JPH0280958A

JPH0280958A - 銀染色法及び銀染色剤キツト

Info

Publication number: JPH0280958A
Application number: JP63232058A
Authority: JP
Inventors: Yoriyoshi Ehata; 順良江幡; Hiroko Tanaka; 裕子田中; Akiko Negishi; 根岸　章子
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-03-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、電気泳動分析等において支持担体上に分画さ
れた蛋白質、核酸、糖及び脂質等の如く支持担体上に分
画された生体成分の検出を目的とする銀染色法の改良方
法に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

銀染色法は、検出すべき物質（以下「被検物」という）
を含む支持担体を固定化剤で処理し被検物を固定化した
後、前処理し、次いで銀染色液で処理したのち還元剤で
現像する方法であシ、蛋白質、核酸、糖、脂質等被検物
の低濃度試料即ち、血清、尿、脳を髄液等を濃縮操作を
行うことなく、分析することが可能で生化学研究、臨床
検査等において広く利用されている有用な分析法である
。

銀染色の染色方法は、種々報告されているが、（生化学
５２巻、４１）頁、１９８０年。

蛋白質、核酸、酵素２７巻、１２７７頁。

１９８２年、　Ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒ＊ｍ１ｇ　２巻
、１３５頁及び１４１頁、１９８１年）、いずれも染色
が完了するまで長時間を要したシ煩雑な操作を必要とし
更に得られた銀染色像も■被染色物質によシ染色性が異
なる、■高濃度試料では完全に染らない（中抜は状態と
なる）、■パックグラウンド上昇によりコントラストが
悪い等多くの問題点をもち、改善が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、斯る問題点を解決すべく、銀染色法の操
作時間の短縮、染色能の向上及びコントラストの改善を
目的として鋭意研究をおこなっていたところ、銀染色液
中の銀イオンはチオ尿素の存在で容易に還元され、しか
も還元された銀の黒化の程度もチオ尿素の硫化増感によ
り増強されることを見出し、本発明を完成した。

耶ち本発明は、被検物を分画した支持担体を固定化剤で
処理し被検物を固定化した後、増感剤で前処理し、次い
で銀染色液で処理したのち還元剤で現像する銀染色法に
おいて、固定化剤及び増感剤の一方又は両方にチオ尿素
を含有せしめることを特徴とする銀染色法及びこれに用
いる銀染色剤キットを提供するものである。

本発明の銀染色法に用いられる固定化剤の好ましい例と
しては、炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸を含
有するものが挙げられる。炭素数１〜４の低級アルコー
ル濃度テは、例えばメチルアルコール、エチルアルコー
ル、ｎ−７”ロピルアルコール、インゾロビルアルコー
ル、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、第
二級ブチルアルコール、第三級ブチルアルコールなどが
挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、ノロピオン
酸のよりな一塩基酸をはじめ、コハク酸、酒石酸のより
な二塩基酸やクエン酸のような三塩基酸も用いることが
できる。

固定化剤中ヘチオ尿素を配合する場合、その濃度は、α
０ＱＯＯＩ　Ｗ／Ｖ％以上であればよいが、通常α００
１〜αＩ　Ｗ／Ｖ％の濃度が好ましく用いられる。上記
固定化剤中のアルコール濃度は特に限定されないが、通
常１０〜６０Ｖ／Ｖ％の濃度が好ましく用いられる。

また、有機酸の濃度は、５Ｗ／Ｖ％以上であればよいが
、通常１０〜３０Ｗ／Ｖ％が好ましく用いられる。

固定処理は、チオ尿素と低級アルコール及び有機酸を含
む溶液で１回行うだけでもよいが、好ましくは、例えば
（１）初め低級アルコール及び有機酸よりなる第１固定
化剤で処理後、チオ尿素、低級アルコール及び有機酸よ
りなる第２固定化剤で処理する方法、（ｉｉ）初めチオ
尿素、低級アルコール及び有機酸よシなる第１固定化剤
で処理後、低級アルコール及び有機酸よシなる第２固定
化剤で処理する方法、（ｉ）チオ尿素、低級アルコール
及び有機酸よりなる固定化剤を二つに分け、同じ操作を
２回行う方法等二段階でおこなわれる。これら２段階処
理する方法に於ては、通常第１固定化剤中のアルコール
濃度は、第２固定化剤中のアルコール濃度より高いこと
が望ましく、固定処理の為の浸漬時間は第１固定１０分
程度、第２固定１５分程度くらいで充分である。

