JPS61249998A - 歯牙体液輸送促進活性をもつペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はラットの唾液腺、殊に耳下腺から得られる新規
な歯牙体液輸送促進活性をもつ−ｅｆチドに関する。

ウサギの視床下部抽出物を耳下腺摘出ラットに投与する
と、歯牙の歯髄から象牙質追歯細胞細管への体液輸送が
認められなくなるが、蚊視床下部抽出物をツタの耳下腺
組織抽出物と共に投与すると体液輸送が認められること
は既に明らかにされている。このことから、視床下部因
子は耳下腺に直接作用し、歯牙の歯髄から象牙質追歯細
胞細管への体液輸送の促進は耳下腺に依存すると考えら
れている。スタインマン（Ｓｔｇｉｎｔｎαｆｉ）　　
ラバカリエス誘発性物質とラットに対する鯖蝕症の発生
についての研究を進め、歯牙体液輸送を促進させる物質
をツタ耳下腺よシ分離し、分子量へ１００、アミノ酸組
成がグリシン４６９６．デ四リン２８１であυ、且つ特
電点ｐＨ１５で紫外部吸収をほとんどもたないタンパク
質であることを明らかにしヤいる〔エンドクリノロジ＋
−（Ｅｎｄｏｃｒｉｓｏｌｏ−ｔｔｙ）、　８３．８０
７　　（１９６８）　　；エンＹクリツキジー　（Ｅｎ
ｄｏａｒｉｎｏＬｏｇｙ）、１０６．１９９４　　（１
９８０））。さらに、スタインマン（５ｔｇｉｎ帽■）
　らはとの活性物質をラットに投与すると、歯牙への栄
養物の補給が向上し、歯牙発育、歯構造強化などが促進
され、鵬蝕発生率が抑制することも報告している。

本発明者はラットの唾液腺、特に耳下腺にも、ブタの場
合と同様に、歯牙体液輸送を促進する作用をもつ物質（
以下「歯牙体液輸送促進物質」という）が存在するであ
ろうとの予想の下に、ラットの耳下線中に該物質が存在
するかどうか研究を行なった結果、該物質の存在が確認
され、その物質の分離精製についてさらに研究を重ねた
結果、極めて高純度の歯牙体液輸送促進物質を単離する
ことができ、その化学構造（アミノ醗配列）を決定する
に至った。

しかして、本発明によれば、下記式 ％式％ で示される歯牙体液輸送促進活性をもつペプチドが提供
される。

本発明によシ提供される上記ペプチドは以下に示す如き
理化学的性質を有する： （１）紫外線吸収スペクトル二極大吸収波長（λ（λｆ
ｒＬａよ）＝２８０％情 上記極大吸収波長は、試料Ｑ、８０＃を生理食塩液１　
ａ４ｉｃ醇解したものにつき、光路長１０で、島津２１
０型分光光度計を用いて測定した値である。

（２）　　＋１解性：水及び生理食塩液に回層。

アセトンに不ｍ０ （３）呈色反応：二ンヒドリン反応　　陽性ビニ−レッ
ト反応　　陽性 坂口反応　　　　　　陽性 （４）分配係数（Ｋａマ値） ｒル濾過におけるｒル層と液層との間の分配係数であり
、下記式によシ算出される。

Ｖｅ　−Ｖ。

Ｋａマ＝□ Ｖｔ−Ｖ。

ｖｔ＝ｙルペッドの総容積 Ｖａ＝溶出液量 Ｖｏ＝グル粒子外部の溶媒量 ｆ　５−ｆｌ過材としてＳａｐ五ａｄａｚ　　Ｇ−２５
（ｐｈａｒｍａａｉａ　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ　　社製）を使用し且つ溶出液としてＰＨ７，２のα
０５Ｍリン酸緩衝液を用いた時の、本発明の活性ペプチ
ドのにατ値は約（１４４である。

