JPS6029477B2 - 新規抗生物質ａｈ２５８９ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規抗生物質ＡＨ２５８９一１およびＡＨ２斑
９−川こ関するものである。

本発明者らはストレプトミセス属に属する菌株の培養液
中にグラム腸性菌、グラム陰性菌に対して生育阻害作用
を有するＡＨ２斑９と称する抗生物質が生産されている
ことを見い出し、さらに詳細なる研究の結果、ＡＨ２５
８９より性状類似の２つの新規抗生物質ＡＨ２斑９一１
およびＡＨ２斑９ーロを単離しうろことを知り、本発明
を完成した。

ＡＨ２斑９はその理化学的研究の結果、水溶性べプチド
抗生物質に属し、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ア
スパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プ
ロリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、
ロイシンおよびフヱニールアラニンを含有し、特にプロ
リン含有率の高いことを特徴とする新規抗生物質群であ
ることが確認された。本発明書では特記せぬ限りＡＨ２
班９はＡＨ２５８９−１およびＡＨ２５８９−０の混合
物を意味する。

ＡＨ２球９−１およびＡＨ２５８９−川ま後記の諸性質
を有し、特に動物の疾病の治療薬および飼料添加剤とし
て有用である。ＡＨ２斑乳物質生産菌の一例としてスト
レプトミセス・グロビスポルスＡＨ２斑９（徴工研申請
受理番号は後記）が挙げられる。

このＡＨ２５８９粥ま本発明者らが新潟県佐渡の土壌か
ら新たに分離した放線菌である。このＡＨ２５８９茶の
菌学的性質は次の通りである。（１）形態的性質 気菌糸の着生は天然塔地上および合成培地上において良
好であり胞子形成も良好である。

分枝は単純分枝で車軸分枝は認められない。気菌糸先端
の形状は直状ないし屈曲状である。電子顕微鏡観察によ
る胞子の表面構造は平滑型である。胞子の形は同筒形な
いし楕円形で大きさは０．４〜０．５×０．６〜０．８
ミクロンである。胞子は通常１０〜２坊重鎖する。山）
各種塔地上の生育状態 （洋）培養温度はすべて２７℃である。

（ｍ）生理的性質 ○｝ 生育温度範囲 １５〜３７０‘２’
ゼラチンの液化 陽性（２０℃）糊 スター
チの加水分解 陽性‘４） 脱脂乳の凝固
陰性脱脂乳のべプトン化 陽性 ■ メラミン様色素の生成 陰性 側 硝酸塩の還元性 陽・性（Ｗ）炭素源
の利用性（プリードハム・ゴットリーブ寒天塔地）利用
する：Ｄグルコース、Ｌーアラビノース、Ｄーキシロー
ス、Ｄーフラ クトース、Ｌーラムノース、Ｄ ーマンニツト 利用しない：シユクロース、イノシトー ル、ラフイノース 上記からＡＨ２斑功珠の性状を要約すると、ストレプト
ミセス属に属し、気菌糸先端の形状は直状ないし屈曲状
であり、胞子の表面構造は平滑型である。

発育裏面の色調は淡黄色ないし淡黄褐色で、気菌糸は淡
黄色ないし淡黄澄色である。メラニン様色素は生成せず
、培地中への可溶性色素は無いか又は弱い黄色ないし弱
い黄褐色である。以上の様な菌学的性質を示す菌株につ
いてワックスマン著ジ・アクチノミセテス第２巻（１９
６１年）およびシヤーリングおよびゴツトリープのＩＳ
Ｐ（インターナショナル・ストレプトミセス・プロジェ
クト）報告（１９＄年、１９６単王および１９７２年）
により検索すると、ＡＨ２班財料こ最も近縁するものと
してストレプトミセス・グロビスポルスが挙げられる。
ストレブトミセス・グロビスポルスのＩＳＰ報告とＡＨ
２５８甥珠とを比較すると前者は黄色ないし緑黄色の可
溶性色素を生産することがあるが、後者では可溶性色素
は無かあるいは弱い黄色ないし弱い黄褐色であり、その
他の基本的性状は非常に類似している。従ってＡＨ２５
８９総まストレプトミセス・グロビスポルスに属させる
のが妥当と考えられる。しかしストレブトミセス・グロ
ビスポルスの公知の菌株で今迄にＡＨ２５８９を生産す
るという報告は無い。故に、本発明者らはＡＨ２５８玖
珠をストレプトミセス・グロビスポルスＡＨ２５８９と
命名して公知の菌株と区別し、微生物工業技術研究所に
保管を委託した。（徴工研菌寄第４７０６号）。本発明
の物質の生産に際しては上記菌株以外にＡＨ２５８９を
産生する能力を有するすべてのストレプトミセス属の菌
株を使用することができる。

