CN108102926A - 高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株bfa010-7及其在制备d-泛解酸内酯中的应用 - Google Patents

高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株bfa010-7及其在制备d-泛解酸内酯中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种经土壤筛选和低温等离子体诱变所获得的高产D‑泛解酸内酯酶的黑霉菌BFA010‑7，保藏编号为CGMCC 14631，以及上述黑曲霉菌株BFA010‑7在制备D‑泛解酸内酯中的应用。本发明中，黑曲霉菌丝体通过包埋方式在海绵块中生长繁殖，然后通过化学交联法制备获得固定化细胞催化剂，整个工艺简便易行、廉价实用、易于放大。制备所得的固定化细胞催化剂具有活性高、操作稳定性好以及易于分离回收等优点，在D‑泛酸钙工业生产过程中具有很好的应用前景。

Description

高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7及其在制备D-泛 解酸内酯中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体的涉及一种D-泛解酸内酯酶高产菌株的土壤筛选和诱变育种，诱变菌株的发酵培养和细胞固定化，以及固定化细胞在生物水解制备光学活性D-泛解酸内酯中的应用。
背景技术
D-泛解酸内酯是合成D-泛醇、D-泛酸和D-泛酸钙的重要手性中间体。采用D-泛解酸内酯酶优先催化外消旋底物中D-泛解酸内酯的水解，收集水解所得的D-泛解酸，经酸化和加热即可转变成高光学纯度的D-泛解酸内酯。具有高活性、高选择性与高稳定性的D-内酯水解酶催化剂，是高效、低成本地生产D-泛解酸内酯及其衍生产品的核心技术要素。
在现有的科技论文和专利文献中，公开了大量表达D-泛解酸内酯酶的微生物菌株(例如CN100351369C,CN102229894B)，其中高产D- 泛解酸内酯酶的微生物菌株分别属于镰孢霉菌、赤霉菌、泡盛曲霉以及番茄织球壳菌，这些微生物大部分都是植物致病菌，用这些菌株进行D-泛解酸内酯酶的发酵生产及催化反应不利于环境保护和人身安全。黑曲霉是国际公认的安全无害的微生物，已经广泛应用于生物饲料添加剂的生产，并可作为有益微生物直接用于饲料中。专利CN 100351369C中，虽然提及一些黑曲霉也能催化泛解酸内酯的水解，在相应的显色平板上产生显色圈，但是由于没有对黑曲霉进行进一步诱变育种，该专利中所公开的那些黑曲霉菌株的产酶活力并不高。如果对土壤分离的黑曲霉菌株进行大规模诱变和筛选，有可能获得生物安全而且高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉菌株。
迄今已报道的高产D-泛解酸内酯酶的微生物菌株大多是产菌丝体的真菌。反应器中菌丝体的生长对搅拌产生的剪切力比较敏感，如果搅拌转速过高，不仅会造成菌丝体断裂，严重影响菌丝体的过滤分离过程，而且酶的产量也会受到严重影响(江南大学硕士学位论文，微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯，2001年)。由于菌丝体细胞本身很容易通过过滤等方式进行分离，在发酵液中直接加入戊二醛，对菌丝体细胞以及胞内的酶进行交联固定化是一种快速高效的固定化方法，制备所得的固定化细胞具有稳定性高、易于分离的优点(Enzyme and Microbial Technology,2004,35:161–166)。尽管如此，固定化菌丝体细胞在应用时，反应液粘度高、传质差，并且在长时间使用后，由于菌丝体的断裂，会导致固定化细胞的分离回收困难。专利CN 101343627A公开了串珠镰孢霉菌固体发酵生产D-泛解酸内酯酶的方法，解决了液体发酵过程中搅拌剪切力对菌丝体的影响，但该专利未公开菌丝体细胞的固定化方法。江苏省农科院报道了采用海绵对香菇菌丝体进行固定化培养的方法(食用菌，2001(1)：8-9)，如果将这种方法应用于D-泛解酸内酯酶的发酵生产中，菌丝体生长在海绵块的内部，可以有效地避免搅拌剪切力对菌丝体生长的影响，降低发酵液和反应液的粘度，有利于强化传质并且简化细胞的分离。
