JPS60256393A - 分枝鎖脂肪又は芳香族ｌ‐アミノ酸の発酵的製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は培養培地中で分枝鎖脂肪族又は芳香族Ｌ−アミ
ノ酸を類似のα−ケトカルボン酸から発酵製造するため
の方法に関する。

従来技術 人及び動物に必須のアミノ酸としてはＬ−ロイシン、Ｌ
−イソロイシン及びＬ−バリンが著しく重要である。

水 っ　蛋白質の加ス分解による大量生産における古典的な
獲得法の他に１最近２０年間において特に微生物的及び
酵素的合成法が開発された。微生物的合成法においては
主に、分枝鎖アミノ酸の生合成経路の制御機構を突然変
異により、突然変異体が多量のアミノ酸を発酵性炭素源
から形成し、発酵培地中に蓄積するように、変化させた
コリンバクテリウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、デレキパクテリウ、ＩＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）及びアルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏ　ｂａ
ａ　ｔｏ　ｒ　）の菌をｆ重用する（例えばブレビバク
テリウム・チオデニタリス（Ｂｒｅｖｉ、ｂａｏｔｅｒ
ｉｕｍ　ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ　）を用いるイソ
ロイシン、米国特許第４３２９４２７号明細書）。−炭
素源の例は炭水化物、例えばグルコース、フルクトース
、マルトース、テンシン加水分解物、セルロース加水分
解物及び糖みつ、有機酸、例えば酢酸及びコハク酸、ア
ルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び炭化水
素、例えばｎ−パラフィンでｂる。通常の窒素源の例は
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素及びアンモニア錯化合物である。燐酸塩及び硫
酸塩のような無機塩、並びにカルシウム、マグネシウム
、マンガン及び鉄も使用される。ビタミン、例えばビオ
チン及びチアミン又は複合栄養素、例えば酵母抽出物、
ペゾトン、カブミノ酸（Ｏａｓａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ
）及び大豆加水分解物の添加も微生物の最適な成長を可
能とする。

前駆物質からのアミノ酸の微生物学的獲得は、いくつか
のアミノ酸、例えばインドール及びセリン又はアントラ
ニレートからのトリシトファン、Ｌ−アミノテチレー）
、Ｄ−）１ｚオニン、Ｌ−ヒドロキシブチレート又はＤ
Ｔ、＋−α−プロモゾチレートからのインロイシンに関
して公知である。

類似のα−ケトカルがン酸からのアミノ酸の獲得はα−
ケトグルタＶ−）からのし−グルタメートに関して〔オ
ツ力（Ｏｔｓｕｋａ）等著、工。

Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌ　Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ＋第６巻１号
、第６５〜５６頁、１９５７年〕及びピルベートからの
ＤＬ−アラニンに関して〔シャー（Ｓｈａｈ）等著、工
　Ｇｅｎ、　Ｍｌｏｒｏｂ：Ｌｏｌ、第１７巻、６２０
〜６２４頁、１９５７年〕の記載がある。これに対して
バシラス・ズゾテイリス（ＢａＯ１ｌｌｕ８８ｕｂｔｉ
ｌｉ８）を用いるα−ケトイソカプロエートからのＬ−
ロイシン及びα−クトインバレリエートからのＬ−バリ
ンの微生物学的獲得のだめの試みはあまり有望ではなか
った。

使用した微生物は大部分のケト酸を脱カルボキシル化し
、これによりわずかな収率しか達せられなかったので、
分枝鎖メ脂肪族アミノ酸をその類似のα−ケトカルボン
酸から獲得するためにはこの微生物は不適であった。

問題点を解決するための手段 この問題は培養培地中で分枝鎖脂肪族又は芳香族Ｌ−ア
ミノ酸を類似のα−ケトカルボン酸から発酵的に製造す
る方法において、グルタミン酸生成バクテリアなα−ケ
トカルボン酸に作用させ、反応が終了した後所望のアミ
ノ酸を単離することにより解決した。

コリンバ〉チリウム（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）属、特にコリンバクテリウム・グルタミクム（ｏｏｒ
ｙｎｅｂａｏｔ、ｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
の菌、殊にコリンバクテリウム・グルタミクムＡＴＯＯ
１３０３２及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属、特にブレビバクテリウム・フラブム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｓｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）の菌
、殊にブレビバクテリウム＠７ラデムＡＴＯＯ１４０６
７が好適である。

培養培地中には同化性の炭素源及び窒素源が含有されて
いる。炭素源としては炭−水化物、例えはグルコース又
は低級脂肪酸もしくはそのナトリウム塩例えば酢酸ナト
リウムを使用するのが有利である。

本発明方法においては、類似のα−ケトカルボン酸から
のアミノ酸の形成はバクテリアの成長と結合していない
ので、前記の物質は本発明方法においては主にエネルギ
ー源として意味を有する。

