JPS61501006A - 光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 “・に　な４−アミノ−３−ヒドロキシ　・及に１野 本発明はＬ−力ルニチン及び開運化合物の製造において鍵中間体として機能する 化合物の調製方法に関する。

さらに詳しくは、未発明は光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸の調 製方法に関する。

１１亘週 ４−アミノ−３−ヒドロ本シ酪酸は、次の構造式で特徴付けられ最初にＭ、トミ タによって合成された。

（Ｚ　、　Ｐｈ７ｓｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、、１２４　、２５３　（１９２３） 　、モしてＴ、ハヤインによって１９５９年ラットの脳中に検出された〔ム弛１ 甚堕工、上土５，５７０　（１９５９））。

この化合物の注目すべき重要性は、哺乳動物の中枢神経系統における神経ｙ４整 物質としてのその生物学的な活性から生ずるＣＭ。

オーツから、　Ｊ、　Ｎｅｕｒａｃｈｅｍ、、±８．２８７　（１９７１））、 なおユの４−アミノ酪酸との、そしてグルタミン酸及びグルタミンとの代謝相互 関係はそれのてんかんの治療への利用に関する興味を正当化する理由となる〔一 覧表に載っていない薬剤、１６．６Ｋ（１９６４）及び２５．１４１１　（１９ ７３））、その上、（Ｒ）＝４−７ミノー３−ヒドロキシ醋酸が重要な化合物、 Ｌ−力ルニチノへの価値ある前駆体であることは書類で立証されていることであ る。

上記化合物（１）の合成については４つの方法が報告されている。

これらの方法のうちで第１の方法は、２個の炭素原子を含む物質（例えば、グリ シン）を出発物質として用いる方法であるが、その方法における鍵中間体、４− フタルイミドクロトン酸の調製が第２の方法〔シ」■旦旦よりコ１，１１４，２ ５３　（１９２３））はフタルイミドをエピクロロヒドリンと反応させて１−ク ロロ−？−ヒドロキシー３−フタルイミドプロパンを形成し、次いで。

シアン化物との交換反応を行い、＠後に加水分解を行って化合物１を得る方法で ある。それの工業上の利用〔Ｍ、／・ヤイシら、日本特許７７２　（１９５８） ：ケミカル　アブス　ト　ラフ　ト　。

５３、Ｐ１１７２ｄ　（１９５９）；Ａ、ガラルド　スペイン特許２７８．７８ ０（１９６３）；Ｔ、ハヤイシ　フ　ラ　ン　ス特許１．３４８，１０５　（１ ９６４））にもかかわらず、この方法は、エビクロロヒドリンとシアン化物の毒 性のために重大な生態学上されるし１＼り制隈困難に直面していた。

第３の方法は４段階の反応シーケンスを必要とする。すなわちエチルアセトアセ テートのブロモ化、ケト基の還元、／＼ロゲンの水加化アンモニウムによる置換 、そして最後のエステルの加水分解であルＣＦ、テアａとＡ、？ッセリニ、む」 遣ジＬ−シし一旦り工、上９，３０（１９６４））、Ｌかしながら、４−ブロモ −３−ヒドロキシ酪酸エチルの核性置換の低反応性が全体の収率を低下させる結 果となっていた。

この問題を克服するために、第４の方法が開発されたＣＭ。

ピンチとＧ、ビー／　７　ｘす、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、、　６７．　 １２０（１９７８）ｌ）が、この方法は４−ブロモクロトン酸のアリル位の臭素 が核性置換に対してより反応性であるので４−ブロモクロトン酸を用いている。

上記の全ての合成法において、生じた４−７ミノー３−ヒドロキシ酪酸（１）は そのラセミ形である。しかしこのラセミ化合物は・冗長費用のかかる分割処理に よって分離することができるＣＭ。

トミタとＹ、センソ、、　Ｚ、　Ｐｈ　５ｏｉｌ　Ｃｈｅｗ、、上６９２６３（ １９２７））、ユの（Ｒ）形は、それが容易にメチル化によって重要な化合物で あるＬ−カルニチンに変換できるので特に有用である（Ｔ、ケネコとＲ，ヨシダ 、Ｂｕｌｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、Ｊａ　ａｎ　３５１１１５３　（１９６２ ））。

ｉ医二にｊ 本発明はＬ−カルニチンのような関連の化合物の調製への鍵中間体として役立た せることができる光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸の生産方法に 関する。特に、それは微生物酵素の作用によって３−ヒドロキシゲルタール酸ジ エステルの鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏｔｏｐｉｃ）エステル基の１つを不せい 的に開裂させる方法に関する。生じたキシル１１モノアントは容易に化学反応に よって、光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸に変換される。

