、１．１．
４８　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ１、１．１．４
９　　グルコース−６−リン酸テヒドロクナーゼ １、１．２．５　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム）１、１．　Ａ　Ｉ　　　グリコール酸オキシダー
ゼ１．１．工２　　乳酸オキシダーゼ １、１．　！Ｌ　４　　　グルコースオキシダーゼ１、
１．　Ａ　６　　　コレステロールオキシダーゼ１、１
．Ａ　９　　　ガラクトースオキシダーゼ１．１．五１
７　コリンオキシダーゼ ＥＣ，１，ｔ、ｉ−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダー
ゼ１．２．１．１　　　ホルムアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ１．２．１．１２　　グリセルアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ １．２．Ａ２．　　キサンチンオキシダーゼ１、２．Ａ
　３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２．１　　　オ
キサル酸オキシダーゼ１．５．五−アシルＣＯＡオキシ
ダーゼ１、４．１．１　　　アラニンデヒドロゲナーゼ
１、４．１．３　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
ＮＡＤ　（ｐ　）”） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
ＮＡＤＰ”） １．４．Ａ２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼｔ　４．
　Ａ・５　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１、４．　＆　
４　　　アミンオキシダーゼ（フラビン含量）１、４．
　Ａ　６　　　アミンオキシダーゼ（ｔｌｌＩ１１含有
）１、５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸テヒドロゲナ
ーゼ１、５．Ａ　Ｉ　　　サルコシンオキシダーゼ１、
＆　４．２　　　グルメチオンレダクターゼ（ＮＡＤ（
Ｐ）Ｈ）ＥＣ，１，６，４，５ジヒドロリボアミドレダ
クターゼ（ＮＡＤ”）　（ジアホラーゼ） １．７．！Ｌ５　　　尿酸オキシダーゼ１、１．１．１
．６　　カタラーゼ １、　ｔ　１．１．７　　ペルオキシダーゼ１．１１１
２．４　　乳酸２−モノオキシゲナーゼ１１３．１２．
５　　レニラ　ルシフェリン−２−モノオキシゲナーゼ １、ｊ　Ａ１２．６　　シプリジナ　ルシフェリン−２
−モノオキシゲナーゼ １．１ｉ１２．７　７オチヌス　ルシフェリン−４−モ
ノオキシゲナーゼ（ＡＴＰ加水分解） １．１４．１１４−ｔ：）”ロキシ安息香酸３−モノオ
キシゲナーゼ １．１４．９９．２１　　ラチア　ルシフェリンモノオ
キシゲナーゼ ２、１．　Ａ　Ｉ　　　メチルマロニルＣＯＡカルボキ
シトランスフェラーゼ ２、！Ｌ２−２　　　γ−グルタミルトランスフェラー
ゼ２．７．１．１　　　へキンキナーゼ ＥＣ，２，７ｉ、２　　　グルコキナーゼ２．７．１．
１５　　リボキナーゼ ２．７．１．２８　　）リボキナーゼ ２．７．１．４０　　ピルビン酸キナーゼ２．７．５．
１　　　ホスホグルコムターゼ五１．１．５　　　リパ
ーゼ 五１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ！Ａ　１．　ｔ　
７　　　アセチルコリンエステラーゼ五１．１８　　　
コリンエステラーゼ ５．１．五１　　アルカリホスファターゼ五１．五２＠
ホスファターゼ 五１．五９　　グルコース−６−ホスファターゼＡ１．
Ａ１１　　フルクト−スジホスファターゼ五１．五２１
　　α−グルセロールホスファターゼｉ　１．４．１　
　　ホスホジェステラーゼｌＡ　１．４．５　　　ホス
ホリパーゼＣ五２．　ｔ　１　　　α−アミラーゼ 五２−１．２　　　β−アミラーゼ Ａ２．ｔ１７　　ラインザイム Ａ２．１．１８　　ノイラミニダーゼ ＥＣ，五２．１．２０　　α−Ｄ−グルコシダーゼＡ２
．１．２１　　β−Ｄ−グルコシダーゼ＆２．１．２３
　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ五２．ｆ、３５　　ヒア
ルロノグルコサミニダーゼＡ４．１１．６　　アルギニ
ンアミノペプチダーゼ五４．２２．４　　プロメライン Ａ５．１．１　　　アスパラギナーゼ 五５．１．５　　　ウレアーゼ 五５．４．２　　７デニンデアミナーゼＡ　５．４．４
　　　アデノシンデアミナーゼ３、’５．４．６　　　
ＡＭＰデアミナーゼ４、　ｔ　ｔ　５　　　オキサロ酢
酸デカルボキシラーゼ４、１．１．４１　　プロビオニ
ルーＣＯＡカルボキシラーゼ４．１．２．１３　　フル
クトースニリン酸アルドラーゼ４．２．１．２０　　ト
リブトファンシンセターゼ５、！Ｌ１．９　　　グルコ
ースリン酸インメラーゼ／ｉ、ｉ、１４　　ビオチンカ
ルボキシラーゼ６．４．１看　　ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ６、４．１．２　　　アセチルＣＯＡカルボキシ
ラーゼ６．４．１．３　　　プロピオニル−ＣＯＡカル
ボキシラーゼ（ＡＴＰ　　−刃口水分り撃　） ＥＣ，６，４，１，４メチルクロトニル−ＣＯＡカルポ
キシラゼ ／１．４．１．５　　　ゲラノイル−ＣＯＡカルボキシ
ラーゼ等 不発明で用いる標識物とは、酵素と測定対象である特定
成分とを、既述の本発明で使用する抗原又は抗体との結
合能力を保持した１まで、かつ該酵素の信号を発する能
力を保持したま１、化学的結合手段等で、＠接又は間接
的に結合した物質全意味する。

