DE3419585A1

DE3419585A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von verzweigtkettigen aliphatischen l-aminosaeuren aus (alpha)-ketocarbonsaeuren

Info

Publication number: DE3419585A1
Application number: DE19843419585
Authority: DE
Inventors: Ulrich 5150 Jülich Groeger; Wolfgang Dr. 6454 Bruchköbel Leuchtenberger; Hermann Prof. 5150 Jülich Sahm
Original assignee: Degussa GmbH; Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Evonik Operations GmbH
Priority date: 1984-05-25
Filing date: 1984-05-25
Publication date: 1985-11-28
Also published as: JPS60256393A

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von ver-
zweigtkettigen aliphatischen L-Aminosäuren aus CC-Ketocarbonsäuren Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Umwandlung von verzweigtkettigen, aliphatischen o(-Ketocarbonsäuren in die entsprechenden L-Aminosäuren.
Als für Mensch und Tier essentielle Aminosäuren haben L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin große Bedeutung.
Neben der klassischen Gewinnung im großen Maßstab durch Hydrolyse von Proteinen sind in den letzten zwanzig Jahren insbesondere mikrobielle und enzymatische Syntheseverfahren entwickelt worden. Bei den mikrobiellen Syntheseverfahren finden hauptsächlich Vertreter der Gattungen Corynebacterium, Brevibacteriumund Arthrobacter Verwendung,deren Regulationsmechanismen der Biosynthesewege für verzweigtkettige Aminosäuren durch Mutation so verändert wurden, daß die Mutanten große Mengen dieser Aminosäuren aus fermentierbaren Kohlenstoffquellen bilden und im Fermentationsmedium akkumulieren (z.B. Isoleucin mit Brevibacterium thiogenitalis, US-PS 4 329 427). Beispiele für die Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Maltose, Stärke-Hydrolysate, Cellulose-Hydrolysate und Melassen, organische Säuren wie Acetat und Succinat, Alkohole wie Glycerin und Ethanol und Kohlenwasserstoffe wie n-Paraffine. Beispiele gängiger Stickstoffquellen beinhalten Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff und Ammoniate. Anorganische Salze wie Phosphate und Sulfate sowie Calcium, Magnesium, Mangan und Eisen finden Verwendung.Zusätze von Vitaminen wie Biotin und Thiamin oder komplexer Nährstoffe wie Hefeextrakt, Pepton, Casamino-Acids und Sojabohnen-Hydrolysate ermöglichen ein optimales Wachstum der Mikroorganismen.
Die mikrobielle Gewinnung von Aminosäuren aus Vorstufen ist für einige Aminosäuren, wie Tryptophan aus Indol und Serin oder Anthranilat, Isoleucin aus L-Aminobutyrat, D-Threonin, L-Hydroxybutyrat oder DL-OC-Bromobutyrat ist bekannt.
Die Gewinnung von Aminosäuren aus ihren analogen i-Ketocarbonsäuren konnte für L-Glutamat aus Ot-Ketoglutarat (Otsuka et al, 1. Gen. Appl. Microbiol. 3(1)35-53, 1957) und für DL-Alanin aus Pyruvat (Shah et al, I. Gen.
Microbiol. 17, 620-624, 1957) gezeigt werden. Dagegen verliefen Versuche zur mikrobiellen Gewinnung von L-Leucin aus Ct-Ketoisocaproat und L-Valin aus Ct-Ketoisovalerat mit Bacillus subtilis wenig vielversprechend.
Die eingesetzten Mikroorganismen waren zur Gewinnung der verzweigtkettigen, aliphatischen Aminosäuren aus ihren analogen ob -Ketocarbonsäuren ungeeignet, da sie den größten Teil der Ketosäuren decarboxylierten, und somit nur geringe Ausbeuten erzielt werden konnten.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen, aliphatischen L-Aminosäuren aus den analogen aC-Ketocarbonsäuren in einem Kulturmedium, der dadurch gekennzeichnet ist, daß man Glutamat-produzierende Bakterien auf die Ot -Ketocarbonsäuren einwirken läßt und nach Beendigung der Umsetzung die gewünschte Aminosäure isoliert.
Geeignet sind Vertreter der Gattung Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, speziell Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, und Vertreter der Gattung Brevibacterium, insbesondere Brevibacterium flavum, speziell Brevibacterium flavum ATCC 14067.
In dem Kulturmedium sind assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen enthalten. Als Kohlenstoffquelle setzt man bevorzugt eine Kohlehydrat wie z.B. Glucose oder eine niedere Fettsäure bzw. deren Na-Salz wie z.B.
Natriumacetat ein.
Diese Stoffe haben in dem erfindungsgemäßen Verfahren hauptsächlich eine Bedeutung als Energiequelle, da die Bildung der Aminosäuren aus den analogen c(-Ketocarbonsäuren in dem vorliegenden Prozeß nicht an das Wachstum der Bakterien gekoppelt ist.
Das erlaubt gleichzeitig, die Konzentration assimilierbarer Kohlenstoffquellen niedrig zu halten und die CC -Ketocarbonsäure z.B. in einem Fermenter mit Biomasse-Rückhaltung kontinuierlich in die analoge Aminosäure umzuwandeln und hohe Produktkonzentrationen zu erzielen.
Demgegenüber laufen Biosynthesewege zur Herstellung z.B. von Isoleucin aus fermentierbaren Kohlenstoffquellen batchweise ab und führen nur zu geringen und so die Aufarbeitung erschwerenden Aminosäurekonzentrationen. Als Ct-Ketocarbonsäuren besonders geeignet sind OL Ot-Ketoisocapronsäure, g -Ketoisovaleriansäure und d -Keto-ß-methylvaleriansäure.