本発明の目的は、微生物学的及び化学的方法の組合せによって光学的に活性な４ −アミノ−３−ヒドロキシ醋酸を生産することである。

本発明の目的は、さらに、Ｌ−カルニチン調製の鍵中間体である（Ｒ）−４−７ ミ／−３−ヒドロキシ醋酸を、容易に入手できるコストの適度な原料物質から合 成するための改良方法を提供することである。

さらに本発明の他の目的は光学的活性な３−ヒドロキシ−グルタル酸モノエステ ルから電子不足の窒素原子への転位を経て光学的に活性な４−アミノ−３−ヒド ロキシ酪酸を調製する方法を提供することである。

さらにまた本発明の目的は、光学的に活性な３−ヒドロキシ−グルタル酸モノエ ステルを生産する方法を提供することである。

本発明のこれらの目的及びその他の目的は、以下の説明によって明確になるであ ろう。

るため　ノ熊 β−ヒドロキシグルタル酸ジメチル又はジエチルのα−チモトリプシン（α−ｃ ｈＢｏｔｒｙｐｓｉｎ）による不せい加水分解は報告はあるが（Ｓ、Ｇ、：ｌ− ｘンとＥ、ケートウリ、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、８二３゜４２２ ８　（１９６１））、この加水分解の反応速度は非常に遅い。

その結果、反応を完結させるためには実質王化学量論量のα−チモトリプシンを 必要としく基質対酵素比は２：ｌ）、　これがこの方法を非常にコストの高い方 法にさせている。また、両（＋）及び（−）のメチルヒドロキンβ−７セトキシ グルタレートが化学的分割法により、ｉｍＶできたが（Ａｒｋｉｖ　ｆｕｒ　Ｋ ｅｍｉ、　Ｂｄｌ　Ｏ、ｒ＋ｒ　４　。

１３５　（１９５６））、これらのプロセスが冗長で、収率は比較的低かった。

これと対照的に、本発明の方法によって、微生物的酵素の加水分解的作用（エス テラーゼ）を用いることによって、不せい加水分解が達成され、（＋）又は（− ）β−ヒドロキシグルタル酸モノエステルのいずれかを一層経済的に得ることが できる。

広義には、本発明は微生物エステラーゼ酵素、カルボキシエステラーゼを用いて 、ＲＯ２，ＣＣＨ２−ＣＨ０ＨＣＨ２Ｃｏ２Ｒ（：ＣでＲはＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ ３）の式をもっβ−ヒドロキシグルタル酸ジエステルを不せい加水分解の触媒的 反応に付すことを含む。

さらに、目的のカルボキシエステラーゼを作り出す微生物であればどのようなも のも、この不せい加水分解に対して触媒的に機能させることができることが見出 された。特に好適なものは、アートロパクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）　 、アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｓｒ、シトロバクタ−（虹■並肛 旦旦、コリネバクテリア（恒Ｈ社江二止りす）、ミコバクテリア（口ｃｏｂａｃ ロエ二〇及びロードコツカス（社旦匹王」」属の微生物である。

Ｒ＝ＣＨ５又は０２Ｈ５ 生じた光学的活性のβ−ヒドロキシグルタル酸モノエステルのヒドロキシル基を 保護したのち、β−７セトキシグルタル醜モノエステルをナイトレン（電子不足 の）中間体を経て転位に付すことができる。そしてこれは、炭素から窒素へ電子 対が移り、アルキル基移動を引き起し、インシアネートを生じる。そのインシア ネートをアルカリ加水分解することにより所望のアミンが得られる。

たができる、当事者にとって機構的に同様の転位反応、例えばホフマン、シュミ ット、及びクルチウスの転位もこの変換を行うのに用いることができる。都合上 、我々は、クルチウスの反応を説明のために選んだが、この転位は高度に機能化 した基質において妥当な収率で達成することができる。

所望のカルボキシエステラーゼ活性をもつ微生物は微生物学の技術分野で周知で あり本発明方法を行うにあたりそのような微生物のいずれも使用することができ るが（Ｋ、キースリッヒ、非−ステロイド環状化合物の″微生物的変換″　（ゲ オルグチーメ、パブリッシャーズ、シュラットガル）（９７６）参照〕ここに特 に説明した微生物の属のいずれも特に好適である。

