JPS60188063A - ケトパントラクトンリダクタ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はケトパントラクトンを還元してＤ−パントラク
トンを与えろ反応を触媒するケトパントラクトンリダク
ターゼの製造方法なこ関する。

Ｄ−バントラクトンはパントテン醒、ＣＯへ等の重要な
合成中間体である。従来、Ｄ−バントラクトンは （１）　化学的に合成されたＤＩ、−バントラクトンよ
り光学分割剤を用いでＤ一体のみを取り出す方法。

（２）　ケトバントラクトンをヤラールなリガンドを持
つロジウム触媒で不斉還元する方法。

（３）　ケトバントラクトンを微生４／Ｊ菌体の有す立
体選択的な還元能力を８Ｊい゛Ｃ不斉還元する方法が知
られているが、（１）ではキニーネ、プルシン等の高価
な分割剤が必要であること、（２）、では高価な触媒を
多数に用いねばならないこと、水素加圧Ｆの反応である
ため取扱が厄介であること、（３）では少量のＬ−／（
ントラクトンの副生かさけしれないこと等の欠点があっ
た。

本発明者らは１呆的に有利なり一パントラクトをＤ−バ
ントラクトンに有利に導き得ることを見出した。

ケトバントラクトンを還元してＤ−バントラクトンを与
える反応を触媒す６ケトパントラクトン（以Ｆ　Ｋ　Ｐ
　Ｌと略す〕リダクターゼに関する報告は現在までにＷ
ｉｌｋｅｎ　らの一連の報告があるのみテアル。（タト
ンばＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４９．４６８９　−４
６９５　（１９７４）ノ これらの報告に示されている菌体はサツカロマイセス・
セレビシェＮＲＲＬ　Ｙ−２０８４、サツカロマイセス
・セレビシェＡ３６４Ａ　、ニスケリチア、コリＡ’ｒ
ｃｃｏｏａ’ｙ　およびエルビニア・マドグラフィーの
４１株のみであり、このうちサツカロマイセス・セレビ
シェ　Ａ３６４Ａ、エルビニア・マドグラフィーは酵素
を部分精製しているにとどまっている。

さらにニスケリチア・コリに関してもその酵素の破約な
ことは不明確である。一番記述のはつさりし“（いろサ
ツカロマイセス・セレビンエＮＲＲＬＹ−２０３４４こ
関しては該酵素り比活性がｃｅｌｌ　−ｆｒｅｅｅｘｔ
ｒａｃｔの段階をこおいて０．００９　ｕｎｉｔ　／ｒ
ｒｇ　蛋白と力をなり低い値を示しているにとどまつ°
Ｃいる。このような状況に鑑み本発明社らは工業的に有
利なＫＰＬリダクターゼを得ろ目的で、多数の菌株Ｊ）
Ｃｅｌｌ−ｆ　ｒｅｅ　ｅｘｔｒａｃｔを副ｇｉＬ、そ
の蛋白含有量とＫＰＬリダクターゼ活注、さらをこ生成
するバントラクトンのり、Ｌ体の比率をＤ−クロル炭酸
メンチルによりジアステレオマーとした俊、ガスクロマ
トグラフィーで分析する方法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　１１２゜９−１６　（１９８１））　）こより
スクリーニングを進めた。その結果いくつかの属に属す
る菌株が秀れたＫＰＬ　ＩＪダクターゼ酵素源となるこ
とを見出り本発明に至った。

即ち本発明の要旨はりゾーブス属、アスペルギルス属、
ピックラミス属、オーレオバシジウム属。

゛シゾサツカロマイセスノ属、ピチアＲ，ハンセヌラ属
、ニドマイコブシス属、シテロマイセス属、デバリオマ
イセス属、スポロポロマイセス属、トルロプシス属、キ
ャンデイダ属、ロドトルラ属、トリコスポロン属、アグ
ロバクテリウム属、エアロバクター属、アクロモバクタ
−属、フラボバクテリウム属、スタフィロコッカス属、
ミクロコツカス属、アルスロバクタ−）ｆ％、セラチア
属、ブレビバクテリウム属、アシネトバクタ−属、シュ
ードモナス属、キサントモナス属に属するケトパントラ
クトンリダクターゼ生産菌を栄養培地で培養して菌体内
にケトパントラクトンリダクターゼを蓄積せしめ、該菌
体からケトパントラクトンリダクターゼを採収すること
を特徴とするケトパントラクトンリダクターゼの製造方
法である。