実際には、該特定成分と該酵素を、当業者間で一般に知
られている公知の試薬と公知の方法を用いて容易に大造
することができる。更に詳しく述べると、石川栄治、何
台　忠、宮井　潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医
字薔院、１９８２年刊）及び日本臨床病理学金輪「臨床
病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査のためのイムノ
アッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３
年刊）等に記載さ′ｒした棟々の方法を用いることがで
きる。

以下に具体例を挙げて説明するが、これ、は本発明を限
定するものではない。

＋１１　　該特定成分及び該ｍ累を、下記のような架橋
剤と反応させる方法 ■　２，４．６−）リクロロー１．５．５−トリアジン ■　４，４′−ジフルオロ−３，３１−ジニトロジフェ
ニルスルホン ■　トルエン−２，４−ジインシアネート■　Ｎ、　Ｎ
’−ジシクロへキシルカルボジイミド■　１−（６−シ
メチルアミノプロビル）−３−エチルカルボジイミド （９）　　ビスジアゾ−〇−ジアニシジン■　グルタル
アルデヒド　　　など （２）　　該特定成分と該ｃＰｆ木のうち少なくともど
ちらかが糖類を有している時、該糖鎖を過ヨウ素酸で処
理し、生じたアルデヒド基′ｆｔＭ合すべき相手物質の
アミノ基と反応させる方法。

（必要に応じて、遇ヨウ素酸処理の際の不要な結合の形
成を阻止するために１−フルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン等で該特定成分若しくは該酵素を前処理しておく
か過ヨウ素故処理反応のｐＨを４〜５に制御する、ある
いは該特定成分と該ｔｖｆ、素間で形成されたシッフ塩
基による結合を水素化ホウ素ナトリウムやエタノールア
ミン等で処理し安定化する、といった処［１，をとって
もよい） （３）　　該特定成分及び該酵素がチオール基を有して
いるか、あるいは還元等によりチオール基を生ずる、あ
るいは過当な化合物で処理することによりチオール基を
導入できる場合、マレイミド試薬として知られている撞
々の架橋剤と該チオール基と反応させる方法。

〔ここでチオール基を導入する化合物としては次のよう
な例が挙げられる ■　無水日−アセチルメルカプトスクシ／！！■　メチ
ル−３−メルカプトプロピオンイミデート ■　メチル−４−メルカプトプチルイミデー■　２−イ
ミノチオラン ■　３−　（２’−ジチオピリジル）プロピオン＆Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル■　メチル３−（４
″−ジチオピリジル）プロピオンイミデート　　など また、前述のマレイミド試薬としては次のような例が挙
けられる。

■　Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ
’−ｐ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、ｌ（’−ｍ−
フェニレンジマレイミド■　Ｎ、　Ｎ’−オキシジメチ
レンシマレイミド■　Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−マレ
イミドアセテート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブ
チレート ■　Ｎ−スクシンイミジル−５−（Ｎ−マレイミド）ヘ
プタノエート ■　Ｎ−スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド）ヘ
キサノエート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ［相］　Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド
）ベンゾエート ＯＮ−スクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフェニ
ル）−４−７’チレート ＯＮ−スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ＯＮ−スルホスクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド
）ベンゾエート （ＥＩＩＮ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレ
イミトフェニル）−４−ブチレートｏ　Ｎ−スクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）ベンゼン−１−
カルボ キ″−ト　　　　　　　　　　　など〕（４）　　該特
定成分又は、該酵素にピリジル・ジスルフィド基金尋人
し、結合すべき相手化合物に導入した、あるいは元々存
在するチオール基と反応させる方法。