またこれらの生産菌は通常のストレプトミセス属の菌株
と同様に、自然的にあるいは人工的にその性状が変化し
易く、例えば紫外線、エックス線、放射線、薬品等によ
り容易に変異させることができる。このような変異株で
あってもＡＨ２５８９を生産する能力のある繭株はすべ
て本発明物質の生産に使用することができる。本物質を
生産するために使用する培地としては炭素源、窒素源、
無機物等を含む、微生物の培養に通常用いられる培地が
広く使用されうる。

炭素源としては例えばぶどう糖、乳糖、庶糖、デキスト
リン、澱粉、グリセリンなどが使用される。窒素源とし
ては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば大豆粉
、ベブトン、肉エキス、酵母エキスなどが使用される。
その他リン酸塩、マグネシウム、カリウム、カルシウム
、ナトリウム、銅、鉄、亜鉛、マンガンなどの塩類が必
要に応じて使用される。本物質を生産するための培養は
通常好気的培養が好ましく、特に通気縄群培養が好適で
ある。

培養温度は菌が生育し、抗生物質ＡＨ２５８９を生産す
る範囲内で適宜変更しうるが、最も好ましいのは２５〜
３０『０である。培養時間は種々の条件によって異るが
、通常４０〜１５Ｇ時間程度であり、抗生物質ＡＨ２球
９が充分生産された時に培養を終了する。ストレブトミ
セス・グロビスポルスＡＨ２斑９の場合、通常の方法で
培養を行なうと、ＡＨ２斑９一１とＡＨ２５８９ーロを
同時に生産するが、２物質の取得量の比率は使用する菌
株および培養条件を選ぶことにより、さらには後記の精
製手段を選ぶことによって適宜変化させることができる
。このようにして得られた培養液からの抗生物質ＡＨ２
斑９の採取は、微生物の培養液より抗生物質を分離精製
する公知の手段を適宜選択し、組合わせて行うことがで
きる。

例えば活性炭、アンバーライトＸＡＤ一２（米国、ロー
ムアンドハース社）、同ＸＡＤ−４、同ＸＡＤ−７など
の吸着剤、またダゥェックス５０（米国ダウケミカル社
）、ＳＰ−セフアデツクス（スウエ山デン、フアルマシ
ア社）、ダウェックス１（米国、ダウケミカル社）、Ｑ
ＡＥ−セフアデツクス（スウェーデン、フアルマシア社
）などのイオン交換体が使用される。培養物から抗生物
質ＡＨ２球９−１およびＡＨ２５８９ーロを分離精製す
る手段の一例を示すと次の如くである。

即ち、ストレプトミセス・グロビスポルスＡＨ２５８球
朱を前述したように培養して得られる培養物から繭体を
炉別する。培養炉液を吸着剤アンバーライトＸＡＤ−２
のカラムに通じ、メタノール水で抗菌性物質を回収し、
減圧下で濃縮する。ついでこの濃縮液を用いてアンバー
ライトＸＡＤ−２のカラムクロマトグラフイを行う。即
ち上記濃縮液をカラムに通じ、水洗後、さらに１０％メ
タノール水で洗浄する。その後１０％メタノール水から
５０％メタノール水への濃度勾配港出を行う。得られた
溶出液の抗菌活性画分を集めて減圧下で濃縮後、凍結乾
燥して抗生物質ＡＨ２斑９を得る。

この混合物質ＡＨ２斑９を予め１．９ Ｍ蟻酸と０．８
Ｍアンモニア水の９対１濠液で緩衝化してＳＰーセフア
デックスのカラムに吸着させ、１．Ｍ蟻酸とｏ．ａＭア
ンモニア水の９対１混液と３対２混液の濃度勾配で溶出
すると抗生物質ＡＨ２５８９−１と抗生物質ＡＨ２５８
９一ｎが単離される。なお生産された抗生物質の定量は
スタフイロコツカス・アウレウスもしくはエシヱリヒア
・コリを検定菌とする微生物定量法を用いることができ
る。後記実施例によって得られる抗生物質ＡＨ２５８９
一１およびＡＨ２斑９ーロの物理化学的性質について述
べると次の通りである。