また、本発明方法において前処理のために用いられる増
感剤としては、例えばジチオスレイトール及びグルタル
アルデヒドを含有するものが挙げられる。

増感剤中ヘチオ尿素を配合する場合、その濃度は０．０
０００１〜０．０１　Ｗ／Ｖ％の濃度であればよいが、
通常０．０００２〜０．０００５Ｗ／Ｖ％が好ましく用
いられる。ジチオスレイトール（ＤＴＴ　）　ｆａ度は
、特に限定されるものでないが、通常α０００２〜αＯ
Ｏ２Ｗ／Ｖ％が好ましく用いられる。グルタルアルデヒ
ド濃度はα００５Ｗ／Ｖ％以上であればよく、通常０．
００５〜α２Ｗ／Ｖ％が好ましく用いられる。

前処理は、固定化剤で固定化された支持担体を増感液に
浸漬することによシおこなわれ、この浸漬時間は１０分
程度で充分である。

本発明に用いられる銀染色液は特に限定されないが、例
えば硝酸銀、Ｒ−ＮＨ２（但しＲ−ＮＨ２はアンモニア
又は第１級アミンを示ス）で表わされる化合物及び苛性
アルカリを分子量比として１：４５〜ｌ　５　；　ｔ　
ｏ〜２＆０の割合で含有するものが好ましい。また、硝
酸銀の濃度も特に限定されないが通常０．０５〜０．４
ｗ／ｖ％が好ましい。

銀染色処理は、固定・増感処理された支持担体を銀染色
液に浸漬することによりおこなわれ、その浸漬時間は１
０〜１５分で充分である。

また、現像に用いる武元剤としては、例えばホルムアル
デヒドとクエン酸を含有するものが挙げられ、この還元
剤中のホルムアルデヒド濃度は通常０．００１Ｗ／Ｖ％
以上、好ましくはα０１〜０．０４Ｗ／Ｖ％である。ま
た、クエン酸濃度は、α０００５Ｗ／Ｖ％以上であれば
よいが、通常０．００２〜０．ＯＩＷ／Ｖ％が好ましい
。ホルムアルデヒドとクエン酸の重量比は１：０゜２５
〜０．５が好ましい。

この還元剤による現像時間は５〜１０分で充分である。

なお、本発明に使用される支持担体としては、通常網目
構造を有するポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル
及び寒天ゲル等の高分子担体より成る支持担体が代表的
なものとして挙げられる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明
はこれら実施例により伺ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１　血清タンノ９り分画の染色１　電気泳動〔試薬の調製〕 ■　支持担体市販されている電気泳動用破りアクリルアミド　グラジ
ェントグル　５Ｄ８−ＰＡＧ　ｆレート４／２０　（第
−化学薬品製）を使用した。

■　試料処理液４．３ｗ／ｖ％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０２Ｗ／
Ｖ％ブロムフェノールブルー及び３０　Ｖ／Ｖ％グリセ
ロールを含む、０．１２５Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ
ｉ（６，８）を調製した。

■　試料水で５０倍に希釈した正常人血清を更に水で２．４．８
．１６．３２．６４．１２８．２５６．５１２倍希釈し
たものと、試料処理液を各々等量混合し、沸騰水中で５
分間煮沸処理したものを調製した。

■　泳動用緩衝液０１Ｗ／Ｖ％ドデシル硫酸ナトリウムを含む、α０２５
Ｍ　トリス−α１９２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ＆４）を
調製した。

