JPS6180053A - タンパク及び核酸の銀染色法 - Google Patents

タンパク及び核酸の銀染色法

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JPS6180053A
JPS6180053A JP60206713A JP20671385A JPS6180053A JP S6180053 A JPS6180053 A JP S6180053A JP 60206713 A JP60206713 A JP 60206713A JP 20671385 A JP20671385 A JP 20671385A JP S6180053 A JPS6180053 A JP S6180053A
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JP60206713A
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デユーク・ハイ・リー
トマス・ジヨセフ・オコンネル・サード
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマトリックス％特にポリアクリルアミドのよう
な電気泳動マトリックス中の含有されるタン／ぞり又は
核酸を可視化する方法に関する。
は気泳動は生化学において周知の分析技術である。試料
をマトリックスに入れ、電場に露出する。′ｉｔ場は成
分の荷電、分子量その他の物理的及び化学的性質によシ
、試料中の種々の成分を異なった速度でマトリックス内
を移動させる。
移動がおこって故、得られる移動のパターンが確認され
る。移動パターンをＲ１認する櫨々の方法が開発されて
いる。これらはオートラジオグラフィー及び０］′視又
は磯度計法央定のための染色を包含する。典型的な染色
は色素クーマシーブリリアントブルー及びボンンー８を
包含する。
銀染色は染料により生じるものよシ感度を増大させるた
めに使用される。広く１史用される銀染色技術はノリル
外の［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ
第９６巻、第２３０貞（１９８５ンに記載されているも
のである。、覗気永動マトリックス、特にポリアクリル
アミドは酸か又は酸／アルコール溶液に約１時間凌漬し
てマトリックス中にタンパクを１足させる。仄（で、典
型的には６０分間マトリックスを１５ｔ、浄する。次に
マトリックスを重クロム酸溶液に約５分開設してタン、
Ｊりを酸化する。次に、ケ′ルを硝酸銀溶液に２０分間
浸し、次に炭酸ナトリウム／ホルムアルデヒド緩向液で
６しってタンパク及び核酸に結合している銀イオンを還
元する。次に銀の−ぞター／を現謙する。現ｆＩＪを酢
酸で停止させる。次にこの、ｏターンを直接視覚による
か又は機器技術によって分析する。
ノリル外の方法はオークレー外の（「Ａｎａｌｙｔｔｃ
ａＩＢｌｏｃｈｅｍ、Ｊ第１０５巻、第６６１頁（１９
８０）参照」によって簡易化された。電気泳動ゲルを非
緩衝グルタルアルデヒドで処理してタンパクを交さ結合
させた。洗って後ケ゛ルをアンモニア性銀溶液で処理し
た。クエン酸とホルムアルデヒドとを組合せて使用して
銀イオンを銀に還元した。
タンパク及び核酸の光学的検出のための銀染色技術の感
度は、マトリックスが少なくとも１つのスルホン酸基及
び少なくとも１つの芳香族三級アミン（好適にはオキサ
ゾール基の一部として）を有する高度芳香族化合物より
なる固定化剤で処理されると、爽貞的に牧舎することが
できることが見出された。好適な化合物は（ただしＲは
Ｈ、ＯＨ３，０２Ｈ５又はＣＨ２Ｎ”（ＯＨ３）。
である）、 及び よりなる群から選択される。場合により、マトリックス
は硫化ナトリウム、ジチオスレイトール、チオ尿素及び
チオ硫酸ナトリウムよシなる群から選択される増感剤で
処理される。
その外、核酸の光学的検出のための銀染色反賞的に改善
することができる。
タンパク及び核酸双方に対する感度の増大はこれらの固
定化剤がタンパク及び核酸を交さ結合することができ、
一方同時に、銀と配位コンプレックスを形成することが
できる三級アミンを含有する芳香環を与えることによる
ものと考えられる。
第１の態様においては、本発明は矢の工程、すなわち （ただしＲはＨ％ＯＨ３，０２Ｈ５又は優Ｎ”（ＯＨｓ
）３である）、 及び よりなる群から選択される固定化剤とマトリックスを接
触させ・ （ｂｌ　　場合により硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチ
オスレイトール及びチオ硫酸ナトリウムよシなる群から
選択きれる増感剤とマトリックスを接触させ、 （ｃ）　　マトリックスχ銀イオンと接触させ、そして ＋ｄＪ　Ｗイオンを金、病原に還元することができる現
隊剤とマトリックスを接触させる ことよりなるマトリックス中のタンパク又は核酸の検出
法である。
、ｇｚの態様においては、本発明は次の工程、すなわち （ａ）式 （式中ｎは３〜１０の整数である）の化合物よシなる挿
入剤とマトリックスを接触させ、（ｂ）　　マトリック
スを洗浄剤とセ触させて逍剰の挿入剤を除去し、 （ｃ）　　マトリックスを銀イオンと接触させ、そして （ｄ）　　銀イオンを金属恢に還元することができる現
慮剤とマトリックスを接触させる ことよりなるマトリックス中の核酸の検出法である。
マトリックス中のタンパク及び核酸を電気泳動分離する
技術は周知である。特に好適なマトリックスはポリアク
リルアミドゲルである。他のマトリックスとしては１桟
、アガロース、ニトロセルロース等がある。本方法は４
気泳動マトリツクス中のタンパク及び核酸の光学的検出
に限定されず、薄層クロマトグラフィーのような他のマ
トリックス中のタン・ぞり及び核酸のパターンを測定す
るのに所用することができる。
タンパク及び核酸の光学的侠出の＠せＶζは、式 （ただしＲはＨ％ＵＨ５、Ｃ２Ｈ５又は０Ｈ２Ｎ　（Ｏ
Ｈ５）５であるン、 及び （ｉｉｉｌ　　　　　　　　　　　ＣＨ５一− の化合物よりなる群から選択される固定化剤を含Ｈスる
溶液にマトリックスを浸漬する。上の式の化合物（１）
が好適であシ、以下ｐｏｐｏｐ−ジスルホン酸という。
好適な浴漱は５０％のメタノール、１２係の酢酸及び３
８憾の蒸留水（写ｆ）中ａ、ＯＳ％（Ｗ／Ｖ　）のＰＯ
ＰＯＰ−ジスルホン酸ヨリする。温置時間は央験的に決
定され、主としてマトリックスの厚さに依存する。例え
ば、寸法１４Ｘ１６Ｘ（］、１５ｃＰＩＬのポリアク’
）ｙｖ７ミに’マトリックスの場合には、最適固定時間
は一定の攪拌下約４５分である。
次に、マトリックスを増感用溶液に浸漬することができ
る。増感用溶液はジチオスレイトール、チオ尿素、チオ
硫酸ナトリウム及び硫化ナトリウムよりなる群から選択
される化合物を含有する。好適な化合物はジチオスレイ
トールである。好適な溶液は蒸留水中５　ｎｇ／−のジ
チオスレイトールよりなる。＃述したマトリックスの場
合典型的な温性は約１５分である。
次に、マトリックスは硝酸銀溶液、一般に蒸留水中０．
１　％硝ポ耀に浸漬される。マトリックスはちｔ拌下約
３０分間諷にされ。。
次に、マトリックス中タンノ々り又は核酸のパターンを
決′アする。一般１・Ｃ、マトリックスを蒸留水申す＋
空かにｌノ’Ｅ浄し、現（炭ｒｏｌｌ　ＲＪ液液中みや
かにすすぐ。現１ｙ剤はｐＨか１１〜１２であり、ホル
ムアルデヒドを８有する塩基圧板１時液である。
好適な緩衝剤は炭酸ナトリウム及び燐酸ナトリウムであ
シ、後者が最も好適である。好適な溶液は３％（ｗ／ｖ
　）炭酸ナトリウム又は０．５％（ｗ／ｖ　）燐酸ナト
リウム及び蒸留水リットルあたり（Ｌ５−のホルムアル
デヒド（５７重量％）である。
次にマトリックスをふたたび現１象剤溶液で洗う。
最後に現像剤溶液中マトリックスを５分〜１時間現１象
する。最適時間は試料負荷の程度及びマトリックスの特
性に帰せられる背景染色に依存する。
最後に、現像剤の…を炭酸塩ベースの現像剤の場合には
約６に、或いは燐酸垣ベースの現１家剤の場合には７に
下げることによってマトリックス中の反応を停止させる
。便利な方法は現像剤溶液に直接クエン酸を添加するこ
とよりなる。
本発明は５１！１工程、固定がタンパク分子中に存在す
るアミノ基とＰＯＰＯＦ−ジスルホン酸又は他の固定化
剤中に存在するスルホン酸基との間の化学的相互反応忙
主るという点で先行技術と異なっている。芳香族モノス
ルホンばによる塩基性又は中性アミノ酸の析出は報告さ
れている〔スイダ＃Ｗ、Ｚ、著「Ｐｈｙｅｉｏｌ、ｃｈ
ｅｍ、Ｊ　５０．７４（１９Ｇ６）参照〕。芳香族スル
ホン酸はずぺての菫のアばノ酸と塩との形成が予想でき
る程度の強酸である。中性又は塩基性タンパクのスルホ
ン酸塩の多くが瘍けにくいことは、明らかに一般に認証
されていない。タンノ署り分子中アミノ基は銀のようｔ
並用と目ｄ位コンプレックスをＪ形成する。
しかし、タンパク中のアミノ基がスルホン酸ト相互反応
する時には、望素原子の金属イオンとコンプレックスを
形成する能力が、矢なわれる。
しかし、芳香族スルホ／ｑで刀・それ自材アミノ基を有
丁勺揚合にはタフバクスルホン酸塩の配位の改頁は多−
されない。
ポリアミノ芳香族スルホン酸誘導体の大部分は黒か又は