前述したように、スタインマン（Ｓｔｅｉｎｓａｎ）ら
がブタの耳下腺から抽出した歯牙体液輸送促進物質は、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドグルのディスク電気泳動法
によシ測定した分子量が８，１００゜アミノ酸組成がグ
リシン４６チ、プロリン２８チであシ、且つ等電点が’
１１　Ｈ７，５で紫外線吸収スペクトルに極大吸収波長
（２□、）が存在しない物質であるが、本発明のペプチ
ドは、前記の構造式及び上記の理化学的性質から明らか
なとおシ、少なくとも分子量、アミノ酸組成及び紫外部
吸収特性がツタの耳下腺から抽出された歯牙体液輸送促
進物質と明らかに異なっておシ、従来の文献に未載の新
規な物質であると考えられる。

なお、哺乳動物の唾液腺、特に耳下腺には唾液腺ホルモ
ンが含まれ、この唾液腺ホルモンはタンパク質であシ、
硬組織の発育促進作用、間葉性組織賦活作用、血清カル
シウム低下作用、白血球増加作用等の種々の優れた生理
活性を有し、医薬として広範に使用されている。しかし
、この唾液腺ホルモンはラット象牙質追歯細胞細管への
体液輸送に対して何ら作用を示さないことを本発明者は
確認している。従って、ラット耳下腺に存在する歯牙体
液輸送促進物質は唾液腺ホルモンとは作用の上からも異
った物質であることは明らかである。

すなわち、本発明のペプチド及び唾液腺ホルモンの歯牙
体液輸送促進活性を次の方法で測定した：生後５遇令の
ラットに螢光物質としてアクリ７ラビン塩酸塩を体重１
００ｇに対して５ＩＩｐの割合で腹腔内投与した後、直
ちに本発明のペプチド又は唾液腺ホルモンをα１ゴの液
量で静脈内投与し１６分後に断頭した。断頭後１分以内
に下顎を摘出し凍結させたミクｎドームを用いて咬合面
に垂直な臼歯切断片を調製し、螢光顕微鏡下に象牙質追
歯細胞細管への螢光物質の移行を観察した。その結果移
行が充分に行われたものを陽性（→、移行が不充分ｔた
は全く行われなかったものを陰性（−）とする。

ラットの耳下腺よシ抽出した本発明の歯牙体液輸送促進
ペプチドと唾液腺ホルモンの歯牙への体液輸送促進効果
の比較結果を下記第１表に示す。

第１表 本発明のペプチドはラットの唾液腺、例えば耳下腺を原
料として以下に述べる工程、すなわち、 （ａ）ラットの唾液腺の水性抽出液をｐ　Ｈ４，５〜５
．５の酸性にし、生ずる沈殿を除去する工程、 （６）　　得られる上清を分子篩にかけて分子量が約３
０，０００以上の成分を除去した後、再び分子篩にかけ
て分子量が１，０００〜へ５００の両分を捕集する工程
、及び （Ｃ）　　該両分を陽イオン交換及び二次元Ｆ紙クロマ
トグラフィー・高圧電気泳動に付して分子量が約２，２
００の両分を捕集する工程を経て製造することができる
。

ラットの唾液腺の原体の水抽出はそれ自体公知の方法に
よシ行なうことができる。例えば、ラットの唾液腺から
採取した新しい原体を細かく切夛刻んだものに、約１０
倍量の冷却したアセトンを加え、冷却しながら１時間攪
拌した後濾過することによシ原体を脱脂し、次に風乾及
び減圧乾燥を順次行ない、アセトン乾燥粉末を得る。こ
のアセトン乾燥粉末に約１０倍容量の水を加え、アルカ
リ例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素
ナトリウム等によシｐＨを中性付近（ｐＨ６，５〜Ｚ５
）、好ましくはｐＨ７，０に調整した後、攪拌しながら
抽出を行なう。攪拌は一般に冷却下、好ましくは０〜５
℃において適宜防腐剤（例えばトルエン）を加え、数時
間、通常２〜３時間行なうのが有利である。この攪拌懸
濁液を遠心分離処理（例えば１０，００（１”ｐ悔で２
０分間）に付し、水性抽出液を分離する。

