JPS6145621B2

JPS6145621B2 -

Info

Publication number: JPS6145621B2
Application number: JP6172678A
Authority: JP
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1978-05-25
Publication date: 1986-10-08
Also published as: JPS54154754A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規な抗エステラーゼ活性物質及びそ
の製造方法に関する。

更に詳しくは、本発明はエステラスチン又はテ
トラヒドロエステラスチンに化学的処理を加える
ことにより、原料であるエステラスチン又はテト
ラヒドロエステラスチンと同様に抗エステラーゼ
活性を有し、かつその阻止酵素群が拡大された新
規抗エステラーゼ活性物質３・５−ジヒドロキシ
−２−ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエノイツ
ク１・３−ラクトンまたは３・５−ジヒドロキシ
−２−ヘキシルヘキサデカノイツク１・３−ラク
トンを製造する方法及びそれらの新規抗エステラ
ーゼ活性物質に関するものである。

本発明で使用する原料物質エステラスチンは、
例えば微生物化学研究所溝内の土壌試料から分離
された放線菌ストレプトミセス・ラベンドレー
MD₄−C₁（微工研菌寄3723号）を培養し、その
培養物から抽出される物質であり（特願昭52−
12119号（特公昭60−8117号））、強力な抗エラス
テラーゼ活性を有している。

エステラスチンは液性抗体産生細胞を減少せし
め、又細胞性免疫に対しても抑制作用があり、免
疫反応によつて誘起される多くの難病即ち関節
炎、リウマチ、多発性硬化症等の治療薬として、
さらには臓器移植等にも安全に使用し得る新生理
活性物質である。研究の結果、本エステラスチン
は次の構造を有することが判明した。

又、テトラヒドロエステラスチンはエステラス
チンを酸化白金等の触媒を使用して接触還元する
ことにより得られる物質であり、エステラスチン
と同様に抗エステラーゼ活性を有している（本出
願人の同日出願に係る特願昭53−61725号発明の
命称「テトラヒドロエステラスチン及びその製造
法」特開昭54−154753号参照）。従つてエステラ
スチンのもつ免疫抑制作用に基づく多くの難病治
療薬として期待される物質であるが本発明ではエ
ステラスチンと同様に、これを原料物質として使
用する。

本発明者らの研究の結果、テトラヒドロエステ
ラスチンは次の構成を有することが判明した。

本発明者らはエステラスチンの構造研究中にエ
ステラスチン又はテトラヒドロエステラスチンを
化学的に処理することによりエステラスチンと同
様に抗エステラーゼ活性を有し、かつその阻止酵
素群が拡大された新規抗エステラーゼ活性物質を
２種取得することに成功し、本発明を完成した。

即ち、これら活性物質の一つ（後記の通り３・
５−ジヒドロオキシ−２−ヘキシルヘキサデカー
７・10−ジエノイツク１・３−ラクトンと命名）
はエステラスチンを弱アルカリ例えば0.01規定苛
性ソーダ溶液で加水分解することによつて得られ
る物質であり、もう一つの物質（後記の通り３・
５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデカノイ
ツク１・３−ラクトンと命名）は、テトラヒドロ
エステラスチンを弱いアルカリ例えば0.01規定苛
性ソーダ溶液で加水分解するか或は前記の通り、
エステラスチンを弱アルカリで加水分解すること
によつて得られる３・５−ジヒドロオキシ−２−
ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエノイツク１・
３−ラクトンを公知の水素添加触媒例えば酸化白
金、パラジウム等の触媒を用いて接触還元する二
種の方法によつて製造される。