くＡＨ２５８９−・） くＡＨ２５８９−。

）‘ｌｉ形 状 淡褐色の粉末 淡
褐色の粉末‘２′ 元素分析後）
Ｃ ４ ４．２３ Ｃ １７．
９ ５（実測値） 日 ６．
５９ 日 ６．４１Ｎ １
３．４ ９ Ｎ １４．２
４■分子量くゲル炉適法） ２，００ ０
〜１０，０００ ２，００ ０〜１０，０
０ ０（４ｉ 融 点 １９０〜２００
℃付近で徐々Ｋ ２１０〜２２０℃付近で徐々に黒変す
る。

黒変する。（５）比旋光度
Ｑ〕２３＝−２４０ 〔ｑ〕を＝−６８０く
Ｃ＝。‐１，日２０） くＣ＝〇‐１，日２０
）（６′ 紫外部吸収 水、０．１Ｎ塩酸、０
．１Ｎ水酸化 水、０．１Ｎ塩酸、０．１Ｎ水酸化スペ
クトル ナトリヮム中の紫外部吸収スベ ナトリ
ゥム中の紫外部吸収スペクトルは第１図に示す通りであ
クトルは第２図に示す通りである■
る。（７′ 赤外部吸収 臭化カリウム錠
剤法による赤外 臭化カリウム錠剤法による赤外スペク
トル 部吸収スペクトルは第３図Ｋ示 部吸収ス
ペクトルは第４図に示す通りである。

す通りである。（８Ｊ 溶 解 降
水Ｋ易溶。 水に易溶。含水メ
タノール、含水ェタノー 舎水メタノール、含水ェタノ
−ル、含水ァセトンに可溶。 ル、含水ァセトンに
可溶。メ タ ノーノし、 エ タ ノ ーノレ 、
フ・タ メ タ ノーノし、エ タ ノ ーノレ、プ
タノーノし、７セトン、クロロホノレ ノーノレ、ア
セトン、クロロ ホノレム、酢酸エチル、ベンゼン、ヘ
ム、酢酸エチル、ベンゼン、ヘキサンなどの有機溶剤
には難溶 キサンなどの有機溶剤には雛溶又は不溶。
又は不溶。（９１ 呈色反応
（陽性反応） く陽性反応）ラィ
ドン・スミス、銅−フオリ ラィドン・スミス、銅−フ
ォリン、過マンガン酸ヵリゥム ン、過マンガン酸カ
リウム（陰性反応） （陰性反応）ニ
ンヒドリン、アンスロン、エ ニンヒドリン、アンスロ
ン、エノレソ ン ．モノレガン、カノレバゾー ノ
レソン・モノしガン、カノレバゾーノレ
ノレ伽クロ
マトクラフィＫよるＲｆ値■ シリカゲル簿層クロマト
グラフィくメルク社）■ セルｏ−ス薄層クロマトクラ
フィ（メルク社）００ 高圧炉紙電気泳動く．東洋炉紙
豚５１、電圧３３００Ｖ、時間３０分）０２ アミノ酸
分析： くＡＨ２５８９−１） （ＡＨ
２５８９−Ｕ）６Ｎ塩酸で１１０℃、 リジン、ヒスチ
ジン、ァルギニ リジン、ヒスチジン、ァルギニ２４時
間加水分解。 ン、ァスバラギン酸、スレオニ ン、ア
スバラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、ブ
ン、セリン、グルタミン酸、ブくＡＨ２５８９−・）
くＡＨ２５８９−Ｕ）６Ｎ塩酸で１１０℃、 ロ
リン、クリシン、アラニン、 ロリン、グリシン、アラ
ニン、２４時間加水分解。 バリン、ィンロィンン、ロ
ィシ バリン、ィソロィシン、ロィンン、フェニールァ
ラニンを含有 ン、フヱニ−ルァラニンを含有するがソ
スチン、メチォニンは するがシスチン、メチオニンは
検出されない。含有比はブロリ 検出されない。含有比
はブロリンを１０とした時、グリシン４ ンを１０とし
た時、グリシン７〜５、クルタミン酸３〜４で他 〜８
、グルタミン酸３〜５で他のアミノ酸は３以下である。
のアミノ酸は３以下である。次にＡＨ２５８９−１お
よびＡＨ２５８９−０の生物学的性質について述べる。
各種微生物に対する抗菌スペクトルは第１表に示す如く
である。