〔泳動操作〕

支持担体を泳動槽に装着した後、泳動用緩衝液を充填し
た。試料を各々５μｔずつ支持担体のサンｆＡウェルに
アゾライし６０ｒｎ人定電流で約１時間泳動を行った。

■　銀染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤メタノールｓ　ｏ　ｖ／ｖ％及び酢酸１０Ｗ／Ｖ％を含
む溶液を調製した。

■　第２固定化剤メタノール３０ｖ／ｖ％、酢酸１０Ｗ／Ｖ％及びチオ尿
素α００２５Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　増感剤メタノール５０Ｖ／マ％、ジチオスレイトールα０００
５Ｗ／Ｖ％及びグルタルアルデヒドαＩＷ／Ｖ％を含む
溶液を調製した。

■　銀染色液硝酸銀０．２Ｗ／Ｖ％、アンモニアα１４Ｗ／Ｖ％及び
水酸化ナトリウムα２Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　還元剤ホルムアルデヒド０．０２Ｖ／マ％及びクエン酸α００
５Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　停止剤クエン酸１０Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

〔染色操作〕

泳動操作後の支持担体を第１固定化剤で１０分間振とう
浸漬し、次いで第２固定化剤で１５分間振とり浸漬した
。支持担体を増感剤で１０分間振とり浸漬した後、イオ
ン交換水で５分間振とう水洗した。支持担体を銀染色液
で１５分間振とう浸漬した後、イオン交換水で２分間ず
つ３回振とり水洗した。支持担体を還元剤で染色像が現
われるまで振とり浸漬した（約５分）後、停止剤を加え
、現像を停止した。

以上の染色操作に於ける総所要時間は６６分であった。

実施例２　血清タン、ｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤メタノール３０Ｖ／Ｖ％及び酢酸１０Ｗ／Ｖ％を含む溶
液を調製した。

■　増感剤メタノール５０　ｖ／ｖ％、ジチオスレイトール０．０
Ｏ０５Ｗ／Ｖ％、グルタルアルデヒドα１Ｗ／ｖ％及び
チオ尿素Ｑ、０Ｏ０２５Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した
。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例３　血清タン／Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤実施例１と同じ ■　増感剤実施例２と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例４　血清タン）Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例５　血清タン、ｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例４と同じ ■　第２固定化剤実施り１）２と同じ ■　増感剤実施例２と同じ ■　優染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１ど同じ〔染色操作〕、Ｉり／−ル５０　ｖ／ｖ％、酢酸１０Ｗ／Ｖ％及びチ
オ尿素０．（１０２５Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　第２固定化剤実施例２と同じ ■　増感剤実施例１と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例１と同じ実施例６　血清タンノ々り分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例１と同じｑ）第２固定化剤実施例１と同じ ■　増感剤メタノール５０Ｖ／Ｖ％、ノチオスレイトール（Ｌ００
０５Ｗ、／Ｖ％及びチオ尿素α０００２５Ｗ／Ｖ％を含
む溶液を調製した。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例７　血清タン、Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤実施例１と同じ ■　増感剤メタノール５０　ｗ　／　Ｖ％、グルタルアルデヒドα
０５Ｗ／Ｖ％及びチオ尿素α０００２５ｗ　／　Ｖ％を
含む溶液を調製した。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例８　血清タン、ｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤実施例１と同じ ■　増感剤メタノール５０　Ｖ／Ｖ％及びチオ尿素α０Ｏ０２５Ｗ
／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例９　血清タン、Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例４と同じ ■　第２固定化剤実施例２と同じ ■　増感剤実施例６と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例１０　血清タンノｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例４と同じ ■　第２固定化剤実施例２と同じ ■　増感剤実施例７と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例１）　血清タン、９り分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例４に同じ ■　第２固定化剤実施例２に同じ ■　増感剤実施例８に同じ ■　銀染色液実施例１に同じ ■　還元剤実施例１に同じ ■　停止剤実施例１に同じ〔染色操作〕実施例１に同じ実施例１２　血清タン／ｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　固定化剤メタノール３０　Ｖ　／　Ｖ　％、酢酸１０Ｗ／Ｖ％及
びチオ尿素０．００２５Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した
。