きわめて暗い色の材料であシ、銀条ｊ！！、操作におい
てあまり用途はない。本発明中開示されているスルホン
酸は固体状態で黄又は褐色である。しかし、固定工程に
おいて便用される希薄溶液は無色である。不溶性の塩形
成を生じる化学的相互反応の方法は、特に低分子被タン
パクの場合、本発明に池の銀染色法よ）有利な感度を与
える。
タンパクとコンプレックスを形成した蝋は硫黄の存在下
に比べ的谷易に還元される。チオ尿素及びその誘導体は
ハロゲン化続の表向に強く吸層され、次に分解して硫化
物を形成する〔ジェームス、・Ｔ、Ｈ，及びバンセロウ
・Ｗ、著「Ｊ−ＰｈＱｔｏ−８ｃｉ、４１，１３３（１
９５３）参照〕。チオ硫酸ナトリウムも増感剤として作
用すること刀工知られている〔ウッド、、　）（、Ｗ、
著「Ｊ　−Ｐｈ　ｏ　ｔ　ｏ　−Ｓ　ｃ　ｉ　−Ｊ　２
　＊　１５４　（１９５４）参照〕。マトリックス中タ
ン／ぐり又は核酸上沈積した銀は、硫黄含有化合物の存
在下洗より比較的ｄ易に還元される。硫化銀は銀イオン
の還元のための触媒として作用すると考えられる。
０．０１〜０．０５％の両度の硫化ナトリウム、チオ尿
素、ジチオスレイトール及びチオ硫酸ナトリウムは銀イ
オンをＪｆｉ感させるために１更用することができる。
本発明に従って１史用される７１〜当な固定化剤の製造
を以下に説明する。
ｆｌ）　　４．４’−Ｃ１，４−フェニレンヒ゛ス（２
，５−オキサグールンイル）〕−ヒ゛スヘ／センスルホ
ンｌ：１Ｉ２（ＰＯＰＯＦ−ジスルホン酸）の製造以下
Ｖｃ連べるように元煙硫雇を用いてＥ’０ＰＯＰ〔１，
４−ビス（５−フェニルオキサゾール−２−イル）−ペ
ンセン〕をスルホン化することによってＰＯＰＯＦ−ジ
スルホン酸を製造する。
２０％発煙硫酸（オウリウム）１ｏｏ＊を５００−のフ
ラスコ甲に仕込む。撹拌を開始し、　ＰＯＲ）Ｐｓａ、
ｏｒを小片づつ添加する。反応は発熱を滲う。
添加が完了して鏝、反応混合物を攪拌下約９０〜１００
℃において２時間加熱する。次に反応混合物を攪拌下砕
氷５００ｆに注ぐことによって反応混合物を急冷する。
輝黄色の沈澱がきわめて微ｌ洲な粉末として析出する。
得られた懸濁液を１夜放置する。仄に生成物を中程度の
多孔性フリット型ガラスビュヒナー１斗上に集める。こ
こで渠められた生成物は洗浄すべきでもなく、フィルタ
ーケーキをかきまぜるべきでもない。
フ・「ルターケーキからできるだけ多くの液体を除去す
る。次にペースト状フィルターケーキを２／１　（ｖ／
ｖ）水／メタノール又は１／２０／１０端塩収／水／メ
タノール２０〇−中攪拌するこトニヨって洗浄する。き
わめて濃密なは−ストが生成するので、水単独を１史用
するべきでない。生成物がこまかく分数されるまで撹拌
を継続する。
久Ｖｃ＠濁岐を短時間沈降させ、Ａ−空１過によって固
体を集めるつ洗浄過程は１回くり返すべきである。次に
生成物を６０〜７０℃において真空炉中で乾燥する。典
型的な収磯は６７〜７３ｔ（９０〜９４苗）である。
（ＩＩ）　　４．４’−（１，４−フェニレンビス（４
−メチル−２，５−オキサン“−ルジイル）〕−ビスベ
ンゼンスルホン戚（ジメチル−ＦＯＦＯＦ　−’；スル
ホン酸）の製造 ｐｏｐｏｐ−ジスルホン酸の装造についてと同じ操作を
吏用して、発煙硫酸を用いてジメチルｐｏｐｏｐをスル
ホン化することによってジメチル−ｐｏｐｏｐ−ジスル
ホン酸を製造する。
（ＩＩＩ）　　２．２’−［：　２，５−チオフェンジ
イル）ヒ゛ス〔５−（１，１−ジメチルエチル オキサゾールースルホン酸（ＢＢＯＴ　−　）スルホン
酸）の製造 以下に記述するとお９発煙硫酸を用いてＢＢＯＴ〔２．
５−ビス（５−で−ブチル−２−ベンゾアゾリル（チオ
フェン）〕をスルホン化することによってＢＢＯＴ−ジ
スルホン酸を製造する。
２０％発煙硫酸１００−を５００−の三角フラスコ中に
仕込む。磁石攪拌下、ＢＢＯＴ　６　０　ｆを少量づつ
添加する。反応は発熱を伴う。添刀口が完了して後、反
応混合物を９０〜１００℃において２時間加熱する。次
に、反応混合・物を砕氷５００２に注ぐことによって反
応を昆曾′切を急冷する。
微細な粉末として（４色の生成１勿が析出する。フリッ
ト型のガンスビュヒナーＵ斗上生成吻を染める。次に、
ＩＮ　Ｊ４ｉ１ｉ４　２　０　［１　ｍｔ甲ｊ五丁半す
ることによって生成物を洗？了ｔする。洗浄を数回くり
返す。
次に生成物を６０〜７０Ｃにおいて轟望炉中で乾１栗す
る。典型的な成品ＩＩ−ｉ７５〜８（１（８５’〜９６
％）である。
１１Ｖ）　　Ｎ，Ｎ，Ｎ　−　）、リフチル−２−フェ
ニル−５−（４−スルホフェニル）−４−ｉキｆゾール
メタ／アンモニウム水酸化吻（内部埴）イソニトロンプ