一方、残渣はそのまま廃棄することができ、或い紘必要
に応じて、蚊残渣について上記と同じ抽出操作を所望回
数（通常はさらに１．２回）繰り返し行なってもよい。

残渣が除去された水性抽出液のｐＨを無機酸、例えば塩
酸によシ４．５〜５．５、好ましくは５．０に調整する
と沈殿が生ずるが、これを冷却下（好ましくは冷菫庫中
；約０〜５℃に保持）に数時間乃至１日静置して沈殿を
さらに完結せしめることが望ましい。

該沈殿を遠心分離（例えば１０．ＯＯＯｒｐｍで１５分
間）シ、その上清液を分離回収すゐ。

回収した上清液は、必要に応じて減圧濃縮等の手段によ
り適当な量、例えば約１０分の１の量に濃縮した後、限
外濾過膜を九は限外濾過７アイ／者−などの平板膜また
は中空繊維膜を用いる分子篩操作に付す。限外濾過膜を
九は限外−過フアイバーを用いる場合、分画操作は、分
画分子量へ０００〜５　Ｑ、０００、好ましくは約３へ
０００の限外濾過膜ま九は限外濾過ファイバーを用いる
限外濾過によって行なうことができる。限外−過膜とし
ては、例えば、ＤイαｆＬｏ　ＰＨ−５０（保持限界：
５０．０００、ＡｍｔａｏＨ社製）念どヲ用イルコトが
でき、を九、限外ｐ過ファイバーとしては、例えばＨｏ
ｌｌｏｗ　Ｆｉｂｅｒ　ＨＩＰ　３０　　（保持限界：
３０．０００、Ａｍｔｅｏｎ社製）などを用いることが
できる。

分離は限外−過膜を用いる場合、上記で得られた上清液
を例えば、Ｄｔａｆｌｏ　ＰＨ−５０を装填した２０２
型攪拌式セル（１ｍｉａｏｎ社製）に入れ、２に４／ｃ
ｓ＋”の窒素ガスで加圧してＦ遇することによシ分画す
ることができる。また、限外−過フアイー考−を用いる
場合は、上記で得られた上清液を例えば、ＤＣ４型限外
ｐ過装置（Ａｍｉｃｏｎ社ｊｍ）に装填したＨｏｌｌｏ
ｗ　Ｆｉｂｅｒ中を高速で循環させることによシ、限外
−過膜を用いた場合と同様の両分を得ることができる。

かくして、分画分子量約３０，０００以上の成分が除去
された活性成分含有液を得ることができる。

このように得られた分画分子量約３０，０００以下の活
性成分含有画分は適宜減圧濃縮し、５ａｐｈａｄａｚ　
　Ｇ−１０カラムで脱塩した後、再び減圧濃縮する。次
にとの濃縮物を水、塩類緩衝液、有機溶媒及びこれ等の
混合物などを溶出液として５ａｐｈａｄａｚ　　ＬＨ−
２０力２ムクｐマドグラフイーで分画し、分画分子量が
１０００〜３，５００の活性画分を捕集する。どのよう
にして得られた活性成分含有画分は陽イオン交換樹脂に
吸着させた後、活性部分の分離溶出を行なう。ここで使
用しうる陽イオン交換樹脂としてはスチレン−ジビニル
ベンゼン系強酸性陽イオン交換樹脂、例えば日立カスタ
Ｉムイオン交換樹脂２６１１、Ｂｉｏ　ＲａｒＬ　Ａｍ
ｔｎｅｓ　　Ａ−９などが挙げられる。

陽イオン交換樹脂を用いる上記活性成分含有画分の吸着
は、例えば、弱酸性の緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝
液、グリシン緩衝液又は酢酸緩衝液に溶解した該活性成
分含有画分を陽イオン交換樹脂と接触させて目的物を吸
着させた後、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機
塩を加えてイオン濃度を高めた上記緩衝液、又は水酸化
す）９ウム、水酸化カリウムなどの強アルカリ性溶液を
用いて溶出させることによって精製することができる。