なお、第１表は寒天希釈法により最小生育阻止濃度を測
定した結果を示すものである。第 １ 表 抗菌スペク
トルく最／Ｊ・生育阻止濃度 単位〃タイ雌）また抗生
物質ＡＨ２５８９−１およびＡＨ２５８９一Ｄのマウス
に対する急性毒性試験では、腹腔内投与でそれぞれ１０
０物９／ｋ９で全く異常が認められなかつた。

以上に述べた如くＡＨ２５８９−１およびＡＨ２５８９
−川まブロリンを多量に含有することを特徴とする水溶
性べプチド抗生物質であってグラム陽性、グラム陰性の
細菌に有効である。

上記抗生物質と類似した性質をもつ既知抗生物質との比
較を第２表に示した。第 ２ 表 既知抗生物質との比
較 このようにＡＨ２斑９一１およびＡＨ２斑９ーロは第２
表に示した既知抗生物質と明らかに区別され、またその
他の既知抗生物質とは種々の物理化学的性質および抗菌
スペクトルなどから容易に区別される新規抗生物質であ
る。

以下に本発明の生産に関する実施例を示すが、これは単
なる一例示であって何等本発明を限定するものではない
。

実施例 １ 澱粉１．０％、ぶどう糖１．０％、ベプトン０．５％、
肉エキス０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸マグ
ネシウム０．１％および徴量の硫酸銅、硫酸第１鉄、塩
化マンガン、硫酸亜鉛を含有する培地（殺菌前ｐＨ７．
２）１００肌を５００の上客三角フラスコは分注し１２
０℃、２び分間滅菌した。

これにストレプトミセス・グロビスポルスＡＨ２５８９
を接種し、２７ｏ０で７細寿間振鶴培養した。得られた
培養液３００叫を上記と同一組成の培地２０そを有する
３０そジャーフアメンターに移植し、２７℃で毎分２５
０回転で燈拝し、毎分１０その無菌空気を送り、９曲時
間培養を行った。このようにして得られた培養物６０の
こセラィトを加えて吸引炉遇し、培養炉液４５そを得た
。この培養炉液を２．５そのアンバーライトＸＡＤ−２
のカラム（直径８肌×長さ５０ｃｍ）に３０Ｍ／分の速
度で通じ、カラムを水洗した後、５０％メタノール水で
抗菌活性物質を回収した。溶出された抗菌活性画分７．
５夕を減圧下で濃縮し、ついでこの濃縮液を用いてアン
／ゞーライトＸＡＤ一２の力ラムクロマトグラフィを行
った。即ち濃縮液１そを２．５そのアンバーライトＸＡ
Ｄ−２のカラムに２０のと／分の速度で通じ、１０％メ
タノール水２．５そで洗浄後、１０％メタノール水と５
０％メタノール水各３そを用いて濃度勾配溶出を行った
。得られた溶出液の抗菌活性を有する画分を集めて減圧
下で濃縮した後、凍結乾燥してＡＨ２５８９の粗粉末（
６０００の９）を得た。得られた粗ＡＨ２５８９（６０
００の９）を１００の‘の水に溶解し、ＳＰ−セフアデ
ックス（１．５Ｍ蟻酸と０．９Ｍアンモニア水の９対１
混液で緩衝化）のカラム（直径３．５ｃの×長さ５０肌
）に通じ、１．則４蟻酸と０．８Ｍアンモニア水の９対
１鶴液と３対２猿液各２そで濃度勾配溶出を行った。こ
のクロマトグラフィでＡＨ２５８９−１が最初に溶出さ
れ、ついでＡＨ２５８９−０が溶出された。得られたＡ
Ｈ２５８９−１画分とＡＨ２５８９ーロ画分はそれぞれ
濃アンモニア水で中和した後、アンバーライトＸＡＤ−
２に吸着せしめ水洗により脱塩した。ついで５０％メタ
ノール水で抗菌活性物質を回収し、減圧下で濃縮乾固し
た。こうして得られたＡＨ２５８９−１とＡＨ２５８９
−山ま各々さらに、前述と同様のＳＰーセフアデツクス
の力ラムクロマトグラフイを行った。溶出された抗菌活
性画分は前述と同様に中和後、アンバーライトＸＡＤ−
２で脱塩して各抗生物質の溶液を得た。これを凍結乾燥
しＡＨ２５８９一１（１８０の９）の淡褐色の粉末およ
びＡＨ２５８９−ロ（１１０の９）の淡褐色の粉末を得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＨ２５８９−１の水（一）、０．１Ｎ塩酸（
一・一・）、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで・・・・・・
）中での紫外部吸収スペクトルである。 第２図はＡＨ２５８９−０の水（一）、０．１Ｎ塩酸（
一・−・）、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（・・・・・・
）中での紫外部吸収スペクトルである。第３図はＡＨ２
５８９−１の臭化カリウム錠剤法による赤外部吸収スペ
クトルである。第４図はＡＨ２５８９−Ｄの臭化カリウ
ム錠剤法による赤外部吸収スペクトルである。第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分子量は２０００〜１００００（ゲル濾過法）であ
   り、種々溶媒に対する溶解性は水に易溶、含水メタノー
   ル、含水エタノールおよび含水アセトンに可溶、メタノ
   ール、エタノール、ブタノール、アセトン、クロロホル
   ム、酢酸エチル、ベンゼンおよびヘキサンに難溶又は不
   溶であり、呈色反応はライドン・スミス、銅−フオリン
   および過マンガン酸カリウム反応陽性、ニンヒドリン、
   アンスロン、エルソン・モルガンおよびカルバゾール反
   応陰性であり、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解
   後のアミノ酸分析はリジン、ヒスチジン、アルギニン、
   アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、
   プロリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン
   、ロイシンおよびフエニールアラニンを含み、その組成
   比はプロリンを１０とした時グリシン４〜５、グルタミ
   ン酸は３〜４でその他のアミノ酸は３以下であるアミノ
   酸分析値を示し、第１図に示す紫外部吸収スペクトルを
   有し第３図に示す赤外部吸収スペクトルを有し、シリカ
   ゲル薄層クロマトグラフイーパターンはエタノール：水
   （４：１）でＲｆ値０．１０、クロロホルム：メタノー
   ル：４Ｎアンモニア（２：１：１上層）で０．９３、ク
   ロロホルム：メタノール：７％酢酸（５：４：１）で０
   ．３７を示すことを特徴とするＡＨ２５８９−Iと称す
   る抗生物質。 ２ 分子量は２０００〜１００００（ゲル濾過法）であ
   り、種々溶媒に対する溶解性は、水に易溶、含水メタノ
   ール、含水エタノールおよび含水アセトンに可溶、メタ
   ノール、エタノール、ブタノール、アセトン、クロロホ
   ルム、酢酸エチル、ベンゼンおよびヘキサンに難溶又は
   不溶であり、呈色反応はライドン・スミス、銅−フオリ
   ンおよび過マンガン酸カリウム反応陽性、ニンヒドリン
   、アンスロン、エルソン・モルガンおよびカルバゾール
   反応陰性であり、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分
   解後のアミノ酸分析はリジン、ヒスチジン、アルギニン
   、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸
   、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシ
   ン、ロイシンおよびフエニールアラニンを含み、その組
   成比はプロリンを１０とした時グリシン７〜８、グルタ
   ミン酸３〜５でその他のアミノ酸は３以下であるアミノ
   酸分析値を示し、第２図に示す紫外線吸収スペクトルを
   有し第４図に示す赤外線吸収スペクトルを有し、シリカ
   ゲル薄層クロマトグラフイーパターンはエタノール：水
   （４：１）でＲｆ値０．０７、クロロホルム：メタノー
   ル：４Ｎアンモニア（２：１：１上層）で０．９３、ク
   ロロホルム：メタノール：７％酢酸（５：４：１）で０
   ．２５を示すことを特徴するＡＨ２５８９−IIと称する
   抗生物質。