JPS61155336A - 医用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １、発明の背景 技術分野 本発明は、新規な医用担体に関するものである。

詳しく述べると、安定性の極めて優れた高分子リポソー
ムよりなる医用担体に関するものである。

先行技術 現在、医薬物質、酵素等を微小なカプセルに封入して医
薬品として提供する試みが種々なされており、ヘモグロ
ビンを封入したマイクロカプセルは人工赤血球となる。

このようなマイクロカプセル化の初期の方法は、乳化法
による高分子化合物のカプセル化や界面重縮合反応によ
る重合体（ポリアミド）の生成を伴なったカプセル化で
ある。しかしながら、これらの方法では、カプセル化材
料である重合体の著しい毒性・―その合成過程で必要な
有機溶媒がカプセル中に残存することによる毒性、さら
にカプセルの粒径が大きい（数μｍ〜１，０００μｍｗ
Ｌ）ために、血栓等の障害を引き起しやすいといった、
医薬品としての使用には致命的な問題があった。

ところで、医薬物質、酵素、ヘモグロビン等をマイクロ
カプセルに封入する主たる目的は、生体内で不安定な医
薬物質、酵素、ヘモグロビン等の活性を長時間保持させ
、その効果を長時間持続させることにある。したがって
、生体に適用させることを前提とした、あるいは医薬品
としてのマイクロカプセル材料に要求される条件として
は、生体に対する毒性が低いこと、カプセル粒径を微小
化し得ること、生体内においてカプセルが十分安定であ
ること等である。

これらの条件をかなりの程度まで満足させるものとじで
生体膜の主成分である各種のリン脂質が水中に形成する
微小な球状の集合体である、いわゆるリポソームをマイ
クロカプセルとして利用することが注目を集めている。

しかしながら、天然のリン脂質をそのまま用いたリポソ
ームは、寿命が短かく、特に生体Ｓａとの相互作用にお
いて不安定であり、このため細胞の認識のモデルや細胞
間の相互作用のモデルに利用したり、薬吻をリポソーム
内に保持させて担体として用いるドラッグデリバリ−（
ｄｒｕｇ　　ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の分野においては安定
なリポソームを見出すための研究が数多くなされている
。現在、その最も有効な手段としてはリポソームの高分
子化がある。

しかして、リポソームの高分子化の目的は、脂質分子を
共有結合させることによる二分子膜、ひいては小胞体構
造の安定化にある。その手法は、重合能を持つ官能基を
脂質分子内に組み込み、七ツマ−としてのリポソームを
調製し、その襖にリポソームの膜中で脂質を重合させる
という方法が主流である。その代表例としては、例えば
Ｊ、Ａｍ、ＣｈｅＩｌｌ、Ｓｏｃ、、１０６．１９２７
−１６３３　（１９８４）等に記載されているように、
まず不飽和脂肪酸を合成し、これとリン脂質の加水分解
物とのエステル化反応により、リン脂質に重合可能な反
応基を導入するものである。しかしながら、このような
方法によれば、不飽和脂肪酸の合成に非常に手数を要し
、また合成後の精製分離も操作が複雑であり、しかも最
終生成物である重合性のリン脂質の収率が文献値では数
パーセントであり、また本発明者らによる追試結果では
該文献値の１０分の１程度の収率しか得られなかった。

また、ヘモグロビンをマイクロカプセル化した人工赤血
球の材料として、リポソームを利用しようとする試みが
なされており、天然のリン脂質のみからなるリポソーム
で問題となる血漿中でのヘモグロビンの漏れ出しが、重
合性リン脂質を用いた高分子リポソームを利用すること
によって有効に抑制され得るものと期待される。