このようにして得られた活性溶出液画分はＳｇｐｈａｄ
ａｚ　　Ｇ−１０カラムで脱塩し九後、二次元濾紙り田
マドグツフィー・高圧電気泳動法に付して分画するとと
により、さらに精製することができる。二次元濾紙り冨
マドグラフィー・高圧電気泳動法は濾紙を支持体として
用い、最初にクロマトグラフィーをついで高圧電気泳動
を行ない、一枚の一紙上で二次元的に試料を展開させる
ことによジペプチドを分離する方法であり、いわゆるフ
ィンガープリント法と称するものである。この方法によ
シ分子量がほぼ同じであってもアζノ酸配列の異なった
ペプチドを相互に分離することが可能となる。

第一次元としてのＦ紙り四マドグラフィーは通常の方法
に従い、上記活性溶出液を２紙に添加してから展開溶媒
で約２０時間展開することによシ行なうことができる。

展開は上昇法または下降法のいずれも用いることができ
る。溶媒としては例えば水；メタノール、エタノールな
どのアルｊ　−ル１ｌｊＩ８フェノール、ピリジン、酢
酸エチル、アセトン、ジエチルエーテル、クロロホルム
、外−ヘキサンなどが単独でまたは混合して用いられる
。

また、水と混和しないブタノールなどの溶媒に酢酸、ぜ
リジンなどを混合した水溶液を飽和させて用いることも
できる。この展開で種々の物質を相互に分離することが
できる。

次に、第二次元としての高圧電気泳動は上記の一次元的
に展開された２紙に対して、第一次元の展開と直角の方
向に電場をかけることくよシ、通常の方法で実施するこ
とができる。高圧電気泳動に用いる緩衝液として拡例え
ば揮発性の緩衝液であるピリジン−酢酸−水系、ｐＨ４
〜７などを用いることができ、これらの緩衝液は乾燥す
るととによシ除くことができるので、Ｆ紙から活性物質
“を抽出する場合に極めて都合がよい。この高圧電気泳
動処理によシ得られた抽出液は、分画分子量５００の限
外−過膜、例えばｒ（’０５（４ｍｉｅｏｎ社製）　、
５ａｐｈａｄａｚ　　Ｇ−１０などを用いたｒル濾過、
ｔたは分画分子量１．　ＯＯＯのチューブ、例えばスペ
クトラボア７　　（ＳｐａｅｔｒｓｍＭｅｄｉａａｌ　
　Ｉｎｄｓａｔｒｔｅｇ　　社製）を用いた透析などの
操作に付し、分子量が約λ２００の画分を捕集し、適宜
脱塩したのち凍結乾燥することによシ、目的とする歯牙
体液輸送促進活性をもつペプチドを得ることができる。

かくして得られるペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸
配列、メンシル−エドマン法、カルカキジペプチダーゼ
Ｙ法及びトリプシンによる酵素分解の手法によ〕決定す
ることができる・かくして得られる本発明のペプチドは
歯牙体液輸送促進活性を有し、頗蝕の予防、治療に有用
である。即ち、鯖蝕は微生物の作用によシ生じた歯垢中
に、同じく微生物の代謝物である乳酸が滞留することに
よシ酸腐蝕が進み、エナメル層のみならず象牙質へ鵬蝕
が進行する。ｍ歯の発生に関する要因は多岐にわたるが
最終的に象牙質まで頗蝕された場合においても歯牙は第
二象牙質を形成するととくよシ防御する能力を備えてい
る。この際、象牙質の機能的増殖において栄養源の供給
は必須なものであシ、歯牙体液輸送を大通させる物質が
第二象牙質の形成に対して促進的に作用すると考えられ
る。

本発明のペプチドをかかる鯖蝕防止剤または治療剤など
として用いるには、医Ｗ＆製剤調製液（注射用蒸留水、
生理食塩液、燐酸緩衝液、グリシン緩ａｍ、ぺｐナール
緩衝液等）に本発明のペプチドを添加、溶解させ、注射
液とすることができる。