このことは同時に、同化性の炭素源の濃度を〉 低く保持すること、及びα−ケトカルボン酸を例えばバ
イオマス保持装置を有する発酵器中で連続的に類似のア
ミノ酸に変換すること、及び高い生成物濃度を達成する
ことを可能とする。

これに対して例えば発酵性炭素源からイソロイシンを製
造するだめの生合成はバッチ式に経過し、非常にわずか
な、従って後処理を困難にするアミノ酸濃度に導く。α
−ケトカルボン酸としＣは特にα−ケトイソカプロン酸
、α−ケトイソ吉草酸及びα−ケト−β−メチル吉草酸
が好適である。

この発酵は有利に…値５〜９で、温度２５〜４０　’Ｏ
で、好気性条件下に２〜１０日間実施する。培養基は特
に５０μｉ／ｌより高いビオチン−濃度を有している。

低いビオチン濃度においては成長は最適よりわずかに低
い。このことにより収率は低下する結果になる。発酵培
地のα−ケトカルボン酸に関する出発濃度は３０．９／
ｌを越えるべきではない、それというのもこれより高″
譲度にお７ては著し“成長抑制が生　、・しるためでめ
る。しかしながら、前駆物質の連続的な補充により臨界
ケ）ｄ濃度の回避下に高いアミノ酸濃度が達せられる。

発酵液からのアミノ酸の単離及び精製は従来の方法によ
り行なわれる。

本発明により製造されたＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシ
ン又はＬ−バリンをアミノ酸分析機並びにＬ−アミノ酸
オキシダーゼでの酵素テストにより同定し、定量した。

実施例 例　１ そらせ板２枚を備える５　００　ｍｌエルレンマイヤー
フラスコＺ〆中に次の組成の培養液１００ｄを加えたニ ゲルコース・Ｈ２Ｏ４０１／　ｌ Ｎａ−α−ケトイソカプロン酸　２０ｇ／１（ＮＨ４）
２８０．　２０１　／　Ｉ Ｋ２ＨＰ０．　０．５１１　／　ｌ ＫＨ２ＰＯ４０，５Ｉｌ／　ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５１１／　ｌＰｅ１３０４
・７　′Ｈ２００，０１１１／　ｌＭｎＳＯ４・４　Ｈ
２Ｏｏ、ｏ　１１１　／　１ビオチン　０．４Ｉη／Ｉ
Ｉ チアミンジクロリド　２１ｎｆ／／１ ０ａＯ０３２０、！ｉ’　／　１ オートクレーブ処理（１２１’Ｏ及び１気圧で２０分）
の前に一値を２ＮＮａＯＨで７．４に調節した。グルコ
ース及びα−ケトイソカゾロエートを分離してオートク
Ｖ−デ処理し、チプミンジクロリドを滅菌濾過し、０１
！ＬＯＯ３を乾燥滅菌しく１５０’０で８時間）、かつ
冷却した後、該溶液に無菌条件下に添加した。

そらせ板２枚を備えるエルレンマイヤーフラスコ５［］
Ｑｍ中の複合培地（グルコース２０．９／ｌ、ペゾトン
１０１１／）、酵母抽出物１０Ｊ／１ＳＮａＯＪ　２．
５１／ｌ、　ｐＨ７，４）　１００＋ｍ中３０℃及び１
００　ｒｐｍで成長した、１５時間後のコリンバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＯ○１３０３２の予培地を滅菌
０．９　Ｓ　Ｎａ０１中で２回洗浄し、滅菌肌９チＭａ
０１２　Ｏ１ＩＬｌ中に再懸濁させた。仁の細胞懸濁液
２祷を主培養の接種用に使用し、この主培養を６０′Ｃ
及び１００　ｒｐｍで恒温保持した。培養時間５７時間
の後、発酵培地はＬ−ロイシン１５．８１１／ｌを含有
した。

α−ケトイソカプロエートを含有しないコントロール配
合物の発酵培地は全くＬ−ロイシンな示さなかった。

例　２ 例１に記載したようにおこなったが、デラビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＯＯ１４０６７を使用した。

培養期間７２時間後に、発酵培地はＬ−ロイシン１４．
５１１／Ｉｔを含有した。

例　６ 例１と同様に行なったが、培養液はグルコースのかわり
に酢酸ナトリウム４０１１／ｌを含有した。

培養期間７２時間後に、培養液はＬ−ロイシン１０．９
Ｊｌ／ｌを含有した。

例　４ １）　例３と同様に実施したが、プＶビバクテリウム−
７ラデムＡＴＯＯ１４０６７を使用した。培養期間９６
時間の後、発酵培地はＬ−ロイシン７．１１！／ｌを含
有した。

例　５ 例１に記載したと同様に行なったが、培養液はグルコー
ス６０１／ｌＸｗａ−α−ケトインカプロン酸６０１１
／ｌ及び（ＮＨ４）２Ｂ０４４０１　／ｌを含有した。