〔ピリジル・ジスルフィド基の導入は３−（２′−ジチ
オピリジル）プロピオンｉ［Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルやメチル−３−（４’−ジチオピリジル）
プロピオンイミデートなどで処理すれば良い。またチオ
ール基の導入は（３）項で述べた方法などが利用できる
〕 （５）　　該特定成分及び該＃素がチオール基を有して
いるか、あるいは還元等によジチオール基金生ずる、あ
るいは適当な化合物で処理することによりチオール基を
導入できる場合、その片方の物質のチオール基をピリジ
ル・ジスルフィド基に変換し、結合すべき相手物質のチ
オール基と反応させる方法。

〔チオール基のピリジル−ジスルフィド基への変換は、
４．４−ジテオジピリジンなどにより行うことができる
〕 （６）　　該特定成分及び該酵素に、存在する又は導入
した、アミン基又はチオール基と、ｐ−ベンゾキノリン
を反応させる方法。

（７）　　モ／　Ｅｌ　−ト酢ｍ　Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルを、該特定成分及び該酵素に、存在
する又は導入した、チオール基に反応させる方法。

（８）該特定成分に対する抗体、該酵素に対する抗体、
及び前２者の抗体に共通に特異結合する抗体を反応させ
る方法。

（９）　　該特定成分・該１ｗ素の片方をアビジンと残
シをビオチンと結合しておき、両者をビオチン・アビジ
ン結合により結合させる方法。

本発明に使用しうる酵素阻害剤としてはジャーナル　オ
ブ　ジ　アメリカン　ケミカル　ソサイアテイ（Ｊ、　
Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ　）　　ｑ；　８０巻、第
４５６頁（１９５８年）；同第８２巻、＠５９６頁（１
９６０年）；アカウンツ　オブ　ケミカル　リサーチ（
Ａｃｅ、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ　）第９巻３１３頁（１
９７６年）：サイエンス（５ｅｔｅｎｃｅ　）　　第１
８５９３２０頁（１９７４年）；化学工業１９８５第２
１頁（１９８５年）などに記載された、若しくは引用さ
れたＩ！Ｆｌ！累阻害剤などが好ましく用いられ、また
次に開示された阻害剤も好ましく用いられる。

酵素阻害物質の例 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルドファイア（ｗｉｌｄｆｉｒｅ　）毒素ブルーデ
キストラン ０−ジアニシジン−セルロース ０−ジアニシジン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリシン アミノアセトニトリル ２−アミノ−５−ヒドロキシプロビル−１，３’−カル
ボキシ−３−アミノ−１−プロベニル−１エーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−トランス−３−ブテン
酸 エタノールアミン　Ｑ−サルフェート アルビシイン アザセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソノアノルバリン Δ３−７−アミツセ７アロスボリン酸 ミモシン ２−アミノ−４−ペンテン酸 ２−７ミノー４−クロロ−４−ペンテン酸５．３−ジク
ロロアラニン ５．５．５−トリクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブテン酸 Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−プロピニルアミンβ−アミノ
プロピオニトリル ２−ブロモエテルアミン ５−デシノイル−Ｎ−アセナルシステアミン２．３−デ
カジェノイル−Ｎ−アセチルシステアミンβ−クロロ−
Ｌ−アラニン Ｌ−セリン−〇−サルフエート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン ガバクリン ５−ニトロ−Ｌ−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン５−
ジメチルアミノ−１−プロピン グリセロール ジインプロビルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライドクラプラン酸 アロプリノール ７′チルテン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロフランとその誘導体 ニトロフンゼ／とそのあ導体 プリン訪廊坏 キレート化剤 重金属イオン 水銀化合物　　　　　　　　　　等 また、該酵素に対する抗体で、該酵素に結合することに
よりその活性を阻害するものも、好１しく用いることが
できる。

本発明に用いられる担体は、例えば従来免疫分析に用い
られてきたものであれは特に制限を受けず、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレ
フタレート、ポリカーボネート等の各種合成樹脂製のシ
ート、ボール、プレート、チューブ、ビーズ、あるいは
２紙などがその例として挙けられる。

また、本発明の効果を充分に発揮するためには担体の表
面積が充分大きいことが好ましく、サイズ１〜３５０μ
ｍの粒状体や繊維状の担体が特に好ましい例として挙け
られる。