vorzugsweise Die Fermentation wird/bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 25 bis 400 C unter aeroben Bedin- gungen für 2 bis 10 Tage durchgeführt. Das Nährmediumweist insb. eine Biotin-Konzentration von mehr als 50 Jlg/l auf. nci niedr1ercn Biotin-Konzentrationen ist das Wachstum suboptimal. Dies kann eine Erniedrigung der Ausbeute zur Folge haben. Die Ausgangskonzentration des Fermentationsmediums an CL -Ketocarbonsäure sollte 30 g/l nicht übersteigen, da bei höheren Konzentrationen eine signifikante Wachstumshemmung auftritt. Durch kontinuierliches Nachdosieren der Vorstufe lassen sich jedoch unter Umgehung kritischer Ketosäurekonzentrationen hohe Aminosäurekonzentrationen erreichen.
Die Isolierung und Reinigung der Aminosäure aus der Fermentationsbrühe wird durch konventionelle Methoden vorgenommen.
Das gemäß der Erfindung produzierte L-Leucin, L-Isoleucin oder L-Valin wurde durch einen Aminosäure-Analysator sowie einen enzymatischen Test mit L-Aminosäure-Oxidase identifiziert und quantifiziert.
Beispiel 1: In einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen wurden 100 ml einer Nährlösung mit folgender Zusammensetzung gegeben: 40 g/l Glucose x H2 0 20 g/l Na- d -Ketoisocapronsäure 20 g/l (NH4)2S°4 0.5 g/l K2HPO4 0.5 g/l KH2PO4 0.25 g/l MgS04 x 7 H20 0.01 g/l FeSO4 x 7 H20 0.01 g/l MnSO4 x 4 H20 0.4 mg/l Biotin 2 mg/l Thiamindichlorid 20 g/l CaC03 Vor dem Autoklavieren (20 min bei 1210 C und 1 atm Druck) wurde der pH-Wert mit 2 N NaOH auf 7.4 eingestellt. Glucose undOt -Ketoisocaproat wurden getrennt autoklaviert, Thiamindichlorid sterilfiltriert und CaCO trocken sterilisiert (8 h bei 1500 C) und nach dem Erkalten der Lösungen steril zugegeben.
Eine 15 Stunden alte Vorkultur von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, gewachsen in 100 ml Komplexmedium (20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2.5 g/l NaCl, pH 7.4) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen bei 300 C und 100 rpm wurde 2x in steriler 0.9* NaC1 gewaschen und in 20 ml steriler 0.9% NaCl resuspendiert. 2 ml dieser Zellsuspension dienten als Inokulum der Hauptkultur, die bei 300 C und 100 rpm inkubiert wurde. Nach einer Kultivierungsdauer von 57 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 15.8 g/l L-Leucin. Das Fermentationsmedium des Kontrollansatzes ohne CC -Ketoisocaproat wies kein 1,-1,eucin auf.
Beispiel 2: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet.
Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 14.5 g/l L-Leucin.
Beispiel 3: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 40 g/l Na-Acetat anstelle von Glucose.
Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 10.9 g/l L-Leucin.
Beispiel 4: Es wurde wie in Beispiel 3 beschrieben verfahren, jedoch Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet.
Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 7.1 g/l L-Leucin.
Beispiel 5: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose, 30 g/l Na-ck-Ketoisocapronsäure und 40 g/l (NH4)2SO4.
Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 21.8 g/l L-Leucin.
Beispiel 6: Da bei einer Ausgangskonzentration von mehr als 3% w/v d-Ketoisocaproat eine signifikante Wachstumshemmung auftritt, wurde durch Nachfüttcrn von OL-Ketoisocaproat unter Umgehung hoher i -Ketoisocaproat-Konzentrationen eine hohe L-Leucin-Konzentration erreicht.
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose und 40 g/l (NH4)2SO4. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurden 2% w/v Na-& -Ketoisocapronsäure nachdosiert und für weitere 53 Stunden inkubiert. Bei dieser Verfahrensweise konnten 24.9 g/l 1,-Leucin im Fermentationsmedium erreicht werden.
Die vorstehend beschriebene Umsetzung kann auch für die Umwandlung von aromatischen (A-Ketosäuren in die entsprechenden aromatischen d-Aminosäuren angewandt werden.

Claims

Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen aliphatischen L-Aminosäuren aus 4-Ketocarbonsäuren Patentansprüche W Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen, aliphatischen L-Aminosäuren aus den analogen oC-Ketocarbonsäuren in einem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man Glutamat-produzierende Bakterien auf die ot-Ketocarbonsäuren einwirken läßt und nach Beendigung der Umsetzung die entstandene Aminosäure isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 5 bis 9, einer Temperatur von 20 bis 450 C unter aeroben Bedingungen für eine Dauer von 1 bis 10 Tagen arbeitet, und daß das Kulturmedium eine assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquelle enthält.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man wachsende Zellen verwendet.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nicht-wachsende ("ruhende") Zellen verwendet.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der ob C(-Ketocarbonsäure 30 g/l nicht überschreitet.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Biotinkonzentration > als 50 Xg/l ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete oc -Ketocarbonsäure oC -Ketoisocapronsäure , oc -Ketoisovaleriansäure oder a -Keto-ß-methylvaleriansäure ist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vertreter der Gattung Corynebacterium verwendet.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vertreter der Gattung Brevibacterium verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,' daß man einen Stamm von Corynebacterium glutamicum verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Brevibacterium flavum verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet.