JPS6126360B2

JPS6126360B2 -

Info

Publication number: JPS6126360B2
Application number: JP57203916A
Authority: JP
Inventors: Kuniaki Hosono; Hideo Suzuki; Akio Sato
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1982-11-20
Filing date: 1982-11-20
Publication date: 1986-06-20
Also published as: JPS5995887A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般式で表わされる環状アデノシン3′，5′―モノリン酸
ホスホジエステラーゼ（以下PDEと略称する。）
阻害剤に関するものである。環状アデノシン3′，5′―モノリン酸（以下
CAMPと略称する。）は現在、ステロイドホルモ
ンを除く、他のほとんど全てのホルモンの第二の
伝達物質であることが明らかにされており、生体
における代射制御に関し重要な役割を担つてい
る。従つて、このcAMPを分解する酵素、PDEを
阻害することは細胞内のcAMPレベルを制御する
ことであり、種々の生理的効果が期待される。た
とえば糖代謝の改善、強心作用、平滑筋弛緩作
用、気管支拡張作用、冠状動脈拡張作用、脂質代
謝の改善、精神安定作用、体液分泌促進作用、ホ
ルモン分泌促進作用等の可能性を有する。また、cAMPの誘導体であるジブチリルアデノ
シン3′，5′―環状リン酸は培養細胞において、ガ
ン細胞の増殖とガン化を抑制することが知られて
いる。（「蛋白質、核酸、酵素」18巻、1195頁、
1973年）。このことよりPDEの阻害剤は抗ガン作
用を有する可能性が考えられる。更に、高血圧ラツトの血管中にはcAMP含有が
低いことが明らかにされ（「サイエンス」179巻、
807頁、1973年）抗高血圧作用や抗動脈硬化作用
をPDEの阻害剤が待つことが期待される。アレ
ルギーの発現にもcAMPが関与しており抗アレル
ギー、喘息防止等にも効果を示すものと思われ
る。この様にPDEの阻害剤は医薬として広範な
領域での利用が充分期待される。従来、PDE阻害剤としては、有機合成品であ
る、メチルキサンチン類、パパベリン、キナゾリ
ン誘導体や微生物の生産するデヒドロカフエー酸
ジラクトン、フエナジン誘導体、PDE―、
PDE―等が知られているが、本発明の阻害剤
のようなペプチド性物質によるPDEの阻害作用
の報告は無く、医薬あるいは研究用試薬等として
の利用が期待される。本発明物質の製法は本発明
者らが土壌中より新たにバチルス属菌を通常の好
気的培養することにより培養濾液中に産生させ、
これを回収することにより行われる。培養濾液中に産生される本発明物質は前記の一
般式に示されたアシル基を有するペプチドであつ
た、その物理化学的性質は次のとおりである。

【表】

【表】パーメチル化した化合物の質量分析スペクトル
に表われた分子イオンのフラグメントより構成ア
ミノ酸の配列順序は、Ｎ末端よりGlu、Leu、Leu
Val、Asp、Leu、Leuであることが認められた。
又、赤外吸収スペクトルに表わされたラクトン環
の存在はβ―水酸化脂肪酸とＣ末端アミノ酸の
Leuとが結合していることが化学分析により認め
られ、本発明物質の全構造は前記のものであるこ
とが認められた。次に本発明物質を生産する微生物としては、例
えば、本発明者らが今回新たに分離したバチルス
属細菌を例示できるが本菌株の菌学的性質は次の
通りである。菌学的性質グラム陽性の好気性桿菌で周鞭毛による運動性
を有し、胞子を形成する。肉汁寒天培地での生育状態は、中程度でバター
状の薄い黄褐色のコロニーを形成し、コロニー表
面はしわ状で鈍い光沢があり、培地の変化は認め
られない。生育試験７％塩化ナトリウム培地＋サブロー・デキストロース培地＋アジド培地 − 嫌気培養培地 − 生育温度 52〜15℃ 生成・分解試験色素の生成（ブドウ糖、チロシン） − アセトインの生成＋酸の生成（ブドウ糖、アラビノースキシロー
ス、マンニトール）＋デンプンの分解＋クエン酸塩の資化性＋プロピオン酸塩の資化性 − リゾチーム抵抗性＋インドールの生成 − 硝酸塩の還元＋カゼインの分解＋ミルクの加水分解＋ゼラチンの液化＋チロシンの分解 − 馬尿酸塩の分解＋卵黄反応 − カタラーゼ試験＋以上の形態学的、生理学的性質の結果、本菌株
はBergey ｓ Manual of Determinative
Bacteriology（第８版）及びThe Genus Bacillus
により検索した結果、馬尿酸塩を分解する点が一
致しないがBacillus subtillsと同定するのが最も
妥当であると思われる。なお、本菌株はBacillus subtilis Ｃ―756、微
工研菌寄第6785号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。実施例１本発明の阻害剤の製法及び分離精製について一
例を示す。ブドウ糖１％、ペプトン１％、酵母エキス0.3
％、塩化ナトリウム0.3％、硫酸マグネシウム0.1
％、リン酸二カリウム0.1％（PH6.8）よりなる培
地でBacillus subtilis Ｃ―756（微工研菌寄第
6785号）を30℃で２〜３日間培養した後、除菌
し、得られた培養濾液より阻害剤を得た。培養濾
液40lにPH２になるように濃塩酸を加えるか、終
濃度0.6％になるように硫酸銅を加えると阻害剤
は沈澱してくるので、これを集め、酢酸エチルで
数回抽出する。酢酸エチル抽出画分を重曹水で洗
浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮す
ると約14gの粗抽出物が得られた。次にこれをセ
フアデツクスＧ−50カラム（80mM トリス塩酸
緩衝液（PH7.5）にて流出）、シリカゲルカラム
（クロロホルムーメタノール、８：１にて流出）
に順次かけ活性画分として約8gが得られた。さ
らにセフアデツクスLH−20カラム（アセトンに
て流出）、シリカゲルカラム（クロロホルム−メ
タノール、５：１にて流出）により順次精製し、
無色非結晶性の粉末約3gを得た。これは薄層上
では種々の溶媒により単一スポツトを示すがオク
タデシル化シリカゲルのカラムを装備した高速液
体クロマトグラフイーによりさらに分離精製し本
発明の阻害剤を分離回収した。実施例２本発明物質のPDE阻害活性を測定するため
に、次の実験を行つた。酵素反応液1.0mlに40mMトリス塩酸緩衝液
（PH7.5）、2mM硫酸マグネシウム、0.5mM、
cAMP、PDE（140μｇ―蛋白量、ベーリンガー
マンハイム社製）、アルカリホスフアターゼ（70
μｇ―蛋白量、ベーリンガーマンハイム社製）と
阻害剤を添加し38℃で20分間反応させ、次いでト
リクロル酢酸で反応を停止後、酵素反応により
cAMPより遊離してくるリンの量を測定し、これ
を酵素活性とした。このような実験を複数行い阻
害率を次の式より算出した。阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×100（％）Ａ：阻害剤を含まない場合のリンの量Ｂ：阻害剤添加の場合のリンの量そして阻害率50％の時の阻害剤濃度C₅₀を求
めた結果8.1×10^-5Mであつた。実施例３本発明のラクトン環を形成しているβ―水酸化
脂肪酸とアミノ酸を決定するため次の化学分析実
験を行つた。阻害剤を水素化ホウ素リチウムで３種の方法に
より還元した後、塩酸加水分解し、アミノ酸の消
失を検討した。水素化ホウ素リチウムはエステ
ル、ラクトンを還元出来るが、カルボン酸は還元
出来ないという性質を有しているため、 (1) 前処理なしで直接還元する。 (2) 阻害剤をメチル化した後、還元する。 (3) アルカリで阻害剤のラクトン環を開環した
後、還元する。上記３種の還元の後、アミノ酸組成は各々 (1) Glu：Asp：Val：Leu＝１：１：１：３ (2) Glu：Asp：Val：Leu＝Ｏ：Ｏ：１：３ (3) Glu：Asp：Val：Leu＝１：１：１：４であり、この結果より、β―水酸化脂肪酸と結合
しているのはＣ末端Feuであることが証明され
た。実施例４本発明物質の構成脂肪酸の構造決定にあたり、
次の法則に従つて行つた。ガスクロマトグラフイーによる分析において物
質の炭素数を横軸に、その物質の保持時間の対数
を縦軸にとると、同系列内物質間では直線関係が
成立し、しかも比較的近縁の系列同志間ではこの
直線が互いに平行し合う（「メソツドオブバ
イオケミカルアナリンス、８巻」１頁1960
年）。この法則に基づき既知のβ―水酸化脂肪酸
のメチルエステルと、本発明物質由来の脂肪酸を
同一条件でガスクロマトグラフイーにより分析
し、構成脂肪酸はβ―水酸化イソペンタデカノイ
ツク酸であることを認めた。

【図面の簡単な説明】

図は本阻害剤の臭化カリウム錠中で測定した赤
外吸収スペクトルを示し、縦軸に吸光度、横軸に
波長を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１アシル基を有するペプチドにおいて一般式で表わされる環状アデノシン３，５―モノリン酸
ホスホジエステラーゼ阻害剤