エステラスチンを弱アルカリで加水分解して得
られる物質は無色油状物質であり、次の物理化学
的特状を有している。

比旋光度〔α〕^２６ _Ｄ−10゜（ｃ＝１、CHCl₃）、質
量分析法で測定した分子量350、元素分析値：
O75.76％、H10.86％、O14.00％であり、
C₂₂H₃₈O₃の分子式を有し、赤外部吸収スペクト
ル（臭化カリウム錠）で3500、3000、2930、
1820、1465、1380、1122、1070、880cm^-1に特異
吸収帯を有し、かつ核磁気共鳴スペクトル（重ク
ロロホルム溶液、δppm）で3.32（２位CH）、
4.47（３位CH）、〜2.0（４位CH₂、12位CH₂）、
3.79（５位CH）、2.32（６位CH₂）、2.80（９位
CH₂）、5.15〜5.72（７、８、10、11位CH）、〜
1.3（13〜15CH₂、2′〜5′CH₂）、0.89（16位CH₃、
6′位CH₃）、1.81（1′位CH₂）、〜２（OH）に吸収
を示す（前記式参照）。以上により本物質は次
の構造を有することが明らかである。

（３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクトン）一方、テトラハイドロエステラスチンを弱アル
カリで加水分解するか或いは３・５−ジヒドロキ
シ−２−ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエノイ
ツク１・３−ラクトンを接触還元して得られる
３・５−シヒドロオキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カノイツク１・３−ラクトンは白色粉末状の物質
であり、次の物理化学的性状を有する。

即ち、融点64.5〜65.5℃、比旋光度〔α〕^２６ _Ｄ−15
゜（ｃ＝１、CHCl₃）、元素分析値：C74.22％、H11.94％、O13.76％
で、C₂₂H₄₂O₃の分子式を有し赤外吸収スペクト
ル（臭化カリウム錠）で3550、2900、1815、
1470、1390、1135、1085、835、720cm^-1に特異吸
収帯を示し、かつ核磁気共鳴吸収（重クロロホル
ム、δppm）で3.31（２位CH）、4.46（３位
CH）、1.7〜2.6（４位CH₂、６位CH₂、1′位
CH₂）、3.76（５位CH）、1.3（７〜15位CH₂、
2′〜5′位CH₂）、0.89（16位CH₃、6′位CH₃）の吸収
を示す（前記式参照）。

以上により、本物質は次の構造を有することが
明らかである。

（３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カノイツク１・３−ラクトン）次に３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキ
サデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクトン
及び３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサ
デカノイツク１・３−ラクトンの製造の骨子につ
いて説明する。

エステラスチン又はテトラヒドロエステラスチ
ンをこれとほぼ等モル量の弱アルカリ溶液（アル
カリは0.01N程度の苛性ソーダ、苛性カリ等が使
用される。溶媒は水とジオキサン、水とアセトン
等の混合溶媒でその混合比は１：１が特に有効で
ある）に溶かし、室温中で一夜撹拌を続ける。加
温してもよろしい。この溶液をｎ−ヘキサンで抽
出すると３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘ
キサデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクト
ン又は３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキ
サデカノイツク１・３−ラクトンはｎ−ヘキサン
層に抽出される。

ｎ−ヘキサン抽出物は、次にシリカゲルカラム
クロマトグラフイーによつて精製する。溶出溶媒
はｎ−ヘキサン−クロロホルム混液（３：１）が
最適である。

このシリカゲルカラムクロマトグラフイーによ
つて３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサ
デカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクトン又
は３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カノイツク１・３−ラクトンは純品とすることが
できる。

３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カノイツク１・３−ラクトンは３・５−ジヒドロ
キシ−２−ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエノ
イツク１・３−ラクトンを水素添加触媒、例えば
酸化白金や、パラジウム等の触媒を用いて接触還
元することによつても得られる。

即ち、３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘ
キサデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクト
ンをメタノール等の有機溶媒に溶かし、酸化白
金、パラジウム等の触媒を加え、水蒸気流中又は
パールの還元装置により、２時間から一夜還元を
行なえば、３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシル
ヘキサデカノイツク１・３−ラクトンを得ること
ができる。この場合、原料である３・５−ジヒド
ロキシ−２−ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエ
ノイツク１・３−ラクトンが純品であれば還元後
の精製工程は不要である。

次に３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキ
サデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクトン
及び３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサ
デカノイツク１・３−ラクトンの抗エステラーゼ
活性を次の方法で測定した。