特に、こうした粒状体や繊維状の担体を用いる場合、該
抗原又は抗体のみを固定化した担体と、該酵素阻害剤の
みを固定化した担体、更に必要に応じてこれらの物質を
固定化していない担体を自由な量で混合して用いること
ができ、その結果１アッセイに用いる担体中の各成分の
固定化量を任意に定めることができ、極めて好ましい態
様となる。

晶セルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキ
ストラン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋
アガロース、キチン、キトサン、各種合成樹脂（ポリス
チレン等）などの他、次のような反応性基を持つ化合物
から成る自己結合配粒子が挙げられろ。

例示化合物 ＋Ｉ＋　　ポリ（スチレン−コーグリシジルメタクリレ
−ト　）（９０／１０）。

（２）　　ポリ（ステレンーコーメチルアクリレートー
コーグリシジルメタクリレート）（８０／１５１５］。

（３）　　ポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルメタクリレ
ート−コーグリシジルメタクリレート）（７５／１５／
１０）。

（４）　　ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロラ
イドーコーグリシジルメタクリレート）〔８０／１０／
１０〕。

（５）　　ポリ（スチレンーコージビニルベンゼンーコ
ーグリシジルアクリレート）　（９０／２／８　）。

（６）　　ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コーグリシジル
メタクリレート）（９０／１０）。

（７）　　ポリ（メタクリレート−コーグリシジルメタ
クリレート）（８０／２０）。

（８）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミ
ノエチルメタクリレート）（９５１５）。

（９）　　ポリ（スチレンーコーアジリジルエチルメタ
クリレート）［９５／ｌ。

αリ　ポリ（スチレンーコーメチルアクリレートーコー
アクロレイン）　（９０１５１５）。

αＶ　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（９５１
５）。

（＋３ホｌＪ（スチレンーコービニルチオール）（９５
１５）。

（至）　ポリ（スチレンーコーメテロール化アクリルア
ミド）［９５１５）。

θ◆　ポリ（ステレンーコーｔ−ブチルアクリレート−
グリシジルメタクリレート）（９０１５１５〕。

０９　　ポリ（スチレンーコービニルイソシアネート　
）（９５１５）。

００　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレンーコ
ーＮ−メチロールアクリルアミド）〔５０１５５／１５
　〕。

αη　ポリ（スチレンーコーグリシジルメタクリレート
ーコーＮ、　Ｎ−ジメチルアミンエチルメタクリレ−１
’　）［９０１５１５，１゜０＆　ポリ（ステレンーコ
ーメタクリル酸−コーアクリルアミド）　Ｃ？　５／２
／ｌ　）。

ｏ！Ｊ　　ポリ（スチレンーコーＮ−メチロールアクリ
ルアミドーコーアクリル酸メトキシエテルン［９ｏ１５
／ｓ］。

い１　ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーＮ−メチロール
アクリルアミドーコーアクリル酸）（９０／８／２）。

Ｑυ　ポリ（メチルメタクリレートーコーグリシジルメ
タクリレートーコーｔ−ブチルアクリレ−ト　）　〔８
ｏ／１　ｏ／１　ｏ　〕。

■　ポリ（スチレンーコーｐ−ビニルベンジルクロライ
ドーコーアクリル原−コーアクリル酸ウレイドエチル）
　（７５／１０１５／１０　）。

θ　ポリ（ステレンーコーメタクロレインーコーα−ヒ
ドロキシエチルメタクリレ−トンＣｑａ１５１５）。

Ｈポリ（スチレンーコーアクロレインーコーアセトアセ
トキシエチルメタクリレート）（：　８５１５／１０　
）。

ツ　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミンエチ
ルアクリレートーコービニルスルホニルエチルメタクリ
レ−）　（９’０１５１５　）。

（至）　ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミノスチレ
ンーコービニルスルホニルエチルメタクリ　　し　−　
　ト　　）　　　［８５／１　　０１５］　。

■　ポリ（スチレンーコーＮ、　Ｎ−ジメチルアミンエ
チルメタクリレート）［：９０／１０）。

（ハ）　ポリ（スチレンーコーアクリルｅ）Ｃ９７１５
〕。

四　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（９７／３
）。

（至）　ポリ（ｐ−ビニルトルエン−ツーｔ−ブチルア
クリレート）〔９５１５〕。

ＧＯポリ（メチルアクリレートーコーメタクリルアミド
）［９５１５）。

□□□　ポリ（ステレンーコーＮ−メチロールアクリル
アミド）（９５１５）。

語　ポリ（ｐ−ビニルベンジルクロライドーコ−Ｎ−メ
チロールアクリルアミド）［９６／４）。

（ロ）　ポリ（ステレンーコーイタコン酸）（９８／２
〕。

Ｇ９　　ポリ（スチレン−ツーｔ−ブチルアクリレ−ト
　）　　（９２／８）。

（至）　ポリ（メチルアクリレートーコースチレンーコ
ーアクロレイン）（３０／６５１５）。

０？）　　ポリ（メテルメタクリレートーフースチレン
ーコ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート　）　　ｌ
：　２５／７０１５　〕。