さらに、この注射液に成形性を高めるために補助剤とし
て例えば塩化ナトリウム、グリシン、乳糖、マンニット
、ソルビット、シ曹糖、氷解でんぷん、デキストラン等
の補助剤を加え、凍結乾燥製剤とするＡともできる。さ
らに、通常使用している歯みがき剤に本発明のペプチド
を加え、鯖蝕防止剤及び治療剤として使用することもで
きる。

さらに、本ペグチドは歯牙のみならず、生体の硬組織全
般、特に骨化形成の促進を期待することができる。

次に実施例によシ本発明をさらに説明する。

実施例１ ラット耳下腺１００ｇをミンチし、１ｔの冷却したアセ
トンを加え、冷却下に１時間攪拌後−過し、余分のアセ
トンを風乾及び減圧乾燥によυ除去し、アセトン乾燥粉
末を得た。このアセトン乾燥粉末に１ｔの水を加えて２
時間攪拌抽出した後、１０．０００デｐｍで１５分間遠
心分離し、沈殿と上清に分離し九。沈殿に５００−の水
を加えて抽出、遠心分離を繰返し、得られた上清をさ鳶
の分と合わせ、１Ｎ塩酸を加えてｐＨ５，０に調整した
。

析出し九沈殿を１０．００　Ｏｒ’ｌ）ｍで１５分間遠
心分離除去し、次いで上清を１Ｎ水酸化ナトリウムで７
１　Ｈ７，０とした。この溶液を１００ｍになるまで減
圧濃縮し、、２０２型攪拌式セルー過装置ＣＡｍ１ａｏ
ｎ社製）を用い、分画分子量３Ｑ、０００の限外ｐ過膜
ＰＨ−３０ＣＡｍｔａｏｎ社製）で濾過し、得られた濾
過液を再び減圧濃縮した。この濃縮液を０．０５＆酢酸
緩衝液、７）Ｈ５，８で平衡化した５ｅｐｈａｄａｚＧ
−１０カラム（１，５Ｘ９０ｍ）で脱塩溶出した。この
溶出液を再び減圧濃縮してからエタノール−酢酸−水（
７５：１０：９５）溶液で平衡化したＳｇｐｈａｄａｚ
ＬＨ−２０カラム　（五８Ｘ１００α）でｒルヂ遇し、
分画分子量１．　ＯＯＯ〜３，５００の活性画分を集め
喪。

次いで該活性画分をα２Ｎクエン酸ナトリウム緩衝液、
ＰＨ１２５で平衡化した日立カスタム◆２６１１カラム
（α９Ｘ５５ｃｍ）に添加した後、０２Ｎクエン酸ナト
リウム緩衝液、’Ｉ）Ｈ４，２５及び１．２Ｎクエン酸
ナトリウム緩衝液、７）Ｈ５，２Ｂで順次洗浄し、不純
物を除去した。最後に、α２Ｎ水酸化ナトリウムでカラ
ムから溶出しく９活性溶出画分を集めた。

次に、この活性溶出両分を前記と同様に脱塩、減圧濃縮
した後、東洋７紙Ａ　５０　　（４２Ｘ’４５　ｔｓ）
に添加し、下降法によＦ）ｎ−ブタノール−ピリジン−
酢酸−水（１５：　１０　：　３　：　１２）浴液を溶
媒として２０時間展開した。次に、ピリジン−酢酸−水
（１０：　（Ｌ４　：　９０）溶液を電極液として用い
１５０ｍＡで９０分間電気泳動してからＰ紙上の活性部
分を抽出し友。この活性抽出液を分画分子ｔ５００の限
外濾過膜ＹＣＯ５（Ａ情イｃａｎ社製）で脱塩した後凍
結乾燥し、目的とする歯牙体液輸送促進活性をもつペプ
チドα４５ダを得た。