しかしながら、高分子リポソームを人工血液用材料とし
て応用するには、いくつかの問題点がある。まず、第１
に、重合性リン脂質が極めて綿密な分子設計に基づいて
純有機化学的に多数の反応段階経て合成されるため、実
用的な面での大量合成が困難であるばかりでなく、極め
て高価な点である。第２に、高分子リポソームを得るた
めの重合方法である。すなわら、一般に重合性リン脂質
の重合反応は、ラジカル重合開始剤を使用して、あるい
は赤外線を照射して行なわれる。しかしながら、開始剤
を用いる方法は、通常加熱を必要とし、またこれらの開
始剤がリポソーム中に残存するために生体を対象とする
使用目的には好ましくない。一方、紫外線照射法では、
従来の重合性リン脂質は重合性が低いので、多量照射す
る必要があり、この場合には内部のヘモグロビンが変質
しやすいという問題があった。

■０発明の目的 したがって、本発明の目的は、新規な医用担体を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、安定性の極めて浸
れた高分子リポソーム形成脂、質よりなる医用担体を提
供することにある。本発明のさらに他の目的は、担持物
質の漏出の小さい医用担体を提供することにある。本発
明の別の目的は、ヘモグロビン等のマイクロカプセル化
に有用な医用担体を提供することにある。

これらの諸口的は、つぎの一般式Ｉで表わされるリポソ
ーム形成脂質を主構成成分とするリポソームを紫外線ま
たは放射線で照射処理してなる医用担体により達成され
る。

θ ３）−Ｃｏｏである。） ■ また、本発明は、Ｒが一＋ＣＨ２＋−２Ｎ　（ＣＨ３）
３である医用担体である。さらに、本発明は、照射処理
が紫外線で行なわれてなる医用担体である。

また、本発明はヘモグロビン担持用である医用担体であ
る。

■１発明の具体的構成 本発明による医用担体を構成するリポソーム形成脂質は
、エレオステアリン酸を含有する桐油脂肪酸をリン脂質
の加水分解物でエステル化することにより得られる。

本発明で使用されるリン脂質とは複合脂質の１種であり
、アルコール類に脂肪酸およびリン酸が結合した生体成
分であり、化学構造上、比較的長い脂肪族炭化水素から
なる非極性部と、リン酸や塩基等の極性部との二つの部
分から成り立っている。このリン脂質を水中に分散させ
ると、２分子膜構造を持つ小水胞体（ベシクル）、すな
わちリポソームが形成される。このようなリン脂質とし
ては、例えば卵黄レチシン（ホスファチジルコリン）、
ケファリン、ホスファチジルセリン等があり、特に卵黄
レチシンが好ましい。

しかして、ホスファチジルコリンは、つぎの一般式■で
表わされる。

このようなリン脂質から形成されるリポソームは寿命が
知かく、実用面で問題がある。本発明では、リン脂質構
成部分のうち、脂肪酸部分（Ｒ＋およびＲ２＞を、天然
の不飽和脂肪酸であるエレオステアリン酸で１き換えて
重合可能な反応基を導入して重合性のリン脂質を合成す
るものである。

本発明で使用されるエレオステアリン酸は、つぎの化学
式■で表わされる９、１１．１３位に共役二重結合を有
する不飽和脂肪酸であり、桐油中にグリセリドとして存
在し、混合脂肪酸の８０〜９５重−％を占めている。こ
の桐油を加水分解して得られる桐油脂肪酸中には、エレ
オステアリン酸が６０重量％以上、好ましくは８０！１
１％以上含有され、残りは飽和酸、オレイン酸、リノー
ル酸等が含まれている。この桐油脂肪酸はそのまま天然
不飽和脂肪酸して用いてもよく、また必要によりカラム
クロマトグラフィ等で精製してエレオステアリン酸のみ
を取出して用いてもよい。

ＣＨ３（ＣＨ２）３ＣＨ−ＣＨＣＨ−ＣＨＣＨ−ＣＨ（
ＣＨ２）７ＣＯＯＨ（ＩＩＩＩしかして、この桐油脂肪
酸は、通常酸無水物の形でエステル化に供される。桐油
脂肪酸の使用ｍは、リン脂質１００型缶部当り２００〜
４００重量部、好ましくは３００〜３７０重一部である
。

一方、前記リン脂質は加水分解物として使用され、特に
その金属錯体、例えばカドミウム等の金属の錯体として
使用される。

エステル化反応は、つぎのようにして行なわれる。リン
脂質の加水分解物ないしその金属錯体をクロロホルム、
四塩化炭素、塩化メチレン等の媒体中に加えて撹拌下に
懸濁させ、この懸濁液中に前記桐油脂肪酸無水物および
触媒を加え、反応系内をアルゴン、窒素、ヘリウム等の
不活性ガスで置換したのち、１５〜２５℃、好ましくは
１８〜２２℃の温度で暗所で２４〜７２時間、好ましく
は４０〜７２時間反応させる。このとき、白色不溶物が
析出するので濾去し、得られる濾液をイオン交換樹脂と
接触させ、ついで洗い落す。媒体を室温で減圧留去後、
クロロホルム、メタノール、水の混合溶媒（容量比−４
１５／１　ｊに再溶解してシリカゲルカラム等によりク
ロロボルム、メタノール混合溶媒で精製する、触媒とし
ては、４−ジメチルアミノピリジン等があり、リン脂質
の加水分解物１００重量部当り４５〜９０重量部、好ま
しくは６８〜８４重量部使用される。

得られるリポ１ノーム形成脂質は、使用するリン脂質に
よって異なり、例えば卵黄レシチンを使用する場合には
、化学式（ＩＶ）で示されるエレオステアリン酸ホスフ
ァチジルコリン、またケファ１ノンやホスファチジルセ
リン等を使用した場合にはこれらに対応するリポソーム
形成脂質が得られる。

このようにして１ｑられるリボソーム形成脂質番よ、ク
ロロホルム、塩化メチレン、エーテル、メタノール等の
溶媒に溶解したのち、得られる脂質溶液を丸底の容器に
入れて該溶媒を完全に蒸発させて該底面に脂質膜を形成
させる。これにリン酸１１ｉ１液またはへベスバツファ
（Ｈｅｏｅｓ　　ｂｕｙｅｒ）を添加して、ミキサーで
振とうした後、アルゴン、窒素、ヘリウム等の不活性ガ
ス雰囲気下に超音波処理することによりモノマーリポソ
ームが得られる。

このようにして得られるモノマーリポソームは、紫外線
あるいはガンマ線、電子線等の放射線、特に紫外線を照
射することにより２個の脂肪族基における３個の兵役二
重結合が容易に重合して高分子リポソームである本発明
の医用担体が形成される。このような照射処理により七
ツマーリポソームの高分子化により医用担体の安定性は
増大する。

この医用担体には医薬物質、酵素、ヘモグロビン等を担
持させることができる。

しかして、被担持物質が親水性である場合には、高分子
リポソーム内に封入されて担持され、一方、疎水性であ
る場合には、高分子リポソームの脂肪族部分に担持され
る。

担持方法としては、種々あるが、重合性のリポソーム形
成脂質を前記被担持物質と混合したのら、超音波処理す
ることによりモノマーリポソームの懸濁液が形成され、
これを遠心分離することによリモノマーリポソームに担
持させることができる。

このような担持モノマーリポソームを紫外線、放射線等
により照射処理することにより担持された高分子リポソ
ームが得られる。

照射条件は、線源の種類によって異なるが、例えば紫外
線の場合には、モノマーリポソーム懸濁液を紫外線を透
過し得る容器、例えば石英ガラス製容器内に入れ、容器
内を脱気あるいはアルゴン、窒素、ヘリウム等の不活性
ガス雰囲気にＩＦ換後、水銀ランプ、キセノンランプ等
の紫外線を放射し得る光源を用いて、照射距離５〜２０
Ｃ１ｌ＋、好ましくは１０〜１５ｃｍとして、サンプル
を水冷あるいは空冷しつつ、１５分〜１６時間好ましく
は２〜１２時間紫外線を照射する。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。

重合性のリポソーム形成脂質の製造例 エレオステアリン酸無水物の製造 エレオステアリン酸８０ｇに相当する桐油脂肪酸を脱水
蒸留直後の四塩化炭素６．００ｍ１に溶解した、この溶
液にジシクロへキシルカルボジイミド３２．６ｏを加え
、容器内をアルゴンガスで置換して密封し、そのまま２
５℃で２４時間放置（時々撹拌）した。不溶成分を濾別
し、蒸留乾固した。これをジクロロメタンを展開溶媒と
してシリカゲルで精製したところ、２９％の収率でエレ
オステアリン酸無水物が得られた。