（至）　ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエテル
アクリレート）〔８０／２０）０ １）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチ
ルアクリレート）［９０／１０〕。

菊　ポリ（スチレンーメチルアクリレートーコーアセト
アセトキシエチルアクリレート）（９０１５１５）。

一υ　ポリ（スチレンーコーメタクリル＃り（９５１５
〕。

各例示化合物の後の括弧内ｒユ■合反応に用いた単量体
のル゛亀％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、本発明の多孔質反応１輪に用いる繊維としては、
バルブ（粉末ｅｔｃなど）、綿、麻、絹、羊毛、キチン
、キトサン、セルロースエステル、ビスコースレーヨン
、鋼アンモニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、
６，６−ナイロン、６．１０−ナイロンなど）　、ポリ
エステル（ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオ
レアイン（ポリプロピレン、ビニロンなト）、ガラス繊
維、石綿など。植物性・動物性・鉱物性・合成・半合成
・再生繊維を用いることができ、あるいはこれらを混合
して用いても良い。あるいは別の態様としては吸水性の
洋紙、和紙、１紙、プラッシュポリマー、あるいはガラ
ス繊維、鉱物性繊維（石綿など）、植物性繊維（木綿、
麻、パルプなど）、動物性繊維（羊毛、絹など）、合成
繊維（谷柚ナイロン、ビニロン、ポリエチレンテレ７タ
レート、ポリプロピレンなト）、再生繊維（レーヨン、
セルロースエステルなど）などを単独あるいは混合して
製造した織物、不織布、合成紙などを該担体に用いるこ
ともできる０ このよりな粒状体、繊維あるいはそれらの混合物はその
１″１の形で溶液中に分散して用いることが望ましいが
、その取扱いを容易にするために、表面積を充分に確保
した形で相互に接着し、多孔質成形物とすることも可能
である。その場合は特開昭４９−５３８８８号、向５５
−９０８５９号、同５７−６７８６０号、向５７−１０
１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５７−１２５
８４７号、同５７−１９７４６６号、同５Ｂ−７０１６
３号、同５９−２８５７１号各公報などに記載されてい
る多孔質反応層の作成法を適用できる。

抗原又は抗体、及び酵素阻害剤の多孔質反応層への固定
化は、種々の公知の方法により、該物質を該多孔質反応
層の表面に物理的に吸着させるか、化学反応によシ直接
あるいは間接的に結合させることによシ達成される。そ
の際、該物質の該特定成分に対する特異的結合性が失わ
れないように留意する必要があり、例えば石川栄治、何
台　忠、宮井　潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医
字曹院、１９８２年刊）や千畑一部、土佐四組、松尾雄
志著「実験と応用アフイニテイクロマトグラフィーＪ（
講談社、１９７６年刊）に記載されている方法を、好ま
しい方法の例として卒けることができる。

ここで該抗原又は抗体と該酵Ｘ阻害剤は固定部位を分け
て担体に固定する必要がある。

固定部位を分けるとは、該抗原又は抗体に結合している
標識物の酵素の大部分が該酵素阻害剤により阻害を受け
ない程度に該抗原又は抗体の相体上の固定部分と、該酵
素阻害剤の固定部分が分離されていることを意味する。

したがって、同一の担体上において両物質の固定部分が
分離されている場合は言うまでもなく、両物質が別々の
担体に固定されている場合も含まれる。

また、該特定成分と特異的に結合し得る物質を固定化し
た後に、必要に応じて免疫反応における非特異的反応を
排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与しないタ
ンパク質を担持することが可能である。それらの代表的
な例としては、呻乳動物の正常血清タンパク質、アルブ
ミン、ゼラチン及びその分解物等が挙けられる。

本発明の特徴は、ここで用いられる、「該特定成分と免
疫学的に結合する抗原又は抗体」、及び「該酵素阻害剤
」の固定化１：に関する。本発明者らは検討を重ねた結
果この固定化量が分析素子の性能に極めて大きな影響を
与えることを見出した。

すなわち、該抗原又は抗体の固定化餡二が不足している
と流体試料中の特定成分及び標識物が該抗原又は抗体と
充分結合せず、また逆に該抗原又は抗体の固定化量が過
剰である場合は該特定成分の量にかかわらず該＊織物の
ほぼ一定量が該抗原又は抗体に結合する現象が起き、ど
ちらも満足な検量線を与えない。

また、該酵素阻害剤の固定化量が不足していると、「該
抗原又は抗体」、及び「該酵素阻害剤」と結合せず分析
素子中の流体試料中に残存する該標識物が増加すること
により信号のバックグラウンドが増大する。逆に咳酵素
阻害剤の固定化Ｊ（が過剰であると該抗原又は抗体と結
合する該標識物が極めて少なくなり、いずれの場合も御
１定が困難となる。

そこで、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤の好ましい
固定化量について、本発明者らは検討を史に１ねたとこ
ろ、次の事実が見出された。

すなわち、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤の好まし
い固定化量は、該標識物の量、＃標識物と該抗原又は抗
体のアフィニティー、該標識物と該酵素阻害剤のアフィ
ニティー、該特定成分と該抗原又は抗体のアフィニティ
ー、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤の担体への固定
化方法、等の要因により変動する。

また、該抗原又は抗体、及び該阻害剤は生体由来の物質
を用いる場合が多く、こうした場合該物質の完全な純品
を入手するのは事実上不可能であり、またロットによる
純度のバラツキも避は侍ない。このよりｌ場合、これら
の物質の好ましい固定化量を質量やモル数など物理的な
単位で規定するのに無意味であり、むしろ該物質の総括
性などを単位として規定されるべきである。

本発明者らはこりした多数複雑な要因により変動する該
抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤の好ましい固定化量に
ついて８Ａ確かつ簡単な基準を見出すべく、更に努力を
１ねた結果、不発明を完成するに至ったのである。

すなわち、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤の好まし
い固定化量は既に概説したように規定される。

該標識物の総量のつち、５〜７ｏチ、好筐しくけ５〜５
０％、更に好ましくは１０〜２５％が該抗原又は抗体と
結合しているのが必要である理由は、この数値より不足
又は逆に過剰のいずれの場合にも、満足な検を腺を与え
ないからである。

またｆｆ標識物の総量のうち、１１〜１０％、好ましく
セ［ｌＬ１〜５％が、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害
剤と結合しないフリーの状態とするのは、１０％を越え
ると信号のバックグラウンドが増大し、逆にα１％未満
となると、該抗原文に抗体と結合する該標識物が極めて
少なくなり、いずれの場合も、測定が困難となるからで
ある。

特に、該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤に結合してい
ない該標識物は、信号の測定の際のバックグラウンドと
なるので、少ない方が好ましいと予想されるが、本発明
者らは検討を重ね次結果、この該抗原又は抗体、及び該
酵素阻害剤に結合していない該標識物が、標識物の総量
のａ、１％未満である場合は検量線の形状に好ましくな
い影＃を与えることを発見した。

すなわち、このような場合は、いわゆるＳ字状曲線型の
検量線の曲がり方がきつくなり、測定可能範囲が非常に
狭くなる。またこのような条件においては該抗原又は抗
体、若しくは該酵素阻害剤の固定化蓋若しくは活性のわ
ずかの変動によって、検を線が大きく変動する几め、安
定な検ｉｔｌｆＭを与える該固定化物の量産が著しく困
龜になる。これは全く予想で＠ない驚嘆すべき結果であ
った。

更に、本発明について詳説する。

該特定成分を実質上含有しない流体試料とは、該流体試
料から特定成分をアフィニティークロマトグラフィー等
で完全に除去したものが好ましいが、該流体試料中に含
まれる特定成分が本発明の実施者が意図する目的に対し
て無視しうる量であることが確認されておれば充分であ
り、場合によっては蒸留水、生理食塩水、特定成分を甘
まない適当なタンパク溶ｇなどで代用することも可能で
ある。

所定の分析操作とは、実施を意図する態様において、該
流体試料の一定量と該標識物の一定量と該固定化物を所
定の時間、所定の温度でインキュベートすることを意味
する。

要は、水溶液中においてこれら三者が共存している時間
が存在すれば良く、厳加順序等は何ら制限を受けない。

また、該水溶液としては該流体試料をその１１用いても
良く、各軸の緩衝液を用いて、その中に該流体試料の一
定量を添加する態様も可能である。

緩衝液は、他の極性溶媒（アルコール、エーテルなど）
を富有していてもよく、これらの皺は２０重量％以下で
ある。緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲であり、好ましく
は６〜ａ５の範囲である。所望のｐＨを達成し、測定中
にこのｐＨを維持する各棟の緩衝剤の例には、ホウ酸塩
、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール、グツド緩
衝剤などがある。