发明内容
1、发明目的。
本发明提供了一种生物安全且高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉菌株；进一步通过海绵固定化培养的方式，避免菌丝体与搅拌桨的直接接触，消除剪切力对丝状微生物生长的不利影响。
2、本发明所采用的技术方案。
本发明采用的技术方案之一：泛解酸内酯酶产生菌种的筛选
土壤样本的采集：在上海、江苏、浙江、山东、广西等省市的不同地点和环境中采集土样，在以泛解酸内酯为唯一碳源的富集培养基中进行富集，然后取适量菌液涂布于含有碳酸钙和泛解酸内酯的PDA 固体培养基平板上进行培养，分离呈现明显透明圈的黑曲霉菌株。将分离获得的黑曲霉菌株分别接种到液体丰富培养基中进行培养，比较 D-泛解酸内酯酶的发酵活力以及立体选择性，获得高活性和高选择性 D-泛解酸内酯酶的产生菌株，命名为黑曲霉BFA010。对筛选的菌株进行了ITS序列的分子鉴定，结合微生物生长形态特征，确实属于黑曲霉。
所述D-泛解酸内酯酶发酵活力的测定方法为：
将分离筛选所得的黑曲霉菌株分别接种到装有25ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、200rpm振摇培养2天，取2ml 菌液转接到装有25ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、 200rpm继续振摇培养2天，取10ml菌液，抽滤除去培养基，将滤饼加到10ml含2％(w/v)泛解酸内酯的磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.5) 中，30℃，磁力搅拌反应，通过全自动滴定仪滴加0.1M NaOH溶液，控制反应液的pH恒定于6.5附近，持续反应10min，根据滴加的碱液体积计算发酵液中的D-泛解酸内酯酶的活力。
D-泛解酸内酯酶的活力单位(U)定义为：上述反应条件下，每分钟催化1.0μmol泛解酸内酯水解所需要的酶量。
D-泛解酸内酯酶的发酵活力计算公式为，发酵活力(U/L)＝ VNaOH×1000，其中VNaOH是反应10min时滴加碱液的体积(ml)。
所述D-泛解酸内酯酶的立体选择性检测方法为：取0.5ml上述发酵活力测定反应液，加入等体积乙酸乙酯进行萃取，离心分离，弃去有机相萃取液，再次加入等体积乙酸乙酯进行萃取，如此重复4次。向萃取残余水相中加入0.2ml的硫酸溶液(20％,w/v)，80℃保温30 min，使酶促水解产物D-泛解酸内酯化生成D-泛解酸内酯，反应液冷却后再次加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取。萃取液中加入无水硫酸镁干燥，然后通过气相色谱分析D-泛解酸内酯的光学纯度。
本发明采用的技术方案之二：黑曲霉BFA010的等离子体诱变育种
将土壤分离筛选所获得的黑曲霉菌株BFA010接种于斜面固体培养基上，待孢子长好后，向斜面试管中加入无菌水，使用接种环将斜面孢子刮到无菌水中。将孢子悬浮液适当稀释后置于等离子体发生仪箱体中，进行等离子诱变处理。选择高纯氦气作为等离子体的工作气体，照射的功率为40W，照射距离为4mm，等离子体的温度<30℃，气体流量10L/min，处理菌液10μL，处理时间为40s。
将诱变处理的孢子悬浮液涂布到含有D-泛解酸内酯和碳酸钙的固体丰富培养基平板上进行培养，挑选具有显著透明圈的菌落，接种到液体丰富培养基中培养，对D-泛解酸内酯酶的发酵产量进行比较，选择发酵活力较高，而对映选择性没有下降的8株突变株作为下一轮诱变的出发菌株，如此多轮反复诱变，筛选获得D-泛解酸内酯酶产量显著提高的突变黑曲霉菌株BFA010-7，其D-泛解酸内酯酶的发酵产量是母本菌株的11.7倍。
黑曲霉突变菌株BFA010-7已专利保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC NO. 14631，保藏时间为2017年11月03 日。
所述黑曲霉突变菌株BFA010-7(即黑曲霉CGMCC 14631)具有如下形态特征：