培−ｉ１期間９６時間の後、発酵培地はＬ−ロイシン２
１．Ｅｌを含有した。

例　６ α−クトインカプロエート６％Ｗ／ｖより高い出発濃度
では著しい成長抑制が生じるので、α−ケトイソカプロ
エートを後から供給することにより高いα−ケトイソカ
ゾロエート濃度の回避下に高いＬ−ロイシン濃度が達せ
られた。

例１に記載したと同様に実施したが、培養液はグル：Ｉ
−ス６０　ｇ　／　ｌ及び（ＮＨ４）２Ｂ０４４０１１
／ｌを含有した。培養期間４８時間の後、Ｎａ−α−ケ
トイソカシロン酸２％Ｗ／Ｖを後供給し、更に５６時間
恒温保持した。この方法により、発酵培地中でＬ−ロイ
シン２４．９Ｊ／Ｊが達せられた。

例　７ 例１に記載したと同様に行なうが、培養液はＮａ−α−
ケトイン吉草酸２０１１／ｌをき有した。４８時間の培
養期間後、発酵培地はＬ−バリン１２．３１＋’／Ｊを
含有した。

例　８ 例１と同様に行なうが、培養液はＮａ　−Ｄ／Ｌ−α−
ケト−β−メチルバレリアン酸２０１１７１を含有した
。９６時間の培養期間後、発酵培ｍはＬ−トレオーイソ
ロイシン４．８１１／ｌ及びＬ−アローイソロイシン１
．８ｊｌ／１１を含有した。

例　９ 例１に記載したよう（心付なうが、培−液はグルコース
・ｌ１２ｏ　６０１　／　ｌ　％　（ＮＨ４）２８０４
４０１１／ｌ及びＯａ−α−ケトインカプロン＝　２０
　ｙ／ｌを含有した。α−ケトイソカプロン酸のカルシ
ウム塩は離溶性であるので、不溶の形で培養液の他の成
分と一緒にオートクンーデ処理した。

培養期間７２時間の後、発酵培地はＬ−ロイシン１２．
５１ｊ／ｌを含有した。α−ケトイソカシロン酸のＮａ
塩での、、コントロール配合物はＬ−。

イシン１２．３ｇ／ｚを含有した。

前記の反応は芳香族α−ケト酸の相応する芳香族α−ア
ミノ酸、例えばフェニルアラニンに変換するためにも適
用できる。

第１頁の続き 優先権主張　［相］１９８４９月２８日［相］西トイ＠
発明者　ベルマン・ザーム ０発　明　者　ヴオルフガング・ロイ ヒテンベルガー （ＭＢ　願人　ケルンフオルシュング スアンラーゲ・ユーリ ッヒ・ゲゼルシャフ ト・ミツトφベシュレ ンクテル・ハフラング ツ（ＤＥ）［株］Ｐ　３４３５６７４．６ドイツ連邦共
和国ユーリッヒ・つ゛エンデリヌスシュトラーセ７１ ドイツ連邦共和国ブルーフ−ベル・ゲシュヴイスターー
ショルーシュトラーセ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、培養培地中で分枝鎖脂肪族又は芳香族Ｌ−アミノ酸
   を類似のα−ケトカルギン酸から発酵的に製造するため
   に、グルタミン酸生成バクテリアをα−ケトカルボン酸
   に作用させ、反応が終了した後生じたアミノ酸を単離す
   ることを特徴とする分枝鎖脂肪族又は芳香族り一アミノ
   酸の発酵的製法。 ２、ｐＨ値５〜９、温度２０〜４５℃で好気性条件下に
   １〜１０日間の間処理し、かつ培養培地が同化性の炭素
   源及び窒素源を含有する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ６、　成長細胞を使用する特許請求の範囲第１項又は第
   ２項記載の方法。 ４、非成長（″′静止”）細胞を使用する特許請求の範
   囲第１項又は第２項に記載の方法。 ５、　α−ケトカルぜン酸の濃度が６０９／ｌを越えな
   い特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項
   記載の方法。 ６、　♂オチン濃度が５０μＩ／ｌより高い特許請求の
   範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の方法。 １　使用したα−ケトカルボン酸がα−クトイソカゾロ
   ン酸、α−ケトイソ吉草酸又はα−ケト−β−メチル吉
   草酸である特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
   れか１項記載の方法。 ａ　コリンバクテリウム属の菌を使用する特許請求の範
   囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載の方法。 ２　ブレビバクテリウム属の菌を使用する特許請求の範
   囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載の方法。 １０、コリンバクテリウム・グルタミクム株の菌を使用
   する特許請求の範囲第８項記載の方法。 １１、プＶビバクテリウム・フラブム株の菌な使用する
   特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２．コリンバクテリウム・グルタミクムＡＴＯＯ１３
   ０、ｓ２．を使用する特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １５、デレピバクテリウムーフラプムＡＴＯ○１４０６
   ７を使用する特許請求の範囲第１１項記載の方法。