このペプチドを以下の方法でアミノ酸分析し、下記式 ％式％ で示されるアミノ酸配列を有する分子量が２１６５の物
質であることを確認した。

（１）　　アぐノ酸分析 試料２５ｓモルを１１０℃、２４時間６Ｎ塩酸で加水分
解した後、５０℃、１５分で減圧乾固した。乾固残渣に
０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，５を加えｐＨｆ
６．．５に調整し、４時間放置して空気酸化を完了後１
Ｎ塩酸を加えｐＨを２とし九のち、ｐＨ２，２のクエン
酸緩衝液を加えて分析に供した。またＴｒｐを分析する
なめには、試料５０　ｆｉモルをα２ダのデングン存在
下２．５Ｎ水酸化ナトリウム中１１０℃、２０時間加水
分解を行ない、１Ｎ塩酸で中和後減圧乾固を行い分析に
供し九。その結果下記に示すアミノ酸組成を有すること
が判明した（カッコ内の数字は１分子尚シのアミノ酸残
基の数を表わす）。

Ａｓｐ（２）、Ｔ　Ａ　Ｆ　（１）、Ｓ　ａ　ｒ６″）
ＳＧｔ１＆（３）、ｐｒ。

（１）、Ｇ　ｌ　ｉ／（３）、ＡＬａ（２）、Ｐ’　ａ
　ｌ　（１）、ｌ１ａ（１）、Ｌｓｓ（１）、Ｌ　ｙ　
ａ　（１）、ｆｆ＜ａ（１）、Ａ　ｒ　ｙ　（１）、７
’ｒｐ（１） （２）アミノ酸配列 （（りＮ末端配列分析 Ｎ末端配列分析はＧｒｃＬｙらの方法［：Ｂｔｏａｈａ
ｍ。

！、８９．３７９　　（１９６３））に準じてダンシル
−エドマン法によシ行なった。ｓｏｎモルの試料を５０
Ｗ１ｔの５０％ピリジン水ｉ液に共栓試験管中で溶解し
た後に、１０μｔの２０チフ工ニルインチオシアナート
ービリジン醇液を加えて１５秒間窒素ガスを吹き込んだ
後密栓し、反応を行なった。１時間後減圧乾固して２０
μｔのエチルアルコールを加え再び減圧乾固した後、３
０μＬのトリフルオロ酢酸を加え４５℃で加水分解を行
なった。５０分後室素ガスでトリフルオロ酢酸を揮散さ
せ、さらに水１００μｔを加え減圧乾固することによシ
完全に除去し、残渣を水１００μｔに懸濁させて酢酸ブ
チル４００μｔで５回抽出した。

得られた水層から１〜５ｎモル相当を後述の別容器に移
し、残りを凍結乾燥した。その後最初と同様に５０ｔｓ
ピリジン水漆液に溶解し、フェニルイソチオシアナート
によシ再び反応を行なった。このようにして順次Ｎ末端
側からアミノ酸配列分析を行なった。ダンシル化はあら
かじめ用意した試料を小試験管に入れて、減圧デシケー
タ−中で乾固後、１０μｔのα２Ｍ重炭酸ナトリウムを
加え遠心分離を行ない再び減圧乾固させた。さらに１ｑ
／ｄのダンジルクロライド−アセトン溶液を加え混和し
た後、３７℃で１時間反応させ喪。減圧乾燥後５００μ
ｔの６Ｎ塩酸を加え、小試験管を封じ、１０５℃で１８
時間加水分解を行なった。

アスパライン、グルタミン及びトリプトフアンの同定は
、直接エドマン法によシ行なった。アミノ酸のフェニル
チオヒダントイン（ＰＴＨ）ｆｉ導体への変換は、酢酸
グチル中に存在するフェニルチアゾリン訪導体を減圧乾
固後、１Ｎ塩酸で８０℃、１０分間処理し生成しｆｔＰ
ＴＨアミノ酸を酢酸エチルで抽出し、ポリアミドシート
を用いて展開し、同定した。