ロピオフェノン（イーストマン・オルガニック・ケミカ
ルズ社［）１００Ｆ（６１３ｍＭ）及びベンズアルデヒ
ド６５Ｐ（６１３ｍＭ）を氷酢酸に溶解した。黄色の沈
澱が生成するまで侃住ド浴液に聰化水索をバブルさせた
。
沈澱物を集め、白くなるまでエーテルで洗浄した。この
生成物を加熱下にメタノールに溶解し、水酸化す）　Ｉ
Ｊウムで中和した。生成物、２．５−ジフェニル−４−
メチルオキサゾール−Ｎ−オキサイドをエタノールに浴
解し、新たに活性化したラネーニッケル触媒と共にパル
水ｇ（ＩＮ加びんに入れ、真空によって脱ガスした。久
にこの系に水素ガスを仕込んで約３気圧の圧力にした。
水素が消費されなくなり、シリカゲル上８：１へ牛サン
／酢酸エチルを便用する薄層クロマトグラフィーが出発
物質のないことを示すまで、補充の水素を添加して反応
をイ１ト続した。触媒を１過し、溶媒を蒸留し、得られ
た２．５−ジフエニル−４−メチルオキサゾールの白色
結晶を真空炉中乾燥した。収量は１１０ｊ’（８０％）
であった。
２．５−ジフェニル−４−メチルオキサゾール５０？（
０，２１モル）を四塩化炭ｇ２５０−に溶解した。触媒
ｔ（約２５叩）の過酸化ベンゾイルを添加し、溶液を加
熱還流した。還流下の混合物に塩化スルフリル（１７ｄ
；０．２１モル）を滴加し、還流を約１時間継続した。
混合物を室温まで冷却させた。溶媒を減圧下に除去し、
残った生成物、４−クロロメチル−２，５−ジフェニル
オキサゾールをエタノールから再結晶した。収−ｒ＃は
４７？（８０％）であった；融点１５８〜９℃。
２０％発煙硫酸６０−を２５０ｆＩｌｔのフラスコ中に
仕込んだ。攪拌下、４−クロロメチル−２，５−ジフェ
ニルオキサゾール４０？を少量づつ添加した。反工６は
発熱を羊う。添加が完了して後、反応四合物を９０〜１
００℃において２時＋＝を加熱した。次に、反応混合物
を撹拌Ｆ砕氷３００？に注ぐことによって反応物を急冷
した。微細な粉末として生成物が析出した。得られた＠
　７Ｉ！液を１夜放置した。次に生成物を中程度の多孔
性フリット型ガラスビュヒナーＪ」斗上／’過した。析
出物をゾ１　（ｗ／ｖ）水／メタノールで洗浄した。次
Ｋ、生成物、ａ−クロロメチル−２−フェニル−５−（
４−スルホフェニル）オキサソールを６０〜７０℃にお
いて真空炉中で乾燥した。収量は４（１（８０％〕であ
った。融点〉６００℃。
エタノ−／Ｌ１５００−中で４−クロロメチル−２−フ
ェニル−５−（４−スルホフェニル）−オキサゾール２
０．６　ｆ　（５６ｍＭ　）を攪Ｉ半した。撹拌した溶
液中にトリメチルアでンをバブルした。
最初、すべての材料が浴液となり、久に白色沈澱が生成
しはじめた。シリカケ゛ル上１：１ツタノール／酢酸エ
チル（Ｖ／Ｖ　）を１更用する薄層クロマトグラフィー
が出発物質のないこと゛を示すまで、反応混合物中への
トリメチルアばンのバブリングを継続した。析出物を集
め、エタノールで洗浄した。収量は１７．　Ｏｒ　（８
３％）であった。
（Ｖ）２．２’−（１，４−）二二しン）ヒ゛ス（：　
Ｎ、ＮｊＪ−トリメチル−５−（４−スルホフェニル）
〕−〕４−オキテゾールメタンアンモニウムジ水酸化吻
ビス内部塩）の製造 四塩化炭素ｓ　ｏ　ｏ　ｍｔｖｃ　１．４−ビス（４−
メチル−５−フェニルオキサソール−２−イル）ヘンゼ
／２３ｊ’（６０ｍＭ）を俗解した。触媒償の過酸化ベ
ンゾイルを添加し、溶液を加ＰＡ還流した。
還流下の溶液に四塩化炭素１０ｍ１ＶＣ浴解した塩化ス
ルフリ／Ｌ／（１０づ；６３ｍＭ）を滴加した。約４時
間還流を継続した。塩化スルフリルの添加が完了して後
、混合物を１夜室温まで放冷した。
析出した生成物をＩ濾過によって集め、塩化メチ”　カ
ラ４Ｊ＋Ｐａ　晶Ｌ　タ。収＋ｒｔｉ’ｉ　Ｉａ７Ｆ（
６５′ＪＩ））　テあった。１：８アセトン／クロロホ
ルムを使用するＴＬＯは出発９勿質を示さなかったが、
数１固の小さいスポットを示した。
２０′名発煙硫酸７５−に攪拌下１．４−ビス（４−ク
ロロメチル−５−フェニルオキ？　７”　−ルー２−イ
ル）ベンゼン（１ａ７Ｆ；４０ｍＭ）を少量づつ添加し
た。反応は発熱を伴った。龜加後、反応混合物を約９５
〜１１０Ｃに加熱した。次に、２００２の砕氷に反応混
合物を注ぐことｒこよって反応物を急冷した。黄褐色の
析出４勿を１夜放置した。
次に、生成！＃ヲフリノトｍガラスビュヒナーＣ斗上に
集め、水で数回洗浄した。次に生成物を６０〜７０＠に
おいて真空炉中乾燥した。収量は１２ｙ（６０％）であ
った。
マトリックス中核酸を光学的検出する場合には、式 （式中ｎは３〜１０の整数である）の挿入、交さ苗台試
薬を含有する浴液にマトリックスを浸漬する。好適な溶
成はこの試薬Ｑ、０５％、５０％（Ｖ／ｖ）のメタノー
ル、１２　％　（ｖ／ｖ）の酢酸及び水よシなる。温置
時間は実験的に決定される。
寸法１４×１６ＸＱ、１５ｃｌＬのポリアクリルアミド
マトリックスの場合には、マトリックスを攪拌下約４５
分間温性する。
次に、水中１０％（Ｖ／Ｖ）のエタノール及び５％（Ｖ
／Ｖ　）の酢酸よりなる浴液中でマトリックスを洗浄す
る。この溶液中渣拌下約１５分間この溶液を温性する。
次に、マトリックスを蒸留水中クエン酸１５分間洗浄す
る。更に２回マトリックスを新しい水で洗浄する。
次に、硝酸銀溶液中にマトリックスを温性する。好適な
溶液は、蒸留水中０．１勢のＡｇＮＯ３二勺なる。典型
的な温置時間は３０分である。
次に、マトリックスを蒸留水中すばやく洗浄し、典型的
には蒸留水リットルあた９６頒のＮａ２００５　及（ｊ
　Ｏ，５ｍｔのホルムアルデヒドよシなる現像剤浴液中
マトリックスを洗い、現像剤中でふたたび洗い、最後に
核酸負荷及び背景染色によって５分〜１時間マトリック
スを現像剤に浸漬することによって核酸パターンをｆＡ
ＩＲする。
最後に、現像剤溶液の−を約３に下げることによって現
像を停止させる。梗利な方法は現像剤溶液に蒸留水中ク
エン酸の溶液を直接添加することよりなる。上述した４
ＰＪ剤浴液について１吏用するのべ好適な浴を夜は２．
６Ｍクエン酸である。
アクリジン誘導体プロフラビンは主として塩基対の間の
芳香族発色団の挿入（ｉｎｔｓｒｃａｌａｔｌｏｎ）に
よって２本鎖ＤＮＡ　Ｋ結合することが認められた〔ラ
ーマン＋　Ｌ、５．著ｌＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．Ｊ　３
．１８（１９６１）参照〕。種々の連結基によって結合
している２つ又はそれ以上の発色団は、対応する単一発
色団よりはるかに大きいＤＮＡ及びＲＮＡＮ和親を有す
ることを示した〔キング・Ｈ，Ｄ、　、ウイルンハＷ、
Ｄ、及びギヤビイ−Ｅ、著１”：、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ　２１．４９８２（１９８２）参照〕。連結するパ
ラフイ／鎖が６つ又はそれ以上のメチレン基を有してい
るシアクリジン、頑は、６つより少くないメチレン基を
もつものよシ挿入研究において竹効であること刀・明ら
かにされている〔カネ２キス外著、ＪＢｉｏｃｈｉｍ−
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、Ｊ４４１８巻、第２７７　
員（１９７６）参照〕。本発明中使用するのく適当なシ
アクリジン類は３〜１０個の炭素原子のパラフィン鎖に
よって２つの芳香族発色団が連結されているものである
。好】菖なシアクリジン類は４〜８１固の炭素原子によ
って分離されているものである。
５〜７個によって分離されているものが更に好適である
。最も好適なのはその合成が後述されるシアクリジン、
即ち６個の炭素原子のパラフィン鎖によって２つの発色
団が分離されているものである。
核酸に対する本発明の銀染色法は固定工程が、固定と交
さ納金を生じる鎖間または領内挿入による化学的修飾と
の組合せであり、先行技術とは異なる。交さ結合された
傾は優先的にマトリックス中に保持され、感度がより犬
きくなる。
この挿入の過程は本発明の方法を他の染色法に比して感
度を有利にしている。固定用溶液の挿入能は特に低分子
薫核酸の場合に感度を強化する要因となる。最も好適な
挿入剤、Ｎ、Ｎ−ジー（９−アクリジル）　−１，６−
ジアミツヘキサンは６つのメチレン基の直鎖によって分
離されている２つのアクリジニウム部分を有し、２つの
異なるＤＮＡ鎖と相互作用することができる。このこと
は明らかにマトリックス中で比較的小さい分子を保持す
るのに役立つ。
Ｎ、Ｎ’−ジー（９−アクリジル）　−１，６−ジアミ
ツヘキ丈ンは次のとおり製逅することができる。
エタノール１００ゴ中９−クロロアクリジ／２１、３５
　？　（０，１モル）及び１．６−ジアばノヘキサン５
．８ｆ（０，０５モル）の溶液を窒素気流中２時間還流
した。反応混合物を原容の＋７ｉＫなるまで娘縮し、１
Ｍ水性Ｎａ０Ｈｆｉ液１２０１ｒＪｔｉＣＰｒ、いだ。
生成物を塩化メチレンで抽出した。乾燥塩化メチレン浴
液を蒸発乾固し、残留物をｆｆ１ｔＯＨ１０ＨＣ／、　
５から結晶化させて黄色結晶を得た。ｍ、ｐ、は１７８
〜１８０℃であった。収１ｌ−ｊ６７％であった。
特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパ１− １：　ペシ 外２名

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）次の逐次工程、すなわち （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＲはＨ、ＣＨ＿３、Ｃ＿２Ｈ＿５又はＣＨ＿２
    Ｎ＾＋（ＣＨ＿３）＿３である）、 ▲数式、化学式、表等があります▼及び ▲数式、化学式、表等があります▼ よりなる群から選択される固定化剤とマトリックスを接
    触させ、 （ｂ）マトリックスを銀イオンと接触させ、そして （ｃ）銀イオンを金属銀に還元することができる現像剤
    とマトリックスを接触させることよりなるマトリックス
    中のタンパク又は核酸の光学的検出法。 ２）更に、工程（ｂ）及び（ｃ）との間に硫化ナトリウ
    ム、チオ尿素、ジチオスレイトール及びチオ硫酸ナトリ
    ウムよりなる群から選択される増感剤とマトリックスを
    接触させる追加の工程よりなる特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ３）固定化剤が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲはＨ、ＣＨ＿３、Ｃ＿２Ｈ＿５又はＣＨ＿２Ｎ
    ＾＋（ＣＨ＿３）＿３である）の化合物である特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ４）固定化剤が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５）固定化剤が更にＣＨ＿３ＯＨ及びＣＨ＿３ＣＯＯＨ
    よりなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）増感剤がジチオスレイトールである特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ７）銀イオンが硝酸銀として供給される特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ８）現像剤が燐酸ナトリウム及びホルムアルデヒドより
    なる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９）マトリックスがポリアクリルアミドゲルである特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 １０）固定化剤が ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、マトリックスがポリアクリルアミドゲルであり
    、増感剤がジチオスレイトールであり、固定化剤が更に
    ＣＨ＿２ＯＨ及びＣＨ＿３ＣＯＯＨよりなり、銀イオン
    が硝酸銀として供給され、現像剤が燐酸ナトリウム及び
    ホルムアルデヒドよりなる特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 １１）次の逐次工程、すなわち （ａ）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｎは３〜１０の整数である）の化合物よりなる挿
    入剤とマトリックスを接触させ、（ｂ）マトリックスを
    洗浄剤と接触させて過剰の挿入剤を除去し、 （ｃ）マトリックスを銀イオンと接触させ、そして （ｄ）銀イオンを金属銀に還元することができる現像剤
    とマトリックスを接触させることよりなるマトリックス
    中核酸を可視化する方法。 １２）ｎが４〜８の整数である特許請求の範囲第１１項
    記載の方法。 １３）ｎが５〜７の整数である特許請求の範囲第１２項
    記載の方法。 １４）ｎが６である特許請求の範囲第１３項記載の方法
    。 １５）洗浄剤が水である特許請求の範囲第１１項記載の
    方法。 １６）銀イオンが硝酸銀として供給される特許請求の範
    囲第１１項記載の方法。 １７）現像剤が燐酸ナトリウム及びホルムアルデヒドよ
    りなる特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １８）マトリックスがポリアクリルアミドゲル又はアガ
    ロースゲルである特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １９）マトリックスがポリアクリルアミドゲル又はアガ
    ロースゲルであり、挿入剤が特許請求の範囲第１１項記
    載の式（式中ｎは６である）の化合物よりなり、洗浄剤
    が水であり、銀イオンが硝酸銀として供給され、現像剤
    が炭酸ナトリウム及びホルムアルデヒドよりなる特許請
    求の範囲第１１項記載の方法。 ２０）（ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＲはＨ、ＣＨ＿３、Ｃ＿２Ｈ＿＿５又はＣＨ＿
    ２Ｎ＾＋（ＣＨ＿３）＿３である）、 ▲数式、化学式、表等があります▼及び ▲数式、化学式、表等があります▼ よりなる群から選択される化合物よりなる固定化剤、 （ｂ）硫化ナトリウム、チオ尿素、ジチオスレイトール
    及びチオ硫酸ナトリウムよりなる群から選択される増感
    剤、 （ｃ）現像剤、並びに （ｄ）停止剤 よりなるマトリックス中タンパク及び核酸の光学的検出
    用キット。 ２１）現像剤が燐酸ナトリウム及びホルムアルデヒドよ
    りなる特許請求の範囲第２０項記載のキット。 ２２）停止剤がクエン酸よりなる特許請求の範囲第２０
    項記載のキット。
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NZ (1) NZ213559A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0280958A (ja) * 1988-09-16 1990-03-22 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 銀染色法及び銀染色剤キツト

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703016A (en) * 1986-05-05 1987-10-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Silver stain for rapid, quantitative detection of polypeptides and nucleic acids
US4946794A (en) * 1986-12-18 1990-08-07 Protein Databases, Inc. Visualization of proteins on electrophoresis gels using planar dyes
US4812412A (en) * 1987-02-26 1989-03-14 Health Research Inc. Standard specimen and method of making and using same
US5064768A (en) * 1988-09-16 1991-11-12 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Silver staining technique and kit
US6074818A (en) * 1990-08-24 2000-06-13 The University Of Tennessee Research Corporation Fingerprinting of nucleic acids, products and methods
WO1992017611A1 (en) * 1991-03-28 1992-10-15 The University Of Tennessee Research Corporation Dna silver staining
US5422277A (en) * 1992-03-27 1995-06-06 Ortho Diagnostic Systems Inc. Cell fixative composition and method of staining cells without destroying the cell surface
US5595878A (en) * 1995-06-02 1997-01-21 Boron Biologicals, Inc. Detection of biopolymers and biooligomers with boron hydride labels
EP0963435B1 (en) 1997-01-08 2008-05-28 Invitrogen Corporation Methods for production of proteins
AU2002230438A1 (en) * 2000-11-20 2002-06-03 Invitrogen Corporation Materials for enhancing staining of biopolymers in matrices
