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Verfahren zur fermentativen Herstellung von ver-
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zweigtkettigen aliphatischen oder aromatischen L-Aminosäuren aus d-Ketocarbonsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von verzweigtkettigen
aliphatischen oder aromatischen L-Aminosäuren aus den analogen «-Ketocarbonsäuren
in einem Kulturmedium.
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Als für Mensch und Tier essentielle Aminosäuren haben L-Leucin, L-Isoleucin
und L-Valin große Bedeutung.
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Neben der klassischen Gewinnung im großen Maßstab durch Hydrolyse
von Proteinen sind in den letzten zwanzig Jahren insbesondere mikrobielle und enzymatische
Syntheseverfahren entwickelt worden. Bei den mikrobiellen Syntheseverfahren finden
hauptsächlich Vertreter der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium und Arthrobacter
Verwendung,deren Regulationsmechanismen der Biosynthesewege für verzweigtkettige
Aminosäuren durch Mutation so verändert wurden, daß die Mutanten große Mengen dieser
Aminosäuren aus fermentierbaren Kohlenstoffquellen bilden und im Fermentationsmedium
akkumulieren (z.B. Isoleucin mit Brevibacterium thiogenitalis, US-PS 4 329 427).
Beispiele für die Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Maltose,
Stärke-Hydrolysate, Cellulose-Hydrolysate und Melassen, organische Säuren wie Acetat
und Succinat, Alkohole wie Glycerin und Ethanol und Kohlenwasserstoffe wie n-Paraffine.
Beispiele gängiger Stickstoffquellen beinhalten Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumnitrat, Harnstoff und Ammoniate. Anorganische Salze wie Phosphate
und
Sulfate sowie Calcium, Magnesium, Mangan und Eisen finden Verwendung.Zusätze von
Vitaminen wie Biotin und Thiamin oder komplexer Nährstoffe wie Hefeextrakt, Pepton,
Casamino-Acids und Sojabohnen-Hydrolysate ermöglichen ein optimales Wachstum der
Mikroorganismen.
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Die mikrobielle Gewinnung von Aminosäuren aus Vorstufen ist für einige
Aminosäuren, wie Tryptophan aus Indol und Serin oder Anthranilat, Isoleucin aus
L-Aminobutyrat, D-Threonin, L-Hydroxybutyrat oder DL-oC-Bromobutyrat ist bekannt.
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Die Gewinnung von Aminosäuren aus ihren analogen i-Ketocarbonsäuren
konnte für L-Glutamat aus OC-Ketoglutarat (Otsuka et al, 1. Gen. Appl. Microbiol.
3(1)35-53, 1957) und für DL-Alanin aus Pyruvat .(Shah et al, I. Gen.
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Microbiol. 17, 620-624, 1957) gezeigt werden. Dagegen verliefen Versuche
zur mikrobiellen Gewinnung von L-Leucin aus Ot-Ketoisocaproat und L-Valin aus O(--Ketoisovalerat
mit Bacillus subtilis wenig vielversprechend.
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Die eingesetzten Mikroorganismen waren zur Gewinnung der verzweigtkettigen,
aliphatischen Aminosäuren aus ihren analogen C -Ketocarbonsäuren ungeeignet, da
sie den größten Teil der Ketosäuren decarboxylierten, und somit nur geringe Ausbeuten
erzielt werden konnten.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von verzweigtkettigen, aliphatischen L-Aminosäuren aus den analogen cC-Ketocarbonsäuren
in einem Kulturmedium, der dadurch gekennzeichnet ist, daß man Glutamat-produzierende
Bakterien auf die OL -Ketocarbonsäuren einwirken läßt und nach Beendigung der Umsetzung
die gewünschte Aminosäure isoliert.
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Geeignet sind Vertreter der Gattung Corynebacterium, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, speziell Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, und
Vertreter der Gattung Brevibacterium, insbesondere Brevibacterium flavum, speziell
Brevibacterium flavum ATCC 14067.
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In dem Kulturmedium sind assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen
enthalten. Als Kohlenstoffquelle setzt man bevorzugt eine Kohlehydrat wie z.B. Glucose
oder eine niedere Fettsäure bzw. deren Na-Salz wie z.B.
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Natriumacetat ein.
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Diese Stoffe haben in dem erfindungsgemäßen Verfahren hauptsächlich
eine Bedeutung als Energiequelle, da die Bildung der Aminosäuren aus den analogen
oC-Ketocarbonsäuren in dem vorliegenden Prozeß nicht an das Wachstum der Bakterien
gekoppelt ist.
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Das erlaubt gleichzeitig, die Konzentration assimilierbarer Kohlenstoffquellen
niedrig zu halten und die d -Ketocarbonsäure z.B. in einem Fermenter mit Biomasse-Rückhaltung
kontinuierlich in die analoge Aminosäure umzuwandeln und hohe Produktkonzentrationen
zu erzielen.
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Demgegenüber laufen Biosynthesewege zur Herstellung z.B. von Isoleucin
aus fermentierbaren Kohlenstoffquellen batchweise ab und führen nur zu geringen
und so die Aufarbeitung erschwerenden Aminosäurekonzentrationen. Als Ct-Ketocarbonsäuren
besonders geeignet sind OL Ot-Ketoisocapronsäure, d ot-Ketoisovaleriansäure und
d -Keto-ß-methylvaleriansäure.
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vorzugsweise Die Fermentation wird je einem pH-Wert von 5 bis 9 bei
einer Temperatur von 25 bis 400 C unter aeroben Bedin-
gungen für
2 bis 10 Tage durchgeführt. Das Nährmediumweist insb. eine Biotin-Konzentration
von mehr als 50 pg/l auf. Bci niedrlercn Biotin-Konzentrationen ist das Wachstum
suboptimal. Dies kann eine Erniedrigung der Ausbeute zur Folge haben. Die Ausgangskonzentration
des Fermentationsmediums an Ot -Ketocarbonsäure sollte 30 g/l nicht übersteigen,
da bei höheren Konzentrationen eine signifikante Wachstumshemmung auftritt. Durch
kontinuierliches Nachdosieren der Vorstufe lassen sich jedoch unter Umgehung kritischer
Ketosäurekonzentrationen hohe Aminosäurekonzentrationen erreichen.
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Die Isolierung und Reinigung der Aminosäure aus der Fermentationsbrühe
wird durch konventionelle Methoden vorgenommen.
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Das gemäß der Erfindung produzierte L-Leucin, L-Isoleucin oder L-Valin
wurde durch einen Aminosäure-Analysator sowie einen enzymatischen Test mit L-Aminosäure-Oxidase
identifiziert und quantifiziert.
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Beispiel 1: In einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen wurden
100 ml einer Nährlösung mit folgender Zusammensetzung gegeben: 40 g/l Glucose x
H2 0 20 g/l Na-d. -Ketoisocapronsäure 20 g/l (NH4)2SO4 0.5 g/l K2HP04 0.5 g/l KH2P04
0.25 g/l MgS04 x 7 H20 0.01 g/l FeS04 x 7 H20 0.01 g/l MnS04 x 4 H20 0.4 mg/l Biotin
2 mg/l Thiamindichlorid 20 g/l CaC03
Vor dem Autoklavieren (20 min
bei 1210 C und 1 atm Druck) wurde der pH-Wert mit 2 N g«OH auf 7.4 eingestellt.
Glucose und C -Ketoisocaproat wurden getrennt autoklaviert, Thiamindichlorid sterilfiltriert
und CaCO3 trocken sterilisiert (8 h bei 1500 C) und nach dem Erkalten der Lösungen
steril zugegeben.
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Eine 15 Stunden alte Vorkultur von Corynebacterium glutamicum ATCC
13032, gewachsen in 100 ml Komplexmedium (20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l
Hefeextrakt, 2.5 g/l NaCl, pH 7.4) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen
bei 300 C und 100 rpm wurde 2x in steriler 0.9% NaC1 gewaschen und in 20 ml steriler
0.98 NaC1 resuspendiert. 2 ml dieser Zellsuspension dienten als Inokulum der Hauptkultur,
die bei 300 C und 100 rpm inkubiert wurde. Nach einer Kultivierungsdauer von 57
Stunden enthielt das Fermentationsmedium 15.8 g/l L-Leucin. Das Fermentationsmedium
des Kontrollansatzes ohne CC -Ketoisocaproat wies kein L-Leucin auf.
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Beispiel 2: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch
Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet.
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Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium
14.5 g/l L-Leucin.
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Beispiel 3: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch
enthielt die Nährlösung 40 g/l Na-Acetat anstelle von Glucose.
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Nach einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium
10.9 g/l L-Leucin.
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Beispiel 4: Es wurde wie in Beispiel 3 beschrieben verfahren, jedoch
Brevibacterium flavum ATCC 14067 verwendet.
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Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium
7.1 g/l L-Leucin.
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Beispiel 5: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch
enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose, 30 g/l Na-cL-Ketoisocapronsäure und 40 g/l
(NH4)2S04.
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Nach einer Kultivierungsdauer von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium
21.8 g/l L-Leucin.
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Beispiel 6: Da bei einer Ausgangskonzentration von mehr als 3% w/v
d -Ketoisocaproat eine signifikante Wachstumshemmung auftritt, wurde durch Nachfüttcrn
von oL-Ketoisocaproat unter Umgehung hoher i -Ketoisocaproat-Konzentrationen eine
hohe L-Leucin-Konzentration erreicht.
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Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch enthielt
die Nährlösung 60 g/l Glucose und 40 g/l (NH4)2S04. Nach einer Inkubationszeit von
48 Stunden wurden 2% w/v Na-& -Ketoisocapronsäure nachdosiert und für weitere
53 Stunden inkubiert. Bei dieser Verfahrensweise konnten 24.9 g/l L-Leucin im Ferientationsmedium
erreicht werden.
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Beispiel 7: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch
enthielt die Nährlösung 20 g/l Na-rC-Ketoisovaleriansäure, Nach einer Kultivierungsdauer
von 48 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 12.3 g/l L-Valin.
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Beispiel 8: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch
enthielt die Nährlösung 20 g/l Na-D/Lod-Keto-B-methylvaleriansäure. Nach einer Kultivierungsdauer
von 96 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 4,8 g/l L-threo-Isoleucin und lt8
g/I L-allo-Isoleucin.
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Beispiel 9: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch
enthielt die Nährlösung 60 g/l Glucose x H2Og 40 g/l (NH4)2S04 und 20 g/l Cad-Ketoisocapronsäure.
Da das Ca-Salz der α-Ketoisocapronsäure schwer löslich ist, wurde es in ungelöster
Form zusammen mit den anderen Bestandteilen der Nährlösung autoklaviert. Nach einer
Kultivierungsdauer von 72 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 12,5 g/l L-Leucin.
Der Kontrollansatz mit dem Na-Salz der i-Xetoisocapronsäure enthielt 12,3 g/l L-Leucin.
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Die vorstehend beschriebene Umsetzung kann auch für die Umwandlung
von aromatischen d-Ketosäuren in die entsprechenden aranatischen «-Aminosäuren wie
z.B. Phenylalanin angewandt werden.