■　増感剤実施例１と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕泳動操作後の支持担体を固定化剤で１０分間振とり浸漬
した後、増感剤で１０分間振とり浸漬し、次いでイオン
交換水で５分間振とう水洗した。支持担体を銀染色液で
１５分間振とり浸漬した後、イオン交換水で２分間ずつ
３回水洗した。支持担体を還元剤で銀像が現われるまで
振とり浸漬した（５分）後、停止剤を加え、現像を停止
した。

以上の染色操作に於ける総所要時間は５０分であった。

実施例１３　血清タン／Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　固定化剤実施例１２と同じ ■　増感剤実施例２と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１２と同じ実施例１４　血清タンノ９り分画の染色〔試薬の調製〕 ■　固定化剤メタノール３０Ｖ／Ｖ％及び酢酸１０Ｗ／■％を含む溶
液を調製した。

■　増感剤実施例２と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１２と同、じ実施例１５　血清タン、Ｑり分画の染色〔試薬の調製Ｊ ■　固定化剤実施例１４と同じ ■　増感剤実施例７と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１２と同じ実施例１６　血清タン／Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　固定化剤実施例１４と同じ ■　増感剤実施例８と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施何重と同じ〔染色操作〕実施例１２と同じ実施例１７　血清タン、ｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　固定化剤実施例１４と同じ ■　増感剤実施例６と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１２と同じ比較例　血清タン／ｅり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固定化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤実施例２と同じ ■　増感剤実施例１と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作ｊ実施例１と同じ〔発明の効果〕以上述べた如く、本発明は支持担体上に分画された生体
成分の検出に用いられる銀染色法の改良技術を提供する
ものである。本発明の方法により、操作時間が大幅に短
縮され、作業操作性及び染色能が著しく向上し、得られ
た染色像のコントラストも充分に増強され顕著な効果を
奏するものである。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、検出すべき物質を含む支持担体を固定化剤で固定化
した後、増感剤で前処理し、次いで銀染色液で処理した
のち還元剤で現像する銀染色法において、固定化剤及び
増感剤の一方又は両方にチオ尿素を含有せしめたことを
特徴とする銀染色法。２、固定化剤がチオ尿素、炭素数１〜４の低級アルコー
ル及び有機酸を含有するものである請求項第１項記載の
銀染色法。３、固定化処理を２段階でおこなう請求項第１項または
第２項記載の銀染色法。４、増感剤がチオ尿素、ジチオスレイトール及びグルタ
ルアルデヒドを含有するものである請求項第１項記載の
銀染色法。５、（１）炭素数１〜４の低級アルコール、有機酸およ
びチオ尿素を含有する固定化剤、（２）ジチオスレイト
ール及びグルタルアルデヒドを含有する増感剤、（３）硝酸銀、アンモニアもしくは第１級アミン及び苛
性アルカリを含有する銀染色液、及び（４）ホルムアルデヒド及びクエン酸を含有する還元剤を含む銀染色剤キット。６、（１）炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸を
含有する固定化剤、（２）ジチオスレイトール、グルタルアルデヒド及びチ
オ尿素を含有する増感剤、（３）硝酸銀、アンモニアもしくは第１級アミン及び苛
性アルカリを含有する銀染色液、及び（４）ホルムアルデヒド及びクエン酸を含有する還元剤を含む銀染色剤キット。７、（１）炭素数１〜４の低級アルコール、有機酸およ
びチオ尿素を含有する固定化剤、（２）ジチオスレイト
ール、グルタルアルデヒド及びチオ尿素を含有する増感
剤、（３）硝酸銀、アンモニアもしくは第１級アミン及び苛
性アルカリを含有する銀染色液、及び（４）ホルムアルデヒド及びクエン酸を含有する還元剤を含む銀染色剤キット。