JP2008547035A (ja) * 2005-06-27 2008-12-25 インヴィトロジェン コーポレーション ネイティブゲル電気泳動用の液体状タンパク質マーカー
WO2008042495A2 (en) 2006-07-21 2008-04-10 Life Technologies Corporation Sharply resolving labeled protein molecular weight standards
CN112920174B (zh) * 2021-02-02 2022-11-04 上海交通大学 一种光敏感型化合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB631184A (en) * 1946-10-01 1949-10-28 Eastman Kodak Co Improvements in the processing of photographic materials
US2548552A (en) * 1947-10-04 1951-04-10 Eastman Kodak Co Acidifying compound for photographic baths
CH304715A (de) * 1951-03-17 1955-01-31 Cassella Farbwerke Mainkur Ag Verfahren zur Herstellung einer fluoreszierenden heterocyclischen Verbindung.
US2696439A (en) * 1952-01-04 1954-12-07 Levinos Steven Photographic stabilization process
US3148194A (en) * 1961-07-03 1964-09-08 Arapahoe Chemicals Inc Certain 1, 4-bis[2(4-substituted, 5-phenyloxazolyl)] benzenes
US3326685A (en) * 1964-04-27 1967-06-20 Eastman Kodak Co Lithographic process using a stop bath
US3622332A (en) * 1968-04-19 1971-11-23 Itek Corp Photographic process with improved activator composition
US4405720A (en) * 1981-03-04 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Silver stains for protein in gels
US4434234A (en) * 1981-04-02 1984-02-28 The Upjohn Company Method and kit for silver staining substances supported in matrix
US4416998A (en) * 1981-04-02 1983-11-22 The Upjohn Company Silver stain procedure and kit for same
US4459356A (en) * 1982-02-11 1984-07-10 Georgetown University Radioactive staining of gels to identify proteins
US4468466A (en) * 1982-02-16 1984-08-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Silver stains for protein in gels--a modified procedure

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0280958A (ja) * 1988-09-16 1990-03-22 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 銀染色法及び銀染色剤キツト

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AU4764385A (en) 1986-03-27

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