在PDA培养基上，菌落生长较快，30℃培养3天，菌落直径超过25mm，菌落外缘整齐，表面呈黑色，细粉状，菌落中心菌丝致密突起，菌落底部中心呈白色，四周为淡黄色。
对该菌株的ITS 1和ITS 4序列进行测序，测得的ITS 1和ITS 4 核酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
本发明采用的技术方案之三：黑曲霉菌株BFA010-7的固定化培养与菌丝体化学交联
将黑曲霉菌株BFA010-7接种到固体斜面培养基表面，30℃培养2天，用无菌水将黑曲霉孢子洗下，接种到液体培养基中，振摇培养 24h。将培养的种子培养液按1～5％的比例接种到含有海绵块的无菌发酵培养基中，在较低振摇频率下培养一段时间，使接种的黑曲霉菌丝体被吸附到海绵块表面和内部，然后提高振摇频率，在充分供氧条件下继续培养一段时间，实现D-泛解酸内酯酶的高产。
放大培养在机械搅拌发酵罐或气升式发酵罐中进行。使用机械搅拌发酵罐时，将培养的种子培养液按1～5％的比例接种到含有海绵块的无菌发酵培养基中，在较低搅拌转速下培养一段时间，使接种的黑曲霉菌丝体被吸附到海绵块表面和内部，然后提高搅拌转速，在充分供氧条件下继续培养，间歇进行发酵活力测定。使用气升式发酵罐时，将培养的种子培养液按1～5％的比例接种到含有海绵块的无菌发酵培养基中，在一定的通气条件下培养，接种的黑曲霉菌丝体首先被吸附到海绵块表面和内部，然后在海绵块内部增殖，大量表达目标D- 泛解酸内酯酶。
在本发明所述的海绵固定化培养条件下，黑曲霉菌丝体生长在海绵块的内部或表面，因此剪切力对菌丝体生长的影响很小。与搅拌式反应器相比，在气升式发酵罐中进行发酵培养更好地避免了搅拌剪切对细胞生长的影响，不会造成菌丝体的断裂，进而影响细胞的生长；另一方面，发酵过程中，发酵液中几乎没有游离的菌丝体，培养液的粘度小，氧气传质良好，供氧充分，酶的发酵产量高，并且发酵规模放大简便，更容易实现工业化应用。而且菌丝体细胞生长在海绵粒内部，因此制备所得的固定化细胞在用于催化反应时粘度小，传质容易，催化剂分离简便。
发酵培养结束后，在培养液中加入戊二醛，对海绵块中生长的菌丝体细胞进行化学交联，充分洗涤后得到高活性与稳定性的海绵包埋固定化细胞。
本发明采用的技术方案之四：海绵包埋固定化细胞的应用方法
将本发明技术方案之三中获得的海绵包埋固定化细胞加到外消旋泛解酸内酯的水溶液中，机械搅拌混合，恒温反应，外消旋泛解酸内酯即等量的D-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯的混合物；固定化细胞优先催化D-泛解酸内酯的酶促水解，在反应过程中，随着D-泛解酸内酯的水解生成D-泛解酸，反应液的pH逐渐下降，滴加碱液维持反应液pH恒定，依据消耗的碱液体积估算反应的转化率。当反应转化率达到预定值时，终止反应，过滤回收固定化细胞。回收的固定化细胞直接加到新鲜的外消旋泛解酸内酯的水溶液中，重复使用。固定化细胞的对映选择率(E)高于200，活力半衰期超过200次。
在澄清的反应滤液中加入水不溶性有机溶剂进行萃取，除去未反应的L-泛解酸内酯和剩余的D-泛解酸内酯，然后对萃余水相溶液进行酸化、加热，使水解产物D-泛解酸转化为D-泛解酸内酯，然后再次进行萃取，对获得的萃取液进行减压蒸馏除去溶剂，即可得到高纯度的D-泛解酸内酯，产物光学纯度高于99％，无需重结晶即可应用于后续D-泛酸钙或D-泛醇的制备。
其中，对映选择率(E)是表征生物催化剂对映选择性的重要参数，其计算公式为：
E＝ln[1-c×(1+eep)]/ln[1-c×(1-eep)]，
其中，c是反应的转化率；eep是水解产物D-泛解酸的光学纯度。
本发明采用的技术方案之五：固定化细胞活力的复活培养再生
技术方案四中，当固定化细胞的活力下降时，优选的，当固定化细胞的活力衰减到一半左右时，过滤回收固定化细胞，充分洗涤除去残留的泛解酸及泛解酸内酯，然后将固定化细胞重新加到发酵培养基中进行培养，细胞中的孢子体可以再次萌发增殖，使得固定化细胞的活性得到一定程度的恢复，延长固定化细胞的使用寿命。
3、本发明所产生的技术效果。
(1)本发明的黑曲霉菌株BFA010-7生物安全且高产D-泛解酸内酯酶，黑曲霉菌丝体细胞通过包埋方式在海绵块中生长，进而通过化学交联法制备获得固定化细胞，该技术简便易行，容易放大。采用这种技术制备所得的固定化细胞不受搅拌剪切力的影响，具有非常高的操作稳定性，在反应过程中传质速度快，反应速率高；反应结束后，固定化细胞与反应液的分离也十分简便快速，有利于缩短生产周期，降低D-泛解酸内酯的生产成本。当固定化细胞活性衰减到一半左右时，过滤回收固定化细胞，充分洗涤除去残留的泛解酸及泛解酸内酯，然后将固定化细胞重新加到发酵培养基中进行培养，细胞中的孢子体可以再次萌发增殖，使得固定化细胞的活性得到一定程度的恢复，延长固定化细胞的使用寿命。
附图说明
图1为消旋泛解酸内酯的气相色谱图。
图2为D-泛解酸内酯的气相色谱图。
图中的L-泛内酯系L-泛解酸内酯的简称，D-泛内酯系D-泛解酸内酯的简称。
具体实施方式
本发明使用的海绵，购自南京康普塑业有限公司，材质：PU海绵，密度27g/dm3。
实施例1 黑曲霉菌株BFA010的分离、筛选及鉴定
在上海、江苏、浙江、山东、广西等省市的不同地点和环境中采集土样200余份，土样采集时，铲去表层土壤，采集深层土样，采集的土样在10天内应用，进行D-泛解酸内酯酶生产菌种的筛选。
取约100mg土样，加到3ml富集培养基中，30℃、200rpm，振摇培养3天，采用液相色谱分析法对富集培养液进行酶促水解产物泛解酸的检测，保留有显著泛解酸生成的富集培养液，取100μl菌液涂布于含有碳酸钙和泛解酸内酯的PDA固体培养基平板上，30℃培养3天，分离呈现明显透明圈的黑曲霉菌株。将筛选分离的黑曲霉菌种分别接种到装有25ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、 200rpm振摇培养2天，取2ml菌液转接到装有25ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、200rpm继续振摇培养2天，取10ml 菌液，抽滤除去培养基，将菌丝体滤饼加到10ml含2％(w/v)泛解酸内酯的磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.5)中，30℃，磁力搅拌反应，通过滴加0.1M的NaOH，控制反应液pH恒定为6.5，反应10min，根据滴加的碱液体积计算发酵液中的D-泛解酸内酯酶的活力。
其中液相色谱分析条件为：使用Shim-pak CLC-ODS柱(250×4.6 mm,5μm)，流动相为：10％(v/v)的乙腈水溶液，含有0.018M的磷酸二氢钾(预先用1.0M的HCl调节pH至3.0)；流速0.8ml/min，恒温30℃，紫外检测，检测波长为215nm。泛解酸和泛解酸内酯的出峰时间分别为7.1min和9.8min。
发酵活力测定结束后，取0.5ml活力测定反应液，加入等体积乙酸乙酯进行萃取，分离弃去有机相萃取液，再次加入等体积乙酸乙酯进行萃取，如此重复4次。向萃取残余水相中加入0.2ml的硫酸溶液 (20％,w/v)，80℃保温30min，使酶促水解产物D-泛解酸内酯化生成D-泛解酸内酯，反应液冷却后再次加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取。萃取液中加入无水硫酸镁干燥，然后通过气相色谱分析D-泛解酸内酯的光学纯度，使用的色谱柱为：CP-Chirasil-Dex CB，分析条件为：进样器280℃，检测器280℃，采用程序升温：初始柱温100℃，维持8min，然后按20℃/min的速率升温至160℃，再维持5min。L- 泛解酸内酯和D-泛解酸内酯的出峰时间分别为11.64min和11.89min，见附图1。
其中，富集培养基配方：泛内酯5g/L，NH4Cl 2g/L，K2HPO42g/L， MgSO4 0.5g/L，NaCl 1.0g/L，pH 7.0；
PDA固体培养基配方：去皮土豆200g/L，煮汁，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L；在PDA固体培养基配方的基础上，额外加入5g/L的 CaCO3，121℃灭菌20min，冷却到50℃后加入过滤除菌的泛解酸内酯溶液，泛解酸内酯的终浓度为20g/L，混匀后铺制平板，得到含有碳酸钙和泛解酸内酯的PDA固体培养基平板；