本発明の要旨はムコール属、リゾツブス属、アスペルギ
ルス属、ペニシリウム属、フザリ、−ウム属。

ジベレラ属、グリオクラジウム属、オーレオバシジウム
ｋＡ　、フィトフトラ属、シリンドカルボン属。

ビソクラミス属、ピチ１属、ハ／セヌラ属、シュバニオ
マイセス属、デパリオマイセス属、スポロポロマイセス
属、サツカロマイセス属、クリプトコツカス属、トルロ
ブシスノ萬、＋ヤンデイｙＨ，トルラ属、ロドトルラ属
、トリコスポロン属、シゾサツカロマイセス属、シテロ
マイセス属、エンドマイコブシス属、トラメテス）（１
≦、ビシノボラス属。

アグロバクテリウム属、コリイ・バクテリウム属。

エアロバクター１４．アクロモバクタ−属、フラボバク
テリウム属、スタフィロコッカス属、ミクロコツカス〃
Ａ、アルスロバクタ−属、ブレビバクテリウム属、シュ
ードモナス属、キサントモナス属。

マイコバクテリウム属、セラチア属、アシイ・トバクタ
ー属のいずれかに属Ｌ１内にＫ　）’　Ｌ　’Ｊダクタ
ーゼを産生ずる＋ｊＵ力を有する微生物を当該生物菌体
栄養培地で培養して菌体内にＫＰＬリダクターゼを％積
せしめ、次いで当該１体よりＫ　Ｐ　Ｌ　リダクターゼ
を採取することを特徴とするＫ　Ｐ　Ｌ　ＩＪダクター
ゼの製造方法である。

本発す」においてＫ　Ｐ　Ｌ　＋）ダクターゼ産生菌と
して用いしれろ微生物は上記の偶に騙し、菌体内にＫ　
Ｐ　Ｌ　１７ダクターゼを蓄積すｊ能カを有す）もので
あればいずれでもよく、その具体例としてはりゾツプス
・オリザエＩ　Ｆ　０５４４０．アスペルギルス・ニガ
ーＩ　Ｆｏ　４３４３．ビソクラミス・フルバＩＦＯ７
９０１、オーレオバシジウム・プルランスＩＦ’０４４
０５、シゾサッ力ロマイセス・ボンベｌ　Ｆ　００３４
６゜ピチア・ファリノサｌ　Ｆ　００１９３．ハンセヌ
ラ・アノマラＩ　ｙ　Ｏ０５６９，エンドマイコブシス
・ビスポラｌ　Ｆ　００８０３．シテロマイセス・マト
リテンシスｌ　Ｆ　００９５４．−ｙバリオマイセス・
ハンセニルエＦＵ　（１７９４，スポロボロマイセス・
ボルサティヵスｌＦ　０１０３２．クリプトコツカス・
ネオフォーマシスＩ　Ｆ　００４１０．　Ｉ−ルロプシ
ス・キャンディダＩＦＱ０３８０　、キャンディダ・バ
ラブシロシスｌ　Ｆ　００７０８゜ロドトルラ・テ午セ
ンシスＩＦＯＯ９２０，ｌ−’ｊココアポロン・キャピ
テイタムＩ　Ｆ　００７４８．エアロバクター・クロア
カニＩＡＭ１２２１．セラチア・プリムチカムＩ　Ｆ　
０３０５５．アクロモバクタ−・ポリモルフＩ　Ｆ　Ｕ
　３１６０．フラボバクテリウム・スアベロレンズｌ　
Ｆ　０３７５２．アグロバクテリウム・ツメファシェン
スＩＡＭ　Ｂ−２ｆＪ−１，ミクロコツカス・ルテウス
ｌ　ＦＯ８０６４，コリネバクテリウム°グＩレタミカ
スＡＴＣＣ１３０６０，スタフィロコッカス・オーレア
スＩ　ＦＯ３０６０，アルスロバクタ−・グロビフオル
ミスｌ　Ｆ　０１２１８７　、プレヒバクテリウム・イ
ノセルタムＩ　Ｆ　０１２１４５　、　アンネトバクタ
ー・カルコアゼティカスＩＡＩＶｌ１５］７．　シュー
トモ六ス・シリンガニＩ　Ｆ　Ｏ１２６５５、キサント
モナス・キャムペストリスＩ　ＡＭ　１６７１などが挙
げられる。またこれらの菌の天然および人工変異１４１
であってモＫ　Ｐ　Ｌ　１７ダクターゼ産生能を有する
かきり同様をこ使用することができる。

本発明を実施するに当つ〔、まず削記のＫＰＬリダクタ
ーゼ産生菌の培養が行われろ。培養方法は液体陪食でも
固体培養でもよいが、工業的にはＫ　Ｐ　Ｌ　１７ダク
タ〜ゼ産生菌を液体培地に接種し通気攪拌培養を行うの
が有利である。培地の栄−ｔｅ　ｊｔＸとしては、微生
物の培養に通常用いられろ炭、＋：源。

窒素脈、無機塩、有愼微歳栄養脈ｌよどを微生物の種類
に沁じ′Ｃ適宜選択すればよい。培養温度は菌が生育し
Ｋ　ｐ　Ｌ　ＩＪダクターゼを産生ずる範囲内で適゛「
選択すればよく、一般的には１５〜５０℃であり、培地
のｐＨは通常３〜１０の範囲が適当である。培養時間は
微生物の種類に応じ”Ｃ適宜選択すればよく、Ｋ　Ｐ　
Ｌ　＋）ダクターゼの活性が最篩に達す６時期をみはか
らって適当な時期に培養を終了すればよい。かくして侍
られた培養物においＣＫ　Ｐ　Ｌ　！Ｊダクターゼは該
微生物菌体内に蓄積されてくる。

こ・りようにして得られた培養物よりＫ　Ｐ　Ｌ　リダ
クターゼを抽出し１粗製のＫ　Ｐ　Ｌ　＋）ダクターゼ
含有該を１１ろための方法は格別制限されるものではな
く、その具体的な例として、例えば培養液を固液分離し
得られた湿菌体を必要に応じてリン酸緩Ｗｊ（ｙ、やト
リス頃醒緩衝液などに懸濁せしめ、次いでリソチーム処
理、超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピーズ、
石英砂等での磨砕、処理、界面活性剤での溶菌処理など
の１体処理手段を適宜選択して組合せることによって菌
体内よりＫＰＬリダクターゼを抽出し、得られた抽出液
より適当な分離手段で残渣を除去することをこよって粗
製のＫＰＬリダクターゼ含有液（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　
ｅｘｔｒａｃりが母られろ。

次いでこＪ）＠４１ＫＰＬ＋）ダクターゼ含有液は、蛋
白質、酵素などの単離、精製手段として公知の方法を用
いることにより精製されたＫＰＬリダクターゼを得ろこ
とがでさる。かかる単離、精製手段の具体例として、例
えば硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、吸
着クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を挙げろことが
でき、必要に応じ適宜組合せて用いられる。

かくして得られろＫＰＬＩＪダクターゼは削記反応（Ｉ
Ｊを触媒する酵ぶであり、臨床検査用試楽。

研究用試楽などとしても有用である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

な３実施例中の％はとくに晴りのないかぎり重は基準で
あり、またＫ　Ｐ　Ｌ　リダクターゼの酵素活性測定法
などの分析法は以−ドの通りである。

（１）　酵素活性醐足法 ８２０ｍＭ　ＮＡＤＰＨ，２００ｍＭリン酸カリ緩衝液
（ｐｌ（７，５）を含む水溶液Ｑ、５ｍｌ　に酵素液５
　ｍｌを加えて窒素雰囲気下８０℃で３分間放置し゛〔
一定温度とした後、１００ｍＭ溶液で１０ｍ１ＪＩＩえ
て反応を開始させ、３４０　ｍＭの吸光初期減少をスペ
クトロメーター（日立Ｍｏｄｅｌ　ｇＱＱ−１０ｓｐｅ
ｃｔｒａｍｔｅｒ）で１ｌｌＵ　Ｗすることにより、酵
素活性を測定した。

Ｋ　Ｐ　Ｌ　リダクターゼ酵素活性は１分間をこｌ　ｍ
ＭのＮＡＤＰｉ′（を消費する酵素量を１単位（Ｕ）と
する。

（２）　蛋白量の定量 Ｂｏｖｉｎ　ｓｅｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　（ＢＳＡ
　）　を標準とするＬｏｗｒｙ法で定量する。

（３）Ｄ−バントラクトンの定量 ０．５Ｍのリン酸カリ緩衝液ＱＪｍｊに４０．０　ｍｇ
のＮＡＤＰＨ（４４，２ｍ　Ｍ　）　とｃｅｌｌ−ｆｒ
ｅｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　０．２ｍｚを加え、そこに塩酸
を含む水に溶解したブトパントラクトンの２Ｍ溶液を２
分毎にｇ　ｍｌずつｌＯ回添〃ｌする方法で反応を行な
わせた。ケトノ（ントラクトンの添〃口終了俊さらに８
０分間熟成して所定の方法で反応液を分析し、全生成パ
ントラクト７　ｔニー　占メるＤ−パットラクトンの比
率をＤ（％）で示した。なお、反応温度は８０℃であっ
た。

（４）　至適ｐＨ ｔｌ）の酵素活性測定法で用いた標準反応液を用いｐ）
Ｉ　５．０〜８．０／）リン酸カリ緩前漱、ｐｉ（７，
５〜９．０のトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，５〜９．５
のグリシノ−苛゛注ソーダ緩衝液を用い（ｔｈ　＋生を
測定し、その至適ｐ）ｌをめる。

（５）　ＰＨ安定性 （４）の至適ｐＨ測定で用いた各ｐｉ（の緩イ釘液に酵
素液を加えて３０℃で８０分間放置した後、ＫＰＬリダ
クターゼ活性の残存率を測定する。

（６）　熱安定性 ２０℃、８０℃、４０℃、５０’Ｃ，６０℃の各温度で
１０分間酵素液を処理し、その残存活性を測定する。

（７１Ｋｍ値 Ｋ　Ｐ　Ｌ　、　ＮＡＤＰＩ（に対す６Ｋｍ値を測定す
る。

実施例１ 麦芽エキス５％、酵母工午ス０．８％、寒天２％からな
る寒天斜面培地（ｐＨ０，０）　で２８℃、４８時間培
養したキャンデイダ・バラプシロシスＩＦ（Ｊ０７０８
　の１白金耳遺を、麦芽エキス５％、酵母エキス０．３
％からなりＰＩ（５，０に調整、加熱滅菌した液体培地
５ｍＡ　、３本に植菌し、２８℃で４８時間振盪培養し
た。次に種菌用成体培地と同じ組成の／Ｉｌｌ熱滅菌し
た液体培地５００ｍ７Ｉを入れた２１坂ロフラスコ４０
本に前記培養液をそれぞれ植菌し、２８℃で４８時間振
盪培養した。培養路ｆ後、培養液を遠心分離し゛（［１
体を得た。

次いで６．１ｍＭジチオスレイトールを含む帆０２Ｍリ
ン＋１３２カリ緩衝ｒ［ｆｆｉ　（ｐ）Ｉ　７．０　）
　８００ｍＪに菌体を懸濁後、超音波処理によりＫ　Ｐ
　Ｌ　ＩＪダクターゼを抽出し、遠心分離によって不溶
物り除去を行い、得られた上澄液台こまず６０％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを／Ｊｌｌ　、ｔ、生じた
沈澱物を遠心分離で除去したのち、その上澄液にさらに
硫酸アンモニウムを終濃度８０％飽和になるようをこ加
え、ＫＰＬリダクターゼを沈澱せしめた。得られた沈澱
物を６．１ｍＭジチオスレイトールを含む０．０２Ｍリ
ンリン酸カリ緩衝液　（ｐｌ（７，ｔ））１００ｍ／　
に溶解し、次いでこの溶解液を０．９ｍＭジチオスレイ
トールを含む０．０１　Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ！
７．４）で透析し、予め６．１ｍＭジチオスレイトール
を含むρ、ｇ１１ｖＩ）リン酸カリ緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−セファセルカラム（径５ｃｍ、長さ４０　Ｃ
ｆｆ１　）に通してＫＰＬ’Ｊダクターゼを吸収させ、
同緩衝液で洗浄したイ掟、同緩衝液とＱ、５１ＶＩＩの
塩化カリウムを溶解した同緩衝液とで濃度勾配を作り、
徐々に塩化カリウム濃度を上げなからＫＰＬリダクター
ゼお溶出させた。溶出されたＫ　Ｐ　Ｌ　リダクターゼ
活性票門を集め、７０〜１００％飽和硫葭アノモニウム
で沈澱してくるものを、Ｑ、１ｍＭジチオスレイトール
を含む０．０２ＭＪン酸カリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，０
）　５ｍｌに溶解し、さらにこの溶液に濃度が４Ｍとな
らように食塩を加えた。この溶液を０・１ｍＭジチオス
レイトール、０．０２１ＶＩ　リン［俊カリ緩イ鉗液（
ｐＨ７，ｏ）および４Ｍ食塩よりなる溶液で平衡化した
フェニルセファロースｃＬ−４Ｂカラム（径１ｃｍ、長
さｌＱｃｍ）をこ通Ｌ’ＣＫＰＬリダクタ−ゼを吸着さ
せ、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液（４Ｍ食塩〕と食
塩を含まない同緩衝液とで濃度勾配を作り、徐々に食塩
濃度を丁げながら、ＫＰ　Ｌ　リダクターゼを溶出させ
た。溶出されたＫＰＬリダクターゼ活性画分を集め、９
０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱しでくうモ／）ｔ−２
ｍｌ　ａ　０．１ｍＭジチオスレイトールを含む０．０
２Ｍ　リン酸カリ緩衝液（ｐｆ（７，０）に溶解Ｌ１同
緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−７５カラムにて
ゲルが過を行い、Ｋ　Ｐ　Ｌ　ＩＪダクターゼ活性画分
を集め、９０に飽４ｕ硫岐アン七ニウムで沈澱しＣくろ
ものを１ｍｌの０．１ｍＭジチオ７、Ｌ／イトールと０
．０２Ｍのリン１収〃り緩衝液（Ｐｌ（７，０）に溶解
し、さらにポリエチレングリコールを添加して一夜放置
し、氏Ｐ　Ｌ　’Ｊタクターゼを結晶化させた。生成し
た結晶を遠心分離にて回収し、Ｋ　Ｐ　Ｌ　リダクター
ゼ標品５１ｎｇを得た。このものの比活゛注は１７５Ｌ
Ｉ／ｍｇ。

