JPS6117468B2 - - Google Patents
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- JPS6117468B2 JPS6117468B2 JP9206977A JP9206977A JPS6117468B2 JP S6117468 B2 JPS6117468 B2 JP S6117468B2 JP 9206977 A JP9206977 A JP 9206977A JP 9206977 A JP9206977 A JP 9206977A JP S6117468 B2 JPS6117468 B2 JP S6117468B2
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、固体表面に線維素溶解を付与する方
法に関する。
法に関する。
一般に酵素反応は、酵素を水に溶解した状態で
行なわれるが、近年、酵素の回収、再使用、酵素
の安定化、酵素反応の連続化などを目的として酵
素を水に不溶な固体表面に結合し、酵素を固体触
媒化した状態で用いることが検討されている。
行なわれるが、近年、酵素の回収、再使用、酵素
の安定化、酵素反応の連続化などを目的として酵
素を水に不溶な固体表面に結合し、酵素を固体触
媒化した状態で用いることが検討されている。
たとえば、水に不溶な固体表面に酵素を結合し
て、表面に酵素活性を付与する方法に関しては数
多くの提案がなされている。その際、水に不溶な
固体としては、セルロース、架橋デキストラン、
アガロース、ナイロン、ポリアミノ酸、ガラスな
ど表面に活性基を有するもの、あるいは、高分子
反応などにより容易に活性基が導入できるものが
用いられている。
て、表面に酵素活性を付与する方法に関しては数
多くの提案がなされている。その際、水に不溶な
固体としては、セルロース、架橋デキストラン、
アガロース、ナイロン、ポリアミノ酸、ガラスな
ど表面に活性基を有するもの、あるいは、高分子
反応などにより容易に活性基が導入できるものが
用いられている。
一方、ポリ塩化ビニル、シリコーン樹脂など
は、直接酵素を結合しうる活性基を有しないし、
また高分子反応により活性基を導入することも困
難であるので、他の手段によつて活性基を導入し
たのち、酵素と反応さすことが試みられている。
たとえば、ポリ塩化ビニル製のチユーブをγ−ア
ミノプロピルトリエトキシシランにより処理する
ことにより表面にアミノ基を導入した後、酵素を
結合することが試みられているが〔G.F.Senyk
ら、ジヤーナル・オブ・フード・サイエンス、第
40巻、第2号、288ページ、1975年〕、γ−アミノ
プロピルトリエトキシシラン処理により、ポリ塩
化ビニルのチユーブが失透したり、硬くなるとい
う欠点があつた。
は、直接酵素を結合しうる活性基を有しないし、
また高分子反応により活性基を導入することも困
難であるので、他の手段によつて活性基を導入し
たのち、酵素と反応さすことが試みられている。
たとえば、ポリ塩化ビニル製のチユーブをγ−ア
ミノプロピルトリエトキシシランにより処理する
ことにより表面にアミノ基を導入した後、酵素を
結合することが試みられているが〔G.F.Senyk
ら、ジヤーナル・オブ・フード・サイエンス、第
40巻、第2号、288ページ、1975年〕、γ−アミノ
プロピルトリエトキシシラン処理により、ポリ塩
化ビニルのチユーブが失透したり、硬くなるとい
う欠点があつた。
本発明者らは、この問題にかんがみ、ポリ塩化
ビルやシリコーン樹脂などのように活性基を有し
ない材料を含め、どの材料にも線維素溶解活性酵
素を結合でき、かつ結合操作により材料の力学的
性質を損うことがないような処理方法について鋭
意研究した結果、本発明に到達したものである。
ビルやシリコーン樹脂などのように活性基を有し
ない材料を含め、どの材料にも線維素溶解活性酵
素を結合でき、かつ結合操作により材料の力学的
性質を損うことがないような処理方法について鋭
意研究した結果、本発明に到達したものである。
すなわち本発明は、アミノ基と反応しうる官能
基を少くとも2個有する試薬と過剰のポリアミン
とを固体表面上にて反応させて該固体表面上に皮
膜を形成せしめ、しかるのち該皮膜上の未反応の
アミノ基と線維素溶解活性酵素とを結合さすこと
を特徴とする固体表面に線維素溶解活性を付与す
る方法である。
基を少くとも2個有する試薬と過剰のポリアミン
とを固体表面上にて反応させて該固体表面上に皮
膜を形成せしめ、しかるのち該皮膜上の未反応の
アミノ基と線維素溶解活性酵素とを結合さすこと
を特徴とする固体表面に線維素溶解活性を付与す
る方法である。
本発明における固体表面としては、たとえばガ
ラス、カオリナイト、ベントナイトなどの無機物
質表面、天然ゴム、セルロース、コラーゲン、ア
ガロース、デキストランなどの天然高分子表面、
ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリ
アミノ酸、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリ
コーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸エス
テル、ポリビニルアルコール、ポリウレタンなど
の合成高分子表面などがあげられる。
ラス、カオリナイト、ベントナイトなどの無機物
質表面、天然ゴム、セルロース、コラーゲン、ア
ガロース、デキストランなどの天然高分子表面、
ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリ
アミノ酸、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリ
コーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸エス
テル、ポリビニルアルコール、ポリウレタンなど
の合成高分子表面などがあげられる。
本発明におけるアミノ基と反応しうる官能基を
少くとも2個有する試薬(以下、多官能性試薬と
称する。)としては、たとえばグルタルアルデヒ
ド、テレフタルアルデヒド、イソフタルアルデヒ
ド、ジアルデヒドでんぷんなどのポリアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエン
ジイソシアナート、キシレンジイソシアナート、
フエニレンジイソシアナート、アニリン−ホルム
アルデヒドのイソシアナート誘導体などのポリイ
ソシアナート、塩化アジポイル、塩化イソフタロ
イル、塩化テレフタロイル、塩化シアヌルなどの
酸塩化物、ヘキサメチレンチオイソシアナートな
どのポリチオイソシアナート、N,N′−エチレ
ンビスヨードアセトアミド、N,N′−ヘキサメ
チレンビスヨードアセトアミドなどのN,N′−
ポリメチレンビスヨードアセトアミド、テトテメ
チレングリコールのジグリシジルエーテル、ジエ
チレングリコールのジグリシジルエーテルなどの
ポリエポキシド、無水マイレン酸−メチルビニル
エーテル共重合体、無水マイレン酸−エチレン共
重合体無水マレイン酸−スチレン共重合体などの
ポリカルボン酸無水物、N,N′−エチレンビス
マレイミドなどのビスマレミド、N,N′−メチ
レンビスアクリルアミド、N,N′−ヘキサメチ
レンビスアクリルアミド、N,N′−ヘキサメチ
レンビスメタクリルアミド、N,N′,N″−トリ
アクリロイルヘキサヒドロトリアジンなどのポリ
(メタ)アクリロイル化合物などがあげられる。
少くとも2個有する試薬(以下、多官能性試薬と
称する。)としては、たとえばグルタルアルデヒ
ド、テレフタルアルデヒド、イソフタルアルデヒ
ド、ジアルデヒドでんぷんなどのポリアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエン
ジイソシアナート、キシレンジイソシアナート、
フエニレンジイソシアナート、アニリン−ホルム
アルデヒドのイソシアナート誘導体などのポリイ
ソシアナート、塩化アジポイル、塩化イソフタロ
イル、塩化テレフタロイル、塩化シアヌルなどの
酸塩化物、ヘキサメチレンチオイソシアナートな
どのポリチオイソシアナート、N,N′−エチレ
ンビスヨードアセトアミド、N,N′−ヘキサメ
チレンビスヨードアセトアミドなどのN,N′−
ポリメチレンビスヨードアセトアミド、テトテメ
チレングリコールのジグリシジルエーテル、ジエ
チレングリコールのジグリシジルエーテルなどの
ポリエポキシド、無水マイレン酸−メチルビニル
エーテル共重合体、無水マイレン酸−エチレン共
重合体無水マレイン酸−スチレン共重合体などの
ポリカルボン酸無水物、N,N′−エチレンビス
マレイミドなどのビスマレミド、N,N′−メチ
レンビスアクリルアミド、N,N′−ヘキサメチ
レンビスアクリルアミド、N,N′−ヘキサメチ
レンビスメタクリルアミド、N,N′,N″−トリ
アクリロイルヘキサヒドロトリアジンなどのポリ
(メタ)アクリロイル化合物などがあげられる。
本発明におけるポリアミンとは、少くとも2個
のアミノ基を有する化合物であり、たとえばエチ
レンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチ
レントリアミン、トリエチレンテトラミン、ポリ
エチレンイミン、ジ(2−アミノエチル)メチル
アミン、ジ(2−アミノエチル)エチルアミン、
N,N−ジメチル−1,3−プロパンジアミン、
アミノアセタール化ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルアミン、ポリリジン、ポリアミノスチレ
ン、ポリ(P−アミノフエニルアラニン)などが
あげられる。
のアミノ基を有する化合物であり、たとえばエチ
レンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチ
レントリアミン、トリエチレンテトラミン、ポリ
エチレンイミン、ジ(2−アミノエチル)メチル
アミン、ジ(2−アミノエチル)エチルアミン、
N,N−ジメチル−1,3−プロパンジアミン、
アミノアセタール化ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルアミン、ポリリジン、ポリアミノスチレ
ン、ポリ(P−アミノフエニルアラニン)などが
あげられる。
これらポリアミンと多官能性試薬とを反応させ
て固体表面上に皮膜を形成することができるが、
本発明においては皮膜上に未反応のアミノ基を残
すために、多官能性試薬のアミノ基と反応しうる
官能基に対してポリアミンのアミノ基を過剰に用
いる必要がある。このために、まず固体表面を多
官能性試薬溶液と接触させて多官能性試薬を固体
表面上に吸着させ、しかるのち大過剰のポリアミ
ン溶液と接触させて表面に吸着された多官能性試
薬とポリアミンとを反応させるのが簡便かつ効果
的な方法である。多官能性試薬あるいはポリアミ
ンを溶解する溶媒としては、処理すべき固体を溶
解せず、かつ架橋剤あるいはポリアミンを0.01〜
30WT%の濃度で溶解することができる溶媒を使
用するのが望ましい。ポリ塩化ビニルなど耐有機
溶媒性の悪い材料に対しては水あるいは含水アル
コールを使用するのが好ましい。一方、シリコー
ンなど耐有機溶媒性の良好な材料に対しては、
水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムア
ミド、アセトン、ベンゼン、ジメチルスルホキシ
ドなどほとんどすべての溶媒の使用が可能であ
る。多官能性試薬の固体表面への吸着は、0〜50
℃の温度で、必要に応じて表面を更新しながら行
うのが望ましい。また、多官能性試薬とポリアミ
ンとの反応は0〜50℃の温度にて、必要に応じて
酸、塩基などの触媒、脱酸剤の存在下で行うのが
望ましい。
て固体表面上に皮膜を形成することができるが、
本発明においては皮膜上に未反応のアミノ基を残
すために、多官能性試薬のアミノ基と反応しうる
官能基に対してポリアミンのアミノ基を過剰に用
いる必要がある。このために、まず固体表面を多
官能性試薬溶液と接触させて多官能性試薬を固体
表面上に吸着させ、しかるのち大過剰のポリアミ
ン溶液と接触させて表面に吸着された多官能性試
薬とポリアミンとを反応させるのが簡便かつ効果
的な方法である。多官能性試薬あるいはポリアミ
ンを溶解する溶媒としては、処理すべき固体を溶
解せず、かつ架橋剤あるいはポリアミンを0.01〜
30WT%の濃度で溶解することができる溶媒を使
用するのが望ましい。ポリ塩化ビニルなど耐有機
溶媒性の悪い材料に対しては水あるいは含水アル
コールを使用するのが好ましい。一方、シリコー
ンなど耐有機溶媒性の良好な材料に対しては、
水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムア
ミド、アセトン、ベンゼン、ジメチルスルホキシ
ドなどほとんどすべての溶媒の使用が可能であ
る。多官能性試薬の固体表面への吸着は、0〜50
℃の温度で、必要に応じて表面を更新しながら行
うのが望ましい。また、多官能性試薬とポリアミ
ンとの反応は0〜50℃の温度にて、必要に応じて
酸、塩基などの触媒、脱酸剤の存在下で行うのが
望ましい。
固体表面に形成された皮膜上の未反応アミン基
と線維素溶解活性酵素との反応は公知の方法を用
いて行うことができる。たとえばN,N−ジシク
ロヘキシルカーボジイミド、1−シクロヘキシル
−3−(2−モルホリニノエチル)−カーボジイミ
ド、メト−P−トルエンスルホネートなどの脱水
剤を用いて皮膜上の未反応アミノ基と線維素溶解
活性酵素のカルボキシル基とを縮合することがで
きる。さらに、前記の多官能性試薬を用いて皮膜
上の未反応アミノ基と線維素溶解活性酵素との間
に結合を形成することができる。このためにはま
ず皮膜上のアミノ基に対して過剰量の多官能性試
薬を反応せしめ、多官能性試薬の一部部の官能基
を未反応のまま残し、しかるのち未反応の官能基
と線維素溶解活性酵素とを反応せしめればよい。
未反応の官能基と線維素溶解活性酵素との反応
は、線維素溶解活性酵素を失活させないように、
水溶液中0〜50℃の温度で行うのが望ましい。
と線維素溶解活性酵素との反応は公知の方法を用
いて行うことができる。たとえばN,N−ジシク
ロヘキシルカーボジイミド、1−シクロヘキシル
−3−(2−モルホリニノエチル)−カーボジイミ
ド、メト−P−トルエンスルホネートなどの脱水
剤を用いて皮膜上の未反応アミノ基と線維素溶解
活性酵素のカルボキシル基とを縮合することがで
きる。さらに、前記の多官能性試薬を用いて皮膜
上の未反応アミノ基と線維素溶解活性酵素との間
に結合を形成することができる。このためにはま
ず皮膜上のアミノ基に対して過剰量の多官能性試