そのβ−ヒドロキシグルタル酸ジエステルは標準的な組成の栄養培地中に混入さ れ、その培地中で微生物が培養され次いでその加水分解的変換を行わせるために 、通常の発酵条件が採用される。あるいはまた１例えば酵素を放出させるための 細胞の溶解によって、あるいはそのままにした細胞を新鮮な水性媒体中に懸濁さ せることによって、微生物の＃ｉＩ殖する培Ｊ１！！ｔｒｒら活性素が取り出さ れる。この加水分解による変換は、補酵素を必要としないので、細胞と酵素は、 固定化してさらにプロセスのコストを低減させるのに適しているという独特の特 長を有する。これらの技術のいずれの場合も微生物によって作り出される活性酵 素が存在する限り、エステル基は不せい的に開裂されるであろう。

もちろん、温度、時間及び圧力条件のようなそれによってβ−ヒドロキシグルタ ル酸ジエステルと加水分解酵素との接触が行われるようなことは、この技術分野 の当策渚にとって明白なように相互依存的である０例えば、温和な加熱を大気圧 下で行えばもし室温で、他の条件を同じにした時に進行するよりも必要とする時 間はより短かい、もちろん、温度、圧力又は時間のいずれも、基質が劣化する程 度を越えるへきでない、有機体の生長培地が用いられるときは、有機体がカルボ キシ−エステラーゼ酵素を破壊させるに十分の量のタンパク質分解酵素を作り出 す前に殺されないように反応条件は十分に温和なものでなければならない、一般 に大気圧、温度は約１０℃から約３５℃１時間は約１２時間から約１０日間の範 囲であることができる。

下記の例によって生産された生成物は核磁気共鳴（ｎｍｒ）、赤外吸収スペクト ル、及び薄層クロマトグラフィー移動度によって化学構造確認した。光学的純度 及び生成物の絶対的配列はそれらの施光値を文献に報告されている値と比較する により証明し、ざらにＬ−カルニチンへの転換率で確認した。

医」 Ａ、及苦　下記の組成の寒天上で増殖した１連合のア　−トロ／−クターエスビ ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ、）（ＡＴＣＣ１９１４０）の寒天斜面から の一奔鋒−−４表＃肴璽物′をダラム 寒天　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・２０７ヘクト（Ｂａｃｔｏ）−ビーフェキス・・・・・・　３バク トーペプトン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　５（１５分 間　７−Ｏｐ、ｓ、ｉ　で殺菌）０．８５％の塩溶液５ｍ２中に懸濁した。この 懸濁液１ｍ文ずつを、それぞれ次の培地（ディフコ栄養スープ）５０ｍＡを含む ２５０ｍＭエルレンマイヤーフラスコ（Ｆ−１段階）に接特するのバクトービー フエキス・・・・・・・・・・・・・・・・・・　３７へクトーペプトン・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　５茫留水（十分に）・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　１ｉＰＨ６〜８（１５分間　３０ｐ 、ｓ、ｉ下で殺菌された） このフラスコを２５℃でロータリーシェーカー（２５０サイクル／ｍ１ｎ−２” 半径）上で２４時間培養し、次いでその５容量％をジフコ栄養スープ５００ｒｎ ｌを含む２文エルレンマイヤーフラスコに移した。゛同様に、１０％　Ｔｖｅｅ ｎ　８０．０．２ｍＭ中の２．２ｇのジエチル−３−ヒドロキシグルタレート（ アルドリッチ）を添加し、最終的な基質濃度０．２％を得た。こ（７：ｌＦ−２ 段階のフラスコをＦ−１段階のフラスコの培養で用いたと同様の条件下でさらに ４８時間培養した。

Ｂ、！　基質の添加の４８時間後、培地のＰＨが２に低下するまで６Ｎ　ＨＣＡ を添加して、Ｆ−２段階を終了した。内容物をシーライトのパッドを通してろ過 し、ろ液を酢酸エチル（３Ｘ５００口文）で抽出した。−緒にした有機抽出物を 硫酸ナトリウム上で乾燥後、減圧下で儂縮して残留物（２、７ｇ）を与えた。こ の残留物をシリカゲル（ＭＮ、キーゼルゲル６０．ブリンクマン）カラム（１， ２ｘ４０　ｃｍ）上でグロマトグラフィーにかけた。この方ラムをヘキサン−酢 酸エチル（１：　１）からなる溶剤系で溶離させてエチル水素−３（Ｓ）−ヒド ロキシゲルタレ−）　１．４４ｇを得た。