即ち、米国ニユトリチナル・バイオケミカル社
より市販されているブタの膵臓より得た粗酵素リ
パーゼを0.2％トリトン（Triton Ｘ−100）含有
0.05M 燐酸緩衝液（PH7.0）で0.5％濃度に溶解
した。この酵素溶液を0.03ml、0.05M燐酸緩衝液
を2.92ml、および定量されるべき検体を含む溶液
0.025mlとを互に混合した混合溶液（2.975ml）を
20℃、３分間加温した後これに10mg/mlのパラニ
トロフエニルアセテートのメタノール溶液0.025
mlを加えることにより反応を開始させる。20℃で
30分間反応した後、反応液の400nｍにおける吸
光度(a)を測定した。同時に検体を含まない緩衝液
のみを用いた盲検の吸光度(b)を測定し、エステラ
ーゼ阻害率を式〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×100により計
算した。

その結果、３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシ
ルヘキサデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラ
クトンと３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘ
キサデカノイツク１・３−ラクトンの50％阻止濃
度（ID₅₀）はそれぞれ、0.007μｇ/ml、0.009μｇ/
mlであつた。

一方、基質としてコレステロールアセテート、
酵素としてコレステロール・エステラーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社）を用い、37℃、30分間
で遊離するコレステロール量を測定することによ
り抗コレステロール活性を調べたところ、３・５
−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデカ−７・
10−ジエノイツク１・３−ラクトンはエステラス
チンの約20倍の効力（テトラヒドロエステラスチ
ンの約７倍）を示した。

これらの事から、本物質は抗エステラーゼ活性
物質として、エステラスチンと同様の治療効果が
期待できるのに加えて、新たに抗コレステロール
物質として血栓症および動脈硬化症等の治療薬と
しての可能性が考えられる。

又、３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキ
サデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクトン
と３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カノイツク１・３−−ラクトンはいずれもマウス
に対する毒性試験で250mg/Kgの腹腔内投与で全く
毒性が認められなかつた。

次に本発明の３・５−ジヒドロオキシ−２−ヘ
キシルヘキサデカ−７・10−ジエノイツク１・３
−ラクトン及び３・５−ジヒドロオキシ−２−ヘ
キシルヘキサデカノイツク１・３−ラクトンの製
造に関して参考例及び実施例を示すが、本発明は
これによつて限定されるものではない。

参考例１グリセリン1.5％、綿実粉（フアルマメデイ
ア）1.5％、食塩0.3％、Ｌ−アスパラギン0.2％、
消泡剤（アデカノール）0.005％からなる培地300
を570のステンレス製タンクに仕込み、120
℃、20分滅菌後、ストレプトミセスMD₄−C₁株
（微工研菌寄第3723号）の種培養液（通気撹拌培
養２日）30を植菌し、撹拌は毎分200回転、通
気量は毎分300であり、27℃、48時間培養を行
つた。この培養液を過して菌体を含む固型物
34.2Kgを得た。この固型物をエタノール100で
２回抽出し、抽出液を減圧下に９迄濃縮した。
これを酢酸ブチル６で２回抽出し、抽出液を減
圧下に濃縮して128.2ｇのエステラスチン粗粉末
を得た。（ID₅₀＝0.08mcg/ml）。

参考例２参考例１で得られた粗粉末は次の方法によつ
て、精製した。すなわち、粗粉末128.2ｇをクロ
ロホルム500mlに溶解し、シリカゲル（ワコーゲ
ルＣ−100）1.5Kgを充填した塔に通してエステラ
スチンを吸着させた。次いで塔をクロロホルム10
、クロロホルム−メタノール（100：１）10
で洗浄後、クロロホルム−メタノール（80：１）
で溶出した。活性分画2500mlを減圧下に濃縮乾固
すると4.83ｇの褐色粗粉末が得られた（ID₅₀＝
0.002mcg/ml）。次いでこの粗粉末をメタノール
20mlに溶解し、メタノールで膨潤させたセフアデ
ツクスLH−20、２の塔に通し、４のメタノ
ールで展開溶出した。活性分画を減圧下に濃縮乾
固することより656mgの淡黄色の粉末が得られた
（ID₅₀＝0.0004mcg/ml）。この粉末を酢酸エチル
５mlに溶解し、シリカゲル（ワコーゲルＣ−
300）250ｇの塔に通してエステラスチンを吸着さ
せた。更に塔を酢酸エチルで展開し、活性分画
1000mlを減圧下に濃縮乾固して白色粉末のエステ
ラスチン351mgを得た。（ID₅₀＝0.0002mcg/ml）。