薬を反応せしめ、多官能性試薬の一部部の官能基
を未反応のまま残し、しかるのち未反応の官能基
と線維素溶解活性酵素とを反応せしめればよい。
未反応の官能基と線維素溶解活性酵素との反応
は、線維素溶解活性酵素を失活させないように、
水溶液中0〜50℃の温度で行うのが望ましい。
本発明の方法によれば、たとえばプラスミン、
プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、ウロキ
ナーゼ、プリノラーなどの線維素溶解活性酵素を
適用することにより固体表面に対応する線維素溶
解活性を付与することができる。
プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、ウロキ
ナーゼ、プリノラーなどの線維素溶解活性酵素を
適用することにより固体表面に対応する線維素溶
解活性を付与することができる。
本発明の方法は種々の形状の固体表面、たとえ
ば、粉末、ビーズ、フイルム、皮膜、透過性膜、
シート、チユーブ、中空糸、繊維、布などの表面
に適用できる。
ば、粉末、ビーズ、フイルム、皮膜、透過性膜、
シート、チユーブ、中空糸、繊維、布などの表面
に適用できる。
本発明の方法により、表面に線維素溶解活性を
付与された固体表面においては、固体表面と線維
素溶解活性酵素との間の結合力が強く、持続性、
活性も大きいので、線維素溶解活性を付与された
表面は、医療分野にも利用することができる。た
とえば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プ
リノラーゼ、プラスミンなどの線維素溶解活性酵
素が有する線維素溶解活性を人工血管、カテーテ
ル、人工腎臓、人工心臓、人工弁、人工肺など直
接血液と接する表面に付与した場合、血栓形成を
防止することができる。
付与された固体表面においては、固体表面と線維
素溶解活性酵素との間の結合力が強く、持続性、
活性も大きいので、線維素溶解活性を付与された
表面は、医療分野にも利用することができる。た
とえば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プ
リノラーゼ、プラスミンなどの線維素溶解活性酵
素が有する線維素溶解活性を人工血管、カテーテ
ル、人工腎臓、人工心臓、人工弁、人工肺など直
接血液と接する表面に付与した場合、血栓形成を
防止することができる。
次に実施例を示し具体的に本発明を説明する。
実施例 1
内径4mm、外径5.5mmのジメチルポリシロキサ
ンからなるシリコーンチユーブを厚さ2mmに輪切
し、輪切片を順次、下記の溶液により処理するこ
とによりウロキナーゼを固定化した。
ンからなるシリコーンチユーブを厚さ2mmに輪切
し、輪切片を順次、下記の溶液により処理するこ
とによりウロキナーゼを固定化した。
(1) 4(W/V)%無水マレイン/メチルビニル
エーテル共重合体アセトン溶液中、7℃で30分
間静置し、冷アセトン溶液で洗滌後乾燥した。
エーテル共重合体アセトン溶液中、7℃で30分
間静置し、冷アセトン溶液で洗滌後乾燥した。
(2) 10WT%ポリエチレンイミン水溶液中、室温
で1時間静電し、水洗後、乾燥した。
で1時間静電し、水洗後、乾燥した。
(3) 4(W/V)%無水マレイン酸/メチルビニ
ルエーテル共重合体アセトン溶液中、室温で1
時間静置し、アセトンで洗滌後、乾燥した。
ルエーテル共重合体アセトン溶液中、室温で1
時間静置し、アセトンで洗滌後、乾燥した。
(4) ウロキナーゼの生理食塩水溶液(600単位/
ml)中、7℃で24時間静置後、生理食塩水にて
洗滌した。
ml)中、7℃で24時間静置後、生理食塩水にて
洗滌した。
このようにしてウロキナーゼを結合した輪切片
の線維素溶解活性をフイプリン平板を用いて測定
した。すなわち、フイブリノーゲン水溶液にトロ
ンビン生理食塩水溶液を添加することにより作成
したフイブリン膜上に輪切片を置き、37℃で24時
間静置したところ、輪切片のまわり、直径22mmの
円形状にフイブリン膜が溶解しているのが認めら
れた。
の線維素溶解活性をフイプリン平板を用いて測定
した。すなわち、フイブリノーゲン水溶液にトロ
ンビン生理食塩水溶液を添加することにより作成
したフイブリン膜上に輪切片を置き、37℃で24時
間静置したところ、輪切片のまわり、直径22mmの
円形状にフイブリン膜が溶解しているのが認めら
れた。
実施例 2
内径2.5mm、外径4.0mmのポリ塩化ビニル製のチ
ユーブを厚さ2mmに輪切し、輪切片を順次、下記
の溶液により処理することによりウロキナーゼを
固定化した。
ユーブを厚さ2mmに輪切し、輪切片を順次、下記
の溶液により処理することによりウロキナーゼを
固定化した。
(1) 20WT%グルタルアルデヒドと15M−リン酸
緩衝液(PH7.5)との等容量混合液中、7℃で
30分間静置後、氷水で洗滌した。