その結果、Ｎ末端ペンタペプチドはａｔ　ｙ−ＶａＬ−
ＩＬｅ−ＡＬａ−Ｔｒｐ−であることが判明した。

（ｂ）Ｃ末端配列分析 Ｃ末端配列分析はＨａｙａｓｈｉ　　らの方法〔Ｊ。

Ｂｉ　ｏｃｈａｍ、　、　　７７．６９　（１９７５）
：ｌに準じカルがキシペグチダーゼＹ法により行なった
。００５ＭＦ）ん酸緩衝液、ｐＥ６．５で１ｑ／ｄのカ
ルがキシペグチダーセＹ　Ｃ５ｉｇｔｎａ社製、２４ｕ
ｎｉｔｇ／ｍ９）１２μｔを、同じ＜　ＣＬＯ５ＭＤん
酸緩衝液１５０μＬＶｃ＃Ｉ解させ７’ｃ　７５　ｎ　
モルａ）試料に加えて２５℃で反応を行なった。それぞ
れ１５分、６０分、２４０分後に、−４０℃で凍結する
ことにより反応を停止させ、遊離するアミノ酸を定量し
た。

カルボキシ〆プチ〆−ゼＹによる酵素消化によって、Ｇ
ｔＳＦが速やかに遊離し、以下Ａｔα、Ｔｈｒ、５ｕｒ
ＳＡｓｐがさらに６０分の段階でＬｙｓ、Ａｒｇがそれ
ぞれ順に遊離してきた。ｔたカルがキシペグチダーゼＡ
で１５分、３０分、６０分で同じように遊離のアミノ酸
を定量したととる、６０分で痕跡程度のＧｌｙのみが観
察されたことによ）、Ｃ末端Ｇｌｙは遊離のカルボキシ
ル基をもつことが判明した。

その結果、Ｃ末端ペンタペプチドは−、４　ｔ”　ｇ　
−Ｌｙａ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙで
あることが判明した。

（Ｃ）トリプシン分解による断片ペプチドのナミノ酸配
列 試料２ダをα２Ｍ炭酸水素アンモニウム２００μＬに溶
解し、希アンモニア水で’ＩＪＨａ２に調整後、０１Ｍ
塩化カルシウム１００μｔｒｃ溶解したジフェニルカル
バミル１０９ドＣＤＰＣＣ）−）リプタｙ　＜ｓｉｇｍ
ａ社製、１００００ＢＡＥＥｕｔｔｔａ／ｈｐ）２０μ
ｇを加え３７℃で反応を行なった。３時間後再び同量の
ＤＰＣＣ−ト９グシンを加えさらに３時間反応を行なっ
た後、酢酸を加えｐＨ１Ｏとし反応を停止させ、凍結乾
燥品として回収した。ペプチドマツプ法によシトリプシ
ン分解物は５つのスポットに分画された。各々のスポッ
トを切シ取シ、α１Ｎアンそニア水で抽出後凍結乾燥品
として回収した。さらにそれぞれを６Ｎ塩酸で加水分解
後アミノ酸分析を行なったとζろ、一つは精製試料のＮ
末端よシ１から１５番の断片ペプチドであった。この断
片ペプチドにつき、Ｎ末端よシ直接エドマン法により順
次アミノ酸を同定し、６＃ｒ目よｆｉＧ１１＆、Ｌｅｔ
ｓ、Ｇｌｓ、Ｈ４ｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ｐｒｏ、Ｇｌｙ
であることが判明した。−Ｃ末端からはカルがキシペプ
チダーゼＹ法によυ順にＬｙｓ、Ａｒｇと同定した。

上記（α）、（ｂ）及び（６）の結果よシ試料ペプチド
の全−次構造は下記の通りであった。

Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　ｌ　−１１ａ−ＡＬ　ａ−Ｔｒｐ−Ｇ
Ｌｓ−ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−この結果はア
ミノ酸分析結果と良く一致した。

該精製標品はラットに対して３　Ｑ　ｎｇ／に４　ｉ、
ｖ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 【アミノ酸配列があります】 で示されるペプチド。