測定＠度は通常４−４５℃で行うが、好１しくに１５Ｓ
４５℃である。

ｅ累の活性測定は、その酵素の特性に応じて、公印の活
性測定法を利用すれば良く、使用する基質の種類により
、発色、発光、蛍九等の信号全１回（エンドアッセイ法
）あるいは２回以上（レートアッセイ＠）測定すること
により、その酵素活性ｔ−１ｉＩＪ定できる０ 「所定の分析操作を終了した時点」というの框、いわゆ
るエンドアッセイ法の態様においては該分析素子の信号
を測定し終えるべ＠時刻を意味し、レートアッセイ法の
態様においては最終の信号測定を終えるべき時刻を意味
する。

該標識物の総針は、実施者が意図する測定範囲に応じて
、一定量を設定するべきものであり、通常流体試料中に
ある特定成分の影は、症例に応じて判っているので、意
図する測定下限濃度における流体試料の一定量中の該特
定成分の絶対針の１０〜２０倍となるように設定するの
が好適である。

以上の条件により設定される該抗原又は抗凧及び該酵素
阻害剤量を具体的に知るには各種の方法がある。

該担体に固定化された状態における該抗原又は抗体、及
び該酵素阻害剤と該標識物のアフィニティーが結合反応
の平衡定数等、定置的な形で判明している場合は、シミ
ュレーション等の方法によシ好筐しい固定化ｔ１を知る
ことができる。しかし、より簡便かつ確実な手段として
は、好筐しいと予想される範囲で、あらかじめ該抗原又
は抗体、及び該酵素阻害剤の固定化ｉ！：を変化させた
予備試験用担体を数棟類作成し、該特定成分を実質上含
有しない流体試′ＩＩ＋を用いて実際に検定することが
挙けられる。

この場合、該予備試験用担体及び分析操作は本発明の実
施者が意図する態様に基づくべきであるのは言うまでも
ないが、該標識物と該抗原又は抗体、及び該酵素阻害剤
の結合反応に実質的に影響を与えない範囲において該検
定が容易に行えるよう変史を加えることができる。

該検定の方法は標識の種類により、細かい点で若干異な
る場合があるが、当業者は、本発明の実施例を参考に、
該検定を容易に行うことができる。

また、数棟類の条件について検定を行えば、前述の該抗
原又は抗体、及び該酵素阻害剤の過不足によって起きる
現象についての記載を参考に、本発明で設定した固定化
量の具体的な量を決定することも極めて容易なことであ
る。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に具体的に脱明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）　　固定化物の作成 りギ抗ヒトＩｇＧを０．０５　ＭｐＨ９，６炭酸・重炭
酸塩緩衝液に１０μｔ／−の濃度で溶解し、平均粒径２
１μｍのポリ（ステレンーコーｎ−ブチルメタクリレー
ト−コーグリシジルアクリレート）［７５／１５／１ｏ
〕の高分子重合体粒子を加えて４℃で一晩かくはんした
。粒子を生理食塩水で洗浄後牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）２００μ２／−を営む同様の緩衝液に入れて４℃で一
晩放置し、生理食塩水で更に洗浄、粒子Ａとした。

また、同様の商分子重合体粒子をＢＳＡ溶液のみで処理
、洗浄し、粒子Ｂとした。

次に、セファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）２
．２９を４０１ｎｔの２．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ１２，１）に入れ、５へ１０℃に冷却かくはんしな
がら２０ｍの臭化シアン溶ｇ（約α０５ｙ／７りを加え
、そのま１１０分間かくはん後、洗浄した。この処理済
セファデックス粒子と０−ジアニシジンｋｐＨ９２、暗
所４℃において１０分間反応させた後１Ｍ・トリス溶液
で処理した後水洗し、粒子Ｃとした。

更に、セファデックスＧ−２５’ｉ水洗したのみのもの
を粒子りとし、粒子Ａ−Ｄ’ｉ、粒子Ａ子粒子Ｂ及び粒
子Ｃ子粒子りが一定となるように種々の比率で混合し、
固定化物ａ〜ｅとした。

＋２１　　ｆｉ！ｉｆ足化物の予備試験［１Ｌ０１５％
過酸化水素含有５０ｍＭクエン酸°リン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５，０）にＯ−フ二二レンジアミンｆｅ２．
５　ｍｆ／　／　ｔＲｌの濃度で溶解し発色試薬液とす
る。

２％ＢＳＡ含有５０ｍＭリン２１衝液を４８０μｔずつ
試験管に分注し、各々に＋１１で作成した固定化物を１
２（１９加える。

各試験管に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識と）　Ｉｇ
Ｇ浴液１０μを及び蒸留水１０Ａｌを加え、２０分間室
温放置した後、更に緩衝液５００μｔ２加え２０分間５
７℃でインキュベートして、遠心分離により固定化物と
上澄液全分離し、該固定化物は１ｌＬ１％ポリオキシエ
チレン（２０）ンルビタンモノオレート溶液で洗浄した
。

該上＃：液５００μｔを前述の発色試薬液ＳＯＯμｔ　
に加え３７℃２０分間インキュベート後１．５Ｎ硫酸２
−を加え、試薬ブランクにより４９２ｎｍの吸光度を測
定、２を乗じた値を２とした。

また洗浄後の該固定化物全量と該発色試薬液ＳＯＯμｔ
１及び緩衝液５００μｔを同様にインキュベートし、１
．５Ｎ硫酸を加え、吸光度全測定、その値をｙとした。

史に前述の標識ヒトＩｇＧ溶液ｆｔ５ｏ倍に希釈し、そ
の１０μｔ１蒸留水１０μｔ１核発色試薬ｇ５００μを
及び緩衝液４８０μｔ１ｒ：混合し、同様の操作全行い
、得られた吸光度の値に５０を乗じた数七２とした。

以上の操作を固定化物（ａ）〜（ｅｌ）について各々行
い、それぞれについて１ｘ１ｏｏ（％）及びヱＺ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇＸｌｏｏ（％
）を比較すると次の表１のようになった。

表　１ （３１検量線の確認 ２　％ＢＳＡ　貧有５０ｍＭリン酸緩衝ｇ　４　８　０
ａｔ。

（１）で作成した固定化物１２０Ｍｇ、及び標識ヒトＩ
ｇＧ浴ｇ１ｏμを全試験管に分注し、種々の濃度のヒト
エｇＧ溶液各１０μｔを加え、２０分間室温放置後、発
色試薬液５００μｔ２加え、５７℃２０分間インギュベ
ートして、その後１．５Ｎ硫酸２　ｍｌ全加え、試薬ブ
ランクにより４９２ｎｍの吸光度を測定、検量線を作成
した。

以上の操作金該固定化物ａ　％　ｅについて行ったとこ
ろ、第１図に示すよつな結果となった。

すなわち第１図は、本発明方法の実施例及び比較例の検
量線をヒトＩｇＧＳ度（ｎ９７ｍ、横軸）と吸光度（縦
軸）との関係で示したグラフであり、ａが不発明の実施
例である。

第１図から明らかなように、ｃ％ｄ％　ｅは濃度差によ
る吸光度変化がなだらかであり、ｂは商嬢度のものが判
定できない。結局、ａの本発明の検ｆ１Ｆ、線が有効で
ある。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明方法によれば、実施者の意
図する該特定成分の濃度範囲において安定した検針線が
与えられ、操作が簡単かつ汎用性のある分析が可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法の実施例及び比較例における検ｆ
ｉ：ｌｆＭｋ、ヒトエｇＧ＠度と吸光度の関係で示した
グラフである。 手絖補正書（自発）　　フ 昭和６１年５月２３　日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示　　昭和６１年特許願第９１２９７号２
発明の名称　　特定成分の分析方法 五補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２号名　
称　　（１２７）小西六写真工業株式会社代表者　井手
恵生 五補正命令の日付　　自発補正。 ＆補正の対象 （１）明細書の発明の詳細な説明の欄 、補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄を下記のとおシ補正する
。 （１）　　明細書第２６頁７行の「ミモシン」の次に改
行して、「５−アミノイソフタル酸」を加入する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、流体試料中の特定成分を分析する場合に、該特定成
   分と免疫学的に結合する抗原又は抗体と酵素阻害剤とを
   固定部位を分けて担体に固定化した固定化物、及び測定
   対象である特定成分と酵素とが結合した標識物を用い、
   該流体試料と一緒に水溶液中に共存させた後、該酵素活
   性を測定することにより該特定成分を分析する方法にお
   いて、該固定化物として、該特定成分を実質上含有しな
   い流体試料を用いて所定の分析操作を終了した時点で、
   該標識物の総量のうち３〜７０％が該抗原又は抗体と結
   合し、かつ０．１〜１０％が該抗原又は抗体、及び該酵
   素阻害剤に結合していないように、該抗原又は抗体、及
   び該酵素阻害剤の固定化量を設定した固定化物を用いる
   ことを特徴とする特定成分の分析方法。