卵黄レシチン（キューピーＰＬ−１００）４５９を脱水
エーテル４５０１１Ｌ１．に溶解し、不溶物を濾別後、
１０％１１１１のテトラブチルアンモニウムヒドロキシ
ドのメタノール溶液５Ｏ−ＩｒＬｌ、を加え、２５℃の
温度で激しく振とうした。反応の進行に伴なって溶液は
白濁し、次第に層分離してくるので、これを静置し、褐
色油状物を充分沈澱させ、上澄をデカンテーションした
。褐色油状物を脱水エーテル１００７７１１で３回洗浄
したのち、脱水メタノール１２５ｍ１．に加熱溶解させ
、沸点還流下に脱色剤１ｇを加えて熱時濾過した。冷却
後、濾液に脱水エーテル２５０ｍｊ！を加え、析出沈澱
を残してデカンテーションし、沈澱を熱１１４０ｍｆｆ
１に溶解させた。これに塩化カドミウム５／２永和物８
ｇを純水２０ｍ１に溶解したものを加え、さらに活性炭
２．５ｇおよび脱色剤２９を加えて沸点還流後、濾紙お
よび０．２５μｍミリポアフィルタ−にて濾過した。こ
れにエタノール１００〜１５０１１Ｌ１を加えたところ
、着色沈澱が生成したので、これを除去して白濁溶液の
みを採取し、さらにエタノール１００〜１５０ｍｊ！を
加えて激しく振とうしたところ、白色結晶が析出してき
た。

０〜５℃の温度で一夜静Ｉｆ後、析出結晶を源泉し、脱
水メタノール、脱水エーテルおよび脱水ベンゼンの順で
結晶を洗浄し、ざらに五酸化リン上で８０℃の温度で終
夜真空乾燥したところ、５６％の収率でホスファチジル
コリン加水分解物のカドミウム錯体が得られた。

エステル化による重合性　質の製造 卵黄レシチン加水分解物カドミウム錯体６．７４ｇに、
蒸留直後のクロロホルム１６０ｍｊ！を加えて撹拌下に
懸濁させた。これに桐油脂肪酸無水物２４．７０ｖおよ
び触媒である４−ジメチルアミノピリジン５．６１ｇを
加え、容器内をアルゴンガスで蒙換したのち、密栓し、
暗所で２５℃の温度で６０時間攪拌しながら反応させた
。このとき、白色不溶物が析出したので、これを濾別し
、溶媒を室温下減圧留去後、メタノール／クロロホルム
／水−５／４／１混合溶媒１００１１Ｌ２に再溶解させ
る。この溶液を再度濾過して濾液をイオン交換樹脂ＡＧ
−５０１−Ｘ８　（Ｄ）（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ）カラムに注
入し、先の混合溶媒５００＋ｎ／！で洗い落した。この
溶媒を２５℃の温度で減圧留去したのち、クロロホルム
に再溶解してシリカゲルカラムによる精製を行なったと
ころ、３０％の収率でエレオステアリン酸ホスファチジ
ルコリンが得られた。その赤外線吸収スペクトルは、第
１図のとおりであった。

重合性リン脂質からのリポソームの　造エレオステアリ
ン酸ホスフ？ジルコリン２００ｍｇをクロロホルムト１
に溶解した。このようにして得られた脂質溶液をナス型
フラスコに入れ、エバポレータで溶媒を完全に除去して
ナス型フラスコ底面に脂質膜を形成させた。これにヘベ
スバツフｐ　（Ｈｅｐｅｓ　　ｂｕｆｆｅｒ）　　（１
０ｓ　Ｍ、　ｐ　ｌ−１８。

０）１０ｍｌを添加してポルテックスミキサーで振とう
した後、チップ型超音波照射ＩＩ（４０〜５０Ｗ）でア
ルゴン気流下に１０分間処理した。処理液は白濁状態か
ら透明分散液となり、リポソームの形成が確認された。

また、走査型電子碩微鏡により直径０．２〜０．５μｍ
の球状粒子が観察され、リポソームの形成が確認された
。

実施例１ リポソームの重合（＠用担体の製造） ７５Ｗの水銀ランプを光源として照射距離１２ＣＩｍ、
サンプル濃度１０１ｇ／ｉｆとし、脱気下において、水
ｍ２５℃の水浴中で紫外線を照射したところ、第２図に
示すようにトリエンに基づく２７２ｎｌＩにおける吸光
度が照射時間の経過とともに減少していることから重合
が進行していることが確認された。

実施例２ ヘモ　ロビンカプセル化リポソームの調製重合性のリポ
ソーム形成脂質の製造例で得られたエレオステアリン酸
ホスファチジルコリン４６１１ｇ（５８μｓｏｌ　）に
、コレステロール２２．１ｖ（５８μｍ０１）を含有す
るクロロホルム溶液および桐油脂肪８２．４ｍ１８．５
μａ＋ｏｌ　）を含有するクロロホルム溶液を加え、得
られる溶液を５０１ｒＬ１のナス型フラスコに入れ、窒
素を吹付けてフラスコ底面に薄膜を形成させ、エバポレ
ータで２５℃の温度で１時間乾燥させたのら、２５℃の
温度で２時間半真空乾燥を行なった。ついで、−酸化炭
素化したヘモグロビンを１０％含有する生理良塩水溶液
１０１ｒＬＩｌを加え、ポルテックスミキサーで振とう
したのち、バス型超音波照射機（２０Ｗ）でアルゴン気
流下に３０分処理した。これにリン酸緩衝液（１）Ｈ７
，４＞４０ｍｊ！を加え遠心分離（１０，ＯＯＯｒｐｍ
　、１０分間）後、沈澱にリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４
）１１ｍｌ、を加えた。

得られた懸濁液のうち３．５ｍｌを分取し、−酸化炭素
置ＦＩＡ後、暗所にて終夜攪拌したのら、５゜０００　
ｒｐｍで１０分間遠心分離し、これにリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４＞を加えて３ＴｒＬｌ、に定容したモノマーリ
ポソーム懸濁液をＩＦＩ−た。このモノマーリポソーム
懸濁液０．４ｍｌを牛血類またはリン酸緩衝液３．６ｍ
ｌ、に加えた。

また、得られた懸濁液のう＃５３．５１ＲＩを分取し、
−酸化炭素置換後、７５Ｗの水銀ランプを光源として照
射距離１２ＣＩで２５℃の温度で１２時間攪拌下紫外線
照射を行ない、ついで５．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離し、これにリン酸１衝液（ｐＨ７，４＞を加えて３
雇２に定容したポリマーリポソーム懸濁液を得た。この
ポリマーリポソーム懸濁液０．４ｍ（ｌを牛血類または
リン酸緩衝液３゜６ｍｌに加えた。

ヘモグロビン漏出試験 ヘモグロビンリポソームのモノマーおよびポリマーのそ
れぞれを牛血類およびリン酸緩衝液中に一定時間放置し
、その懸濁液全体の可視スペクトル（ヘモグロビンに塞
づ＜４００ｎｌｌ付近のピーク）と、これを遠心弁＃ｌ
（牛血類；　１０．０ＯＯｒｐＨ、リン酸！ｌ衝液；　
５．ＯＯＯｒｐｍ　、１０分）しだ上清のスペクトルを
比較し、リポソームからのヘモグロビン漏出を定量した
。その結果は、第１表のとおりであった。

比較例 つぎの化学式で示されるジエンホスファチジルコリン４
５１１１！ＩＩ（６０μ５ｏｌ）、コレステロール２３
．２ｍ　ｇ　（６０μｓｏｌ　）および桐油脂肪酸２゜
４１１１＋１（８，５μｓｏｌ　）を用いてリポソーム
の重合例２と同様な方法でヘモグロビンカプセル化リポ
ソームを調製した。