培養液からの収率は１４．６％であった。至ｊａ　ｐＨ
は７．０〜７．５であり、ｐＨ安安住性６．０〜８．０
゜熱安定゛ばは３０℃以Ｆ％ＫＰＪ６よびＮＡＤＰＩ（
に対するＫｍ値はそれぞれ０−８０　ｍＭ　、０．１２
　ｍ　Ｍであった。

実施例２ アグロバクテリウム・ツメファシェンスＩＦ０１８２６
４　）１　白金Ｊｌｌ−クルコース５％、コーンスチー
プリツ力−３％、炭酸カルシウム１％からな噂ｐＨ７，
０に調整、〃■熱滅菌した液体培地５ｍｌ。

３本に植菌Ｌ２Ｂ℃で４８時間培養した。次にこの培養
液を種菌用液体培地と同じ組成の〃■熱滅菌した液体培
地５００ｍＪを入れた２１坂ロフラスコ４０本にそれぞ
れ植菌し、２８℃で４８時間振盪培養した。培養終了後
遠心分離により得られた菌・体を実施例１と同様に処理
してＫＰＬリダクターゼ標品６ｍｇを得た。

このものの比活°注は１８１Ｕ／ｍｇ　、培養液からの
収率は１３．４％であり、その他の酵素的性質は実施例
１の場合とほぼ同等であった。

実施例３ 実施例１で示した培地５００ｍＡでアスペルギルス・ニ
ガーＩ　Ｆ　０４８４８を２日間培養して得られた培養
液４０本より濾過により得られた菌体を０．１ｍ１Ｖｉ
ジチオスレイトールを含む０．０２　Ｍ　リン酸カリ緩
衝液（ｐＨ７，０）（３ＱＱ＋ａｌに懸濁後、ガラスピ
ーズ処理をこより菌体を破砕し、遠心分離をこよって不
溶物の１余去を行ない、」コ使液を得た。この上澄液を
実施例１と同様の方法で処理しＫ　Ｐ　Ｌ　リダクター
ゼ標品７ｍｇを得た。

このものの比活性は１７２Ｕ／ｍｇ　、培養液からの収
率は２１．０％であり、その他の酵素的性質は実施しｉ
ｌｌの場合とほぼ同等であった。

実施例４゜ 弔１表に示した各種の酵母を用いろことおよびｂ用す５
坂ロフラスコが１本であること以外は実施例１と同様な
方法で培養、集菌した菌体を０．１ｍＭジチオスレイト
ールを含む０．０２Ｍ　リンｉｆ　’Ｊ）り緩衝液（ｐ
”　’ｉ、０　）　２０ｒｎｌに懸濁後、超音波処理、
遠心分離により上澄液を得た。このようにして得られた
各」二澄液の蛋白含有Ｑ、ＫＰＬＪダクターセ宿注およ
び生成バントラクトンのＤ体比率を測定し第１表に示す
。