Ｃ，ジエチル−３−ヒドロキシグルタレートの微生物的加水分解の進行は、ＰＦ ２５４インディケータを含む、ブリンクマン２０Ｘ　２０　ｃｍ　（ＥＭ）プレ ート（０，２５ｍｍ厚）シリカゲルを用いて薄層クロマトグラフィー分析によっ て追跡することができる。用いた溶剤系は、ヘキサン−酢酸エチル−酢酸（１０ ：１０：１）であった。

形 基質としてジメチＪＬ／−３−ヒドロキシグルタレート？用いテ例１の手順を繰 り返し、モノメチル−３（Ｓ）−ヒドロキシゲルタレ−）（（ａ）Ｄ＋ｌ、４° 　（Ｃ１２，１、アセトン）を生成物として得た。

源 微生物コリネ／（クチリア　エクイ　（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｌＩｌｅ 　ｕｉ）（Ｉ　ＦＯ−３７３０）を用いて例１の手順を繰り返して、モノエチル −３（Ｓ）−ヒドロキシグルタレート、〔α）Ｄ＋１．５”（アセトン）を収率 ８５％で得た。

旧 全生物　ミニバクテリア　エスピー（Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓ　−）（ ＮＲＲＬ　１５０５１）を用いて例１の手順を繰り返した。モノエチル−３（Ｓ ）−ヒドロキシグルタレート、　〔ぺ）＋１．５＠（アセトン）を収率５０％で 得た。

ガｊ 微生物ロードコツカス　エクイ　（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅ　ｕｉ）（Ａ　 Ｔ　ＣＣ２１６９０）を用いて例１の手順を繰り返した。モノエチル−３（Ｓ） −ヒドロキシグルタレート、　（〔α）Ｄ＋　１．４°（アセトン））を収率６ ０％で得た。

氾 基質としてジメチル−３−ヒドロキシグルタレートを用いた以外は同様にして例 ３の手順を繰り返してモノメチル−３（Ｓ）−とトロ午シグルタレート、　〔α ）Ｄ＋　１．４’″　（アセトン）、を生成物として得た。

医１ ジメチル−３−ヒドロキシグルタレートを用いた以外は同様にして例５の手順を 繰り返してモノメチル−３−（Ｓ）−ヒドロキシグルタレート、〔α逅＋１．３ °　（アセトン）、を生成物として得た。

酊 全生物アシネトバクタ−ローフ　イー　（Ａｃｉｎｅｔａｂａｃｔｅｒ　Ｉｏｗ ｆｉｉ）（ＡＴＣＣ２９０６４）　を用いてモノｘチル−３（Ｓ）−ｉニトロキ シグルタレート、〔α）−１，７２°　（アセトン）、を収率８゜％で得た。

■ 微生物シトロバクタ−７０インデ４　（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄ ｉｉ）（ＡＴＣＣ６７５０）を用いて例１の手順を繰り返してモノエチル−３（ Ｓ）−ヒドロキシグルタレート、〔α）＋１．３８°　（アセトン）を収率６０ ％で得た。

且ユ」 Ｓ　−千　−エチル　−３−ヒドロキシグルタレートのＲ−−４−７ミノー３− ヒ１０キシ　への゛ピリジン（６ｍＭ）中のエチル水素β−ヒドロキシグルタレ ート（１，１４ｇ、〔α）Ｄ＝＋１．５°、アセトン）の溶液に無水酢酸（０、 ８ｍｆｌ）を添加し、その混合物を乾燥雰囲気中で４時間かきまぜた。その混合 物を酢酸エチル（７５ｍＭ）で希釈し、水（７５ｍＭ）　で洗浄した。有ｍｅを １０％ＨＣ１（６０ｍＭ）、水（２５ｍＭ）及び食塩水（２５ｍ９．）で洗浄し た。水層を各々の場合に酢酸エチル（，７５ｍ交）でもどって洗浄した。有機層 溶液を一緒にして乾燥した（Ｎａ２ｓｏ、）、減圧下で溶剤を除いて、その酢酸 エステルを淡黄色の油（１，２８２ｇ）として得た。このものは、次の段階へ直 接用いることができる十分な純度を有することがｎｍｒにより判定された。

アルゴン中で〜６℃で、ベンゼン（１８ｍｊＤ中の粗エチル水素β−７セトキシ グルタレート（１，２８２ｇ）にオキザリルクロリド（１，９ｍ文）を数分間か けて添加した０反応を室温まで温まるようにし、次いで５時間かきまぜた。溶剤 を、回転蒸発で除去し、そして褐色の油を短時間でポンプで取り出した。その酸 クロリドを次の段階に直接使用した。

アセトン（１０ｍＪ１）中のその酸クロリドの溶液に、０℃で、アジ化ナトリウ ム（１，３ｇ）の水（１２ｍＭ）溶液を２．３分間かけて添加した。その混合物 を０℃で１５分間かきまぜた。アイスへスを取り去り、混合物をさらに１５分間 かきまぜた。その混合物を水（１００ｍ４）で希釈し、ベンゼン（２Ｘ７５ｍ文 ）で抽出した。そのベンゼン溶液を食塩水（１２５ｍＭ）で洗浄し、乾燥しく　 Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ４）　、そしてろ過した。

上記のベンゼン中のアジドの溶液を乾燥雰囲気中で〜７０時間還流した。減圧下 で溶剤を除去して、インシアネートを与えた。ＩＲ〔フィルム、ｃｍ−１２９８ ０，２２６０，１７４０，１３７０，１２２５、ｌ　Ｏ３０）褐色の油（１，ｊ ９０ど）インシアネート（７３０ｍｇ）に１８％ＨＣＱ　（８ｍＭ）を装入し、 １００〜１１０℃（油溶温度）で４時間加熱した。室温で１８時間かきまぜを行 ったのち、水とＨ（、Ｑを回転茄発で除去した。粗褐色ガム状物をポンプで取り 出した。生成物を少量の水に溶解し、Ｄｏｗｅｚ（Ｉ　Ｘ　４．　−ＯＨカラム 、長さ７ｃｍ、幅２ｃｍ）にかけた。

カラムの溶出を木（１００ｍ文、５％Ｎ　Ｈ４０Ｈ（１００ｍ　ｌ　）及び最後 に１５％Ｎ　Ｈ４０Ｈ（１５００ｍ文）で行った。溶出液１５％ＮＨ，ＯＨを蒸 発させて（Ｒ）−（−）−４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸を白色結晶状固体（ １７２ｍｇ、ｎｍｒスペクトルによれば純粋）として得た。エチル水素β−ヒド ロキシグルタレートからの生成物の全体収率は３６．４％に相当する（　（ａ） ｎ＝”−１，６，９”　、　Ｈ２０）　−上記の例ではヒドロキシ基はアシル化 （エチル水素β−ヒドロキシグルタメートをピリジン溶剤中の無水酢酸と反応） によって保護されたが５反応と保護機構はこの技術分野では周知である。また。

所望なら、アＶｊし化の代りに、この技術分野で周知の如くヒドロキシ基の保護 はアルキルシリルもしくはテトラヒドロピラニル基の付加によるようにエーテル 化により得ることができる。

このように　本発明方法において光学的に活性なモノエステル（β−ヒドロキシ グルタル酸モノエステル）を転位反応に付す前に、ヒドロキシ基はアシル化又は エーテル化機構のいずれかにより保護される。

国際調受報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．光学的活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸の調製方法であって 式ＲＯ２ＣＣＨ２−ＣＨＯＨＣＨ２ＣＯ２Ｒ（ここでＲはＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ ３からなる群から選ばれる）をもつβ−ヒドロキシグルタル酸ジェスチルを、ア ートロバクター、コリネバクター、アシネトバクター、シトロバクター、ミコバ クテリア及びロードコッカス属から選ばれた微生物によって作り出されるカルボ キシエステラーゼ酵素の発酵作用にさらし、不せい加水分解して、対応の光学的 活性なβ−アセトキシグルタル酸モノエステルを回収し そのモノエステル中に存在するヒドロキシ基を保護しこの保護モノエステルを転 位反応に付して対応のインシアネートを得 そのイソシアネートをアルカリ加水分解に付しそして 光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸を回収する、ことからなる方法 。
2. ２．ＲがＣＨ３である請求の範囲１の方法。
3. ３．ＲがＣＨ２ＣＨ３である請求の範囲１の方法。
4. ４．転位反応がクルチウスの転位反応を経て行われる請求の範囲１の方法。
5. ５．転位反応がホフマンの反応によって行われる請求の範囲Ｉの方法。
6. ６．転位反応がシュミットの転位反応によって行われる請求の範囲１の方法。
7. ７．光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸の調製方法であって エチル水素β−アセトキシ−グルタレートをその酸クロリドに変換し その酸クロリドを転位反応させて対応のイソシアネートを得、そのイソシアネー トをアルカリ加水分解に付し、そして 光学的に活性な４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸を回収する、ことからなる方法 。
8. ８．転位反応がクルチウスの転位反応によるナイトレン中間体を通る請求の範囲 １の方法。
9. ９．４−イソシアナト−３（Ｒ）−アセトキシブチレート。