得られたヘモグロビンリポソームのモノマーおよびポリ
マーについて、リポソームの重合例２と同様なヘモグロ
ビン漏出試験を行なったところ、第２表のとおりであっ
た。

（以下余白） 逓Ｌ−二り−」！ ４時間　　　　七ツマ−５，０５１，３８２７ボリマー
　　　　３．１８　　　０　　　　　　　０３日間　　
　　モノマー　　　　４．１４　　　１．３２　　　　
３２ポリマー　　　　２．１７　　　０　　　　　　　
０１週間　　　　モノマー　　　　３．６８　　　１．
５７　　　　４３ポリマー　　　　２．５１　　　０　
　　　　　　０第２表 ４時間　　　　モノマー　　　１３．３１　　　４．２
６　　　　３２ポリマー　　　１２．４９　　　４．１
８　　　　３３３日間　　　　モノマー　　　１３．３
８　　　６．５０　　　　４９ポリマー　　　１２．１
０　　　３．５２　　　　２９１週間　　　　モノマー
　　　１１．７９　　　５．４０　　　　４６ボリマー
　　　１１．０２　　　２．８９　　　　２６日ｂりヘ
モグプロン リンＭＭ’ｔＪ液中　（相対値） ３．７６　　　０．４０　　　　１１ ２．３８　　　０　　　　　　　　０ ３．６７　　　０．４３　　　　１２ １．９６　　　０　　　　　　　　０ ３．８８　　　０．４８　　　　１２ ２．１８　　　０　　　　　　　　０ １３．１０　　　１．０５　　　　　８１３．０９　　
　１．０９　　　　　８１０．０９　　　０．３９　　
　　　４１１．８５　　　１．８４　　　　１５７．８
２　　　０．１５　　　　　２ ８．８６　　　０．７２　　　　　８ 第１表から明らかなように、エレオステアリン酸ホスフ
ァチジルコリンモノマーリポソームからのＨｈ漏出が、
牛血禁中において経時的に増大するのに対し、ポリマー
リポソームでは１週間後においてもヘモグロビンの漏出
が全く認められず、高分子化によるリポソーム安定性向
上が顕著に表われた。一方、第２表から明らかようにジ
エンホスファチジルコリン系では、ポリマーリポソーム
においてもヘモグロビンの漏出がｌ！Ｉｉｌ！され、高
分子化による効果は低い。

■９発明の具体的効果 駅上述べたように、本発明による医用担体は、前記一般
式１で示すように、その疎水基中にエレオステアリン酸
に由来する３１１の共役二重結合が存在するので、該脂
質から形成されるモノマーリポソームは紫外線の照射に
より容易に重合し、また重合後のリポソームである担体
は天然のリン脂質のみよりなるリポソームに比較して安
定性が向上している。このため、本発明のポリマーリポ
ソームである医用担体に医薬物質、酵素、ヘモグロビン
等を担持させれば、極めて優れた医薬、人工赤血球等が
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による医用担体の重合前の主構成成分で
あるリポソーム形成脂質の赤外線吸収スペクトルの一例
を示すチャートであり、また第２図はリポソーム形成脂
質から形成される本発明の医用担体の紫外線照射による
重合の程度を示す紫外線吸収スペクトルの一例を示すチ
ャートである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）つぎの一般式 I で表わされるリポソーム形成脂
   質を主構成成分とするリポソームを紫外線または放射線
   で照射処理してなる医用担体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒは−（ＣＨ＿２）−＿２Ｎ＾■（ＣＨ＿３
   ）＿３、−（ＣＨ＿２）−＿２Ｎ＾■Ｈ＿３または−Ｃ
   Ｈ＿２−ＣＨ（Ｎ＾■Ｈ＿３）−ＣＯＯ＾■である。）
2. （２）Ｒは−（ＣＨ＿２）−＿２Ｎ＾■（ＣＨ＿３）＿
   ３である特許請求の範囲第１項に記載の医用担体。
3. （３）照射処理は紫外線で行なわれてなる特許請求の範
   囲第１項または第２項に記載の医用担体。
4. （４）ヘモグロビン担持用である特許請求の範囲第１項
   ないし第３項のいずれか一つに記載の医用担体。