参考例３エステラスチン95mgをメタノール10mlにとか
し、酸化白金20mgを加え、水素20LBSの圧力下で
２時間還元を行なつた。酸化白金を過して除去
し、液を濃縮する事によりテトラヒドロエステ
ラスチンの白色粉末96mgを得た。

実施例１エステラスチン275mgを0.01N NaOHの水ジオ
キサン１：１混液55ml溶かし室温で一晩撹拌した
後、ｎ−ヘキサン25mlで３回抽出した。ｎ−ヘキ
サン可溶物150mgをシリカゲルカラム（1.0×15
cm）にかけ、ｎ−ヘキサン−クロロホルム混液
（３：１）で溶出し、３・５−ジヒドロキシ−２
−ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエノイツク
１・３−ラクトン140mgを得た。

この物質はシリカゲル薄層クロマトグラフイー
でｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
（５：５：１）の系で展開し、Ｒ_f0.73に単一スポ
ツトを与えた。

実施例２テトラヒドロエステラスチン212mgを0.01N
NaOHの水−ジオキサン（１：１）混液46mlに懸
濁させ、室温で一晩撹拌した後、ｎ−ヘキサン50
mlで３回抽出した。ｎ−ヘキサン可溶物156mgを
シリカゲルカラム（1.0×15cm）にかけ、ｎ−ヘ
キサン−クロロホルム混液（３：１）で溶出し
３・５−ジヒドロオキシ−２−ヘキシルヘキサデ
カノイツク１・３−ラクトン106mgを得た。この
物質はシリカゲル薄層クロマトグラフイーでｎ−
ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチルの溶媒系で
展開しＲ_f0.74に単一スポツトを示した。

実施例３３・５−ジヒドロオキシ−２−ヘキシルヘキサ
デカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラクトン
140mgをメタノール10mlに溶かし、酸化白金40mg
を加え、パールの装置により、水素20LBSの圧力
下で２時間接触還元を行なつた。酸化白金を過
して除き、液を濃縮すると、３・５−ジヒドロ
オキシ−２−ヘキシルヘキサデカノイツク１・３
−ラクトン141mgが得られた。

本物質はシリカゲル薄層クロマトグラフイーで
ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチルの溶媒
系で展開しＲ_f0.74に単一のスポツトを示し、又
核磁気共鳴スペクトルで二重結合の完全な消失が
認められた。

Claims

【特許請求の範囲】１次の一般式〔但し、ＲはCH₃−（CH₂）₄−CH＝CH−CH₂−CH
＝CH−CH₂−又はCH₃−（CH₂）₁₀−を示す〕で表
わされる抗エステラーゼ活性物質。２次の一般式〔但し、ＲはCH₃−（CH₂）₄−CH＝CH−CH₂−CH
＝CH−CH₂又はCH₃−（CH₂）₁₀を示す〕で表わさ
れるエステラスチン又はテトラヒドロエステラス
チンをアルカリによつて加水分解し、次の一般式〔但し、Ｒは前記と同意義をもつ〕で表わされる
抗エステラーゼ活性物質３・５−ジヒドロキシ−
２−ヘキシルヘキサデカ−７・10−ジエノイツク
１・３−ラクトン又は３・５−ジヒドロキシ−２
−ヘキシルヘキサデカノイツク１・３−ラクトン
を製造する方法。３次の式で表わされる３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシ
ルヘキサデカ−７・10−ジエノイツク１・３−ラ
クトンを接触還元し、次の式で表わされる３・５−ジヒドロキシ−２−ヘキシ
ルヘキサデカノイツク１・３−ラクトンを製造す
る方法。