JPS6217519B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素とその製造方法に関し、更
に詳しくは下記化学式（） で示されるビニルアミン単位を共重合単位として
含む変性ポリビニルアルコール（以下PVAとい
う）に酵素を吸着してなる固定化酵素とその製造
方法に関する。

従来より、酵素による触媒反応を利用して各種
の物質を発酵法で製造するにあたり、酵素を固定
化して反応生成物との分離を容易にし、連続運転
を可能ならしめる所謂「固定化酵素技術」が知ら
れている。固定化の方法としては、グルタールア
ルデヒドなどの架橋剤で酵素同士を結合させる架
橋法、イオン交換樹脂やガラスビーズなどに酵素
を結合させる担体結合法あるいはコラーゲン膜や
ゲル状の合成高分子の中に酵素を含む包括法など
があり、これらの方法による固定化酵素は通常は
粒状，膜状あるいはゲル状でありカラムなどの反
応槽に充てんして使用される。一方、固定化酵素
をより一層取扱い易くするために繊維形状とする
方法も検討されており例えば特開昭54―138624号
においてはアミノアセタール化したPVA繊維に
酵素を固定化する技術が開示されている。しかし
ながら、PVAをアミノアセタール化する方法は
原料費が高価でありまた、工程が複雑で工業的な
実施が困難である上、アミノアセタール化した
PVAの濃厚水溶液は条件によつては不溶化反応
を起こし易く、その場合には水溶液が不安定、不
均一となつて紡糸をすることが困難になるという
欠点があつた。

本発明者らは酵素の吸着固定性能に優れ、かつ
工業的に安価かつ安定に繊維を形成し得るPVA
系高分子を開発すべく検討を重ねた結果、分子中
にビニルアミン単位を共重合単位として含有せし
めた変性PVAはその水溶液が安定性に優れてお
り、この変性PVAを紡糸して得た繊維を酵素水
溶液中に浸漬することにより容易に繊維に酵素を
固定化し得ること、またこの繊維状の固定化酵素
は取扱いが便利である上高い酵素活性を発現し、
発酵工業にとり極めて有用であることを確認し、
更に、前記のビニルアミン単位を含有せしめた変
性PVAの工業的有利な製造方法を見出して本発
明を完成したものである。

ビニルアミン単位を含有せしめた変性PVAの
合成法としては、工業化学雑誌59，658（1956
年）あるいは同60，353，1188（1957年）におい
てＮ―ビニルフタルイミドあるいはＮ―ビニルコ
ハクイミドと酢酸ビニルとを共重合したる後に酢
酸ビニル部分をケン化し、更にアルカリあるいは
ヒドラジンを用いてイミド基を分解する方法が示
されているが両イミドモノマーはともに、そのイ
ミド基はアミド基までは分解されるが、アミノ基
まで分解反応を進めることが困難であり、この方
法でビニルアミン含有PVAを製造することが困
難であることは上記文献が示すとおりである。こ
うしてPVA分子中にビニルアミン共重合単位を
含有せしめることは予想以上に困難であり未だ有
効な方法が知られていなかつた。本発明者らはこ
のような状況を踏まえ、安定かつ有効にPVA中
にビニルアミン単位を含有せしめる製造方法につ
いて探究した結果、ビニルエステル、特に酢酸ビ
ニルとＮ―ビニルアルキルアミド特にＮ―ビニル
アセトアミドとをラジカル重合開始剤の存在下に
共重合させ、しかる後に該共重合体を加水分解す
ることにより、Ｎ―ビニルアルキルアミド単位は
すべて加水分解されビニルアミン単位とすること
ができ、こうしてビニルアミン単位を任意な量を
含有する変性PVAを製造することに成功したも
のである。

酢酸ビニルとＮ―ビニルアルキルアミドの共重
合体の加水分解において、酢酸ビニル中のエステ
ル基に比較しＮ―ビニルアルキルアミド単位中の
アミド基の加水分解速度は遅いため、通常は二段
階で加水分解反応を実施することが望ましい。す
なわち、酢酸ビニルとＮ―ビニルアルキルアミド
の共重合体のアルコール溶液にアルカリあるいは
酸触媒を作用させて共重合体中の酢酸ビニル単位
をケン化せしめて、Ｎ―ビニルアルキルアミド単
位を含む変性PVAを合成した後、これを加熱下
に水に溶解して水溶液とし、アルカリあるいは酸
を加えて90゜〜100℃で加水分解反応を実施する
方法が一例として挙げられる。この場合アルカリ
は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどであ
り、酸としては硫酸、塩酸などが使用される。酸
を使用してＮ―ビニルアルキルアミドの加水分解
を実施した場合、ビニルアミン単位が使用した酸
の塩の形である変性PVAが得られる。