緩衝液(PH7.5)との等容量混合液中、7℃で
30分間静置後、氷水で洗滌した。
(2) 10WT%ポリエチレンイミン水溶液中、室温
で1時間静置後、水洗した。
で1時間静置後、水洗した。
(3) ウロキナーゼ生理食塩水溶液(600単位/
ml)と1−シクロヘキシル−3−(2−モルポ
リノエチル)−カーボジイミド、メト−P−ト
ルエンスルホネートの生理食塩水溶液(60mg/
ml)との等容量水溶液中7℃で24時間静置後、
生理食塩水で洗滌した。
ml)と1−シクロヘキシル−3−(2−モルポ
リノエチル)−カーボジイミド、メト−P−ト
ルエンスルホネートの生理食塩水溶液(60mg/
ml)との等容量水溶液中7℃で24時間静置後、
生理食塩水で洗滌した。
このようにしてウロキナーゼを固定化した輪切
片の線維素溶解活性を実施例2と同様に測定した
ところ、輪切片のまわり直径17mmの円形状にフイ
ブリン膜が溶解しているのが認められた。
片の線維素溶解活性を実施例2と同様に測定した
ところ、輪切片のまわり直径17mmの円形状にフイ
ブリン膜が溶解しているのが認められた。
実施例 3
実施例3のウロキナーゼのかわりに、ストレプ
トキナーゼを用いたところ、ストレプトキナーゼ
を結合した輪切片は直径12mmの円形状にフイブリ
ン膜を溶解した。
トキナーゼを用いたところ、ストレプトキナーゼ
を結合した輪切片は直径12mmの円形状にフイブリ
ン膜を溶解した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 アミノ基と反応しうる官能基を少なくとも2
個有する試薬と過剰のポリアミンとを固体表面上
にて反応させて該固体表面上に皮膜を形成せし
め、しかるのち該皮膜上の未反応のアミノ基と線
維素溶解活性酵素とを結合さすことを特徴とする
固体表面に線維素溶解活性を付与する方法。 2 線維素溶解活性酵素がウロキナーゼである特
許請求の範囲第1項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9206977A JPS5426394A (en) | 1977-07-29 | 1977-07-29 | Method for giving enzymatic activity to solic surface |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9206977A JPS5426394A (en) | 1977-07-29 | 1977-07-29 | Method for giving enzymatic activity to solic surface |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5426394A JPS5426394A (en) | 1979-02-27 |
JPS6117468B2 true JPS6117468B2 (ja) | 1986-05-07 |
Family
ID=14044165
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9206977A Granted JPS5426394A (en) | 1977-07-29 | 1977-07-29 | Method for giving enzymatic activity to solic surface |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5426394A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS576362A (en) * | 1980-06-12 | 1982-01-13 | Unitika Ltd | Production of immune adsorptive body |
JPS6115900A (ja) * | 1984-06-30 | 1986-01-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 変性セルロ−ス系多孔質膜 |
EP2058335B1 (en) * | 2007-11-07 | 2020-06-24 | Leukocare Ag | Biocompatible three dimensional matrix for the immobilization of biological substances |
-
1977
- 1977-07-29 JP JP9206977A patent/JPS5426394A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5426394A (en) | 1979-02-27 |
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