なお、上記上澄液を実施例１と同様にしてＤＥＡＥセフ
ァセルの段階まで部分精製することにより、実施′ＶＡ
１で得られたＫＰＬ＋）ダクターゼとほぼ同等の酵素的
゛性質を有するＫ　Ｐ　Ｌ　１７ダクターゼ、傭単離す
ることができた。

第１表 生　産　函　比活性（ｔＪ／ｉｎｇ蛋白）　Ｄ（％うと
および使用する坂ロフラスコが１本であること以外は実
施例２と同様な方法で培養、集菌した菌体を０．１ｍＭ
ジチオスレイトールを含む０．０２　Ｍリン酸カリ緩衝
ｒｌｆｆｉ（ｐｉ（７，０）　２０ｍ１に懸濁後、鵠音
波処理、遠心分離により上澄液を得た。このようにして
得られた上？を液の蛋白含有ｉ、ＫＰＬリタクターゼ活
性および生成バントラクトンのＤ体比率をｌＩＩ！Ｉ建
り第２表を得た。

なお、上記上澄液を実施例１と同様にＤＥＡＥセファセ
ルの段階まで部分精製すやことにより、実施ｌ＋ｌｌｌ
で得られたＫ　Ｐ　Ｌ　ＩＪダクターゼとほぼ同等の酵
素的性質を有するＫＰＬ＋７ダクターゼを単離すること
かでさた。

第２表 生　産　菌　比活性ＣＵ／ｍｇ蛋白）　ＩＪ（％）ＩＦ
Ｏ１２６５５０，０８２９６，６ 実施例６ 第３表をこ示した各種のカビを用いろことおよび１史用
する坂ロフラスコが１本であること以外は実施例３と同
様な方法で集菌培養した菌体をＱ、ｌｌｎＭジチオスレ
イト−Ｉしを含む０．０２Ｍ　リン酸カリ緩衝ｒｌＥ　
（ｐ　ｋ４７．ｏ　）　ｚｏｍｉ　ｈこ懸濁後、ガラス
ピーズ処理により菌体を破砕し、遠心分離によって不溶
物の除去を行ない上澄液を得た。このようにしＣ得られ
た各上纜欣の蛋白含有ｉｉ、　Ｋ　Ｐ　Ｌ　’Ｊダクタ
ーゼ活性および生成バントラクトンのＤ体比率を測定し
弔３表を得た。

なお、上記り澄液を実施Ｉ！／ＩＪｌと同様に１）［Ａ
Ｅセノアセルの段階まで部分＃Ｒすることにより、実施
例１でイカられたＫＰＬ！Ｊダクターゼとほぼ同等の酵
素的性貞を有す６ＫＰＬＩＪダクターゼを単離すること
ができた。

弔３表 生　産　菌　比活性（Ｕ／ｍｇ蛋白）Ｌ）（％９リゾツ
ブス・オリザエ １Ｆ’０　５４Ｉ４０　０−１６８　９６．８出題人製
鉄化学工梨株式会社 代表者　佐々本　浩 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号手続補正
書く自発） 昭和５９年４月ｌｂ日 ２　発明の名称　ケトパントラクトンリダクターゼの製
造方法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 （置０７９４−３７−２１５１１ ４、　補正の対象　明ａ書 ５、補正の内容 （１）明細書第４頁第６行を以下のとおり補正づる。

「ｅＸｔｒａＣｔの段階において０．００９ｕｎ　ｉｍ
ｇ蛋白どかな」 度 反 口 定 ［（ 「【

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　リソーフス属、アスベｌレギルス属、ビソクラ
   ミス属、オーレオバシジクム属、シゾサツ力ロマイセヌ
   ）／４．　ビチア属、ハンセヌラ属、エンドマイコブシ
   ス属、シテロマイセス属、デバリオマイセヌ属、スポロ
   ポロマイセス属、トルロプシス属。 キャンデイダ）Ｉ４　、ロドトルラ属、トリコスポロン
   属、アグロバクテリウム属、エアロバクター属。 アクロモバクタ−属、フラボバクテリウム属、スタフィ
   ロコッカス属、ミクロコツカス属、アルスロバクタ−属
   、セラチア属、ブレビバクテリウム属、アシネトバクタ
   −属、シュードモナス属、午サントモナス属に属するケ
   トパントラクト／リダクターゼ生産菌を栄養培地で培養
   して菌体内をこケトパントラクトンリダクターゼを蓄積
   せしめ、該菌体からケトパントラクトンリダクターゼを
   採取することを特徴とするケトパントラクトンリダクタ
   −ゼの製造方法。