本発明の固定化酵素に使用する変性PVA中の
変性基の量、ケン化度あるいは変性PVAの重合
度は目的に応じて適宜選択され特に制限は無い
が、取扱い易い固定化酵素を製造する上でこれら
の三つの要素を上手に組合わせることが重要であ
る。一般的な目的に対しては変性基を含む共重合
単位の量は0.5〜15モル％、ケン化度は80〜100モ
ル％、重合度は500〜3000の範囲が好ましい。

このようにして得られた変性PVAは繊維状、
スポンジ状、ゲル状などの形状とした後酵素と反
応させて本発明の固定化酵素を形成せしめること
が可能であるが、このうち繊維形状とした固定化
酵素はその取扱い易さにおいて特に優れており、
本発明において特に重要であるので以下繊維状変
性PVAによる固定化酵素につき説明する。

変性PVAは水に加熱溶解して、10〜50％の水
溶液となるよう調製し、常圧下あるいは高圧下に
おいて60゜〜160℃の温度のものを原液とし、通
常の乾式紡糸法または湿式紡糸法により紡糸す
る。この原液調製の際に変性基の量を調節する目
的で変性していない通常のPVAを混合して紡糸
することもできる。乾式紡糸法における紡糸筒は
90゜〜250℃の加熱空気が用いられまた、湿式紡
糸法における紡糸浴の例としては200〜450ｇ／
の濃度で、30〜50℃の温度のボウ硝水溶液が用い
られる。紡糸された変性PVAは次に150゜〜260
℃の加熱空気中で４〜12倍に延伸した後、200゜
〜260°で熱処理する。こうして得られた繊維は
このままで用いることもでき、更に耐水性の向上
あるいは膨潤度の調整のためにホルマール化ある
いはアセタール化してもよい。また該共重合物を
一成分とする複合繊維の形態としても使用しう
る。繊維の太さは目的に応じて任意のものとする
ことができるが通常0.5〜500デニール程度が好ま
しい。紡糸方法、延伸倍率、熱処理、ホルマール
化あるいは繊維の太さは原料の変性PVAの組成
に応じて適宜選択することが必要で、適度な膨潤
度と耐水性を付与するように調整される。

こうして得た繊維状変性PVAに酵素を吸着さ
せるにあたつては繊維を目的に応じて適宜裁断し
たり、あるいは布状に織りあるいは編んだ後、緩
衝液により酵素の性質に応じた適当なPHに調節し
た酵素水溶液中に浸漬して必要時間静置あるいは
振盪、撹拌することにより繊維状変性PVAに酵
素が吸着、固定化され固定化酵素が形成される。

本発明の固定化酵素に用いられる酵素として
は、特に制限はなく目的に応じて多くの酵素を用
いることができる。その例としてはインベルダー
ゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイソメラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、リボ
ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロ
テアーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ―アミノ酸
オキシダーゼ、ステロイドエステラーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ア
ルカリ性ホスフアターゼ、ラクターゼ、ロイシン
アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、トリ
プシン、パパイン、フイシン、プロナーゼ、アミ
ノアシラーゼ、アスパラギナーゼなどがあるがこ
れらに限るものではない。また吸着に先だつて酵
素の吸着、固定化能を向上させる目的で酵素に適
宜変性を施すこと、例えばサクシニル化などの変
性を実施することも任意である。

得られた固定化酵素の作用は本来の酵素と同様
であるが、固形化されているため、取扱い、反応
液との分離、再使用が容易となる長所を有する。
固定化酵素の活性は固定化前とくらべて40％以上
の発現率を有する。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するがこれ
らの実施例は本発明を何等限定するものではな
い。

実施例 １ Ｎ―ビニルアセトアミドと酢酸ビニルとの共重
合体をケン化してＮ―ビニルアセトアミド単位を
3.5モル％含有する変性PVAを得た。次いで、こ
の変性PVAの５％水溶液中に苛性ゾーダを変性
PVAに対して20％添加して水溶液を３時間煮沸
した後メタノール中に再沈殿させ更にメタノール
で洗滌精製した。得られた重合体は、Ｎ―ビニル
アセトアミド単位中のアミド基が100％加水分解
されビニルアミン単位を3.5モル％含有する変性
PVAであることが赤外線吸収スペクトル、核磁
気共鳴スペクトルにより確認された。この変性
PVAの４％水溶液の20℃における粘度（ブルツ
クフイールド型粘度計による。以下同じ）は
30cp（センチポイズ）であつた。この変性PVA
の35％水溶液を原液とし、これを130℃に加熱し
て金板より150℃の加熱空気中に押出す乾式紡糸
を実施後、得られた繊維を230℃で７倍に延伸
し、次いで240℃で熱処理して２デニールの繊維
状変性PVAを得た。この繊維１ｇにリン酸塩緩
衝液でPHを６に調整したインベルダーゼ水溶液
100ｇ（国際標準単位で10000単位相当を含有）を
加え、30℃で24時間振盪して酵素固定を実施し
た。次いで、繊維を十分水洗した後インベルダー
ゼの固定化率を測定したところ61％であつた。こ
うして得られた繊維状の固定化酵素に２％シヨ糖
水溶液100ｇを加えて30℃におけるグルコースへ
の転換速度から酵素活性発現率を求めたところ、
原料酵素に対して65％の活性を示した。

実施例 ２ Ｎ―ビニルアセトアミドと酢酸ビニルとの共重
合体をケン化してＮ―ビニルアセトアミド単位を
５モル％含有する変性PVAを得た。次いで、こ
の変性PVAの10％水溶液と4N塩酸を等量混合し
た液を３時間煮沸した後、メタノール中に再沈殿
させ、更にメタノールで洗滌精製した。得られた
重合体はＮ―ビニルアセトアミド単位中のアミド
基が100％加水分解され、ビニルアミン塩酸塩単
位を５モル％含有する変性PVAであることが赤
外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルによ
り確認された。この変性PVAの４％水溶液の20
℃における粘度は23cpであつた。この変性PVA
の38％水溶液を原液とし、実施例１に準じた乾式
紡糸法により２デニールの繊維状変性PVAを得
た。この繊維１ｇにリン酸塩緩衝液でPH８に調整
したグルコースイソメラーゼ水溶液50ｇ（10000
単位相当を含有）を加え、30℃で24時間振盪して
酵素固定を実施した。次いで繊維を十分水洗した
後、酵素の固定化率を測定したところ94％であつ
た。こうして得られた繊維状の固定化酵素に２％
のグルコース水溶液100ｇを加えてフルクトース
への異性化速度から酵素活性発現率を求めたとこ
ろ85％であつた。

実施例 ３ 実施例２において合成したビニルアミン塩酸塩
単位を５モル％含有する変性PVAの16％水溶液
を原液とし、94℃に加熱して金板より35℃のボウ
硝水溶液中に押出す湿式紡糸法を実施後、得られ
た繊維を200℃で8.5倍に延伸し、次いで200℃で
熱処理し２デニールの繊維状変性PVAを得た。
この繊維１ｇにリン酸塩緩衝液でPH８に調整した
ウレアーゼ水溶液50ｇ（10000単位相当を含有）
を加え、30℃で24時間振盪して酵素固定を実施し
た。ウレアーゼの固定化率は98％であつた。こう
して得られた繊維状の固定化酵素に２％の尿素水
溶液100ｇを加えてアンモニアの発生測定から酵
素活性発現率を求めたところ79％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記化学式（）で示される共重合単位を含
   む変性ポリビニルアルコールに酵素を吸着してな
   る固定化酵素。 ２ 変性ポリビニルアルコールが繊維状をなして
   いる特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ３ 酢酸ビニルとＮ―ビニルアルキルアミドとの
   共重合体を加水分解して得たビニルアミン単位を
   含有する変性ポリビニルアルコールを紡糸して繊
   維を形成させ、これを酵素水溶液中に浸漬して酵
   素を繊維状変性ポリビニルアルコールに吸着させ
   ることを特徴とする固定化酵素の製法。