液体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，pH 7.0。
通过筛选，获得一株高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉，编号为 BFA010，其摇瓶发酵活力为10.3U/L，酶促水解产物D-泛解酸的光学纯度高于99％。
实施例2 黑曲霉菌种种属的分子鉴定
采用二次沉淀法提取黑曲霉BFA010的基因组DNA。将实施例1 中获得的黑曲霉BFA010接种到液体丰富培养基中培养2天，离心收集菌丝体，用去离子水洗涤2次，吸干水份。取1g菌丝体转移到已经预冷的研钵中，加入液氮冷冻，用研杵研磨成细粉。将菌丝体粉末快速转移到20ml的离心管中，加入10mlSDS-EB缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，4％SDS，pH 8.0)，涡旋震荡混合均匀。混合液在65℃水浴保温20min，10000rpm离心15min。取8ml上清液转移至新的离心管中，加入0.5ml醋酸钾缓冲液(8M,pH 4.2)，混匀后冰浴45min，4℃下10000rpm离心20min，取上清液移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，小心颠倒混匀。静置5min后，轻轻倒去上清，小心地挑取DNA的絮状沉淀转移到1.5ml的Eppendorf 管中，分别用70％的乙醇和无水乙醇浸泡、洗涤沉淀，倒掉洗涤液， Eppendorf管倒置，自然干燥。将干燥的基因组DNA溶解于750TE 缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.0)中，备用。
设计引物，对黑曲霉BFA010的基因组DNA进行PCR扩增，获得该菌株的ITS序列DNA片段。
上游引物，SEQ ID No.3：5’-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
下游引物，SEQ ID No.4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH2O 19 μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行30次如下循环： 94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分钟；最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。对回收的DNA片段进行序列测定，对测序结果进行分析，得到的ITS1和ITS4的核酸序列分别如序列表中SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。在BLAST数据库中进行序列比对，与SEQ ID No.1同源性最高的序列分别来源于Aspergillus niger和Aspergillus tubingensis，一致性为100％；而与SEQID No.2 同源性最高的序列来源于Aspergillus niger，一致性为99％，仅有一个核苷酸的差异。结果证实筛选获得的菌株BFA010确实属于黑曲霉种属。
实施例3 黑曲霉BFA010的等离子体诱变选育
将黑曲霉BFA010接种到固体培养基斜面上，30℃培养48h。向斜面固体培养基上加入1ml无菌水，用接种环将黑曲霉的孢子刮到无菌水中。将孢子悬浮液稀释至约107孢子/ml悬浮液，置于等离子体箱中，进行诱变。工作气体为高纯度氦气，照射的功率为40W，照射距离为4mm，等离子体的温度<30℃，气体流量10L/min，处理菌液10μL，处理时间为40s。
将诱变处理的孢子悬浮液涂布到含有20g/L泛解酸内酯和5g/L 碳酸钙的固体丰富培养基平板上，30℃培养48h，挑选具有显著透明圈的菌落。按照实施例1所述的方法，将分离的黑曲霉接到液体丰富培养基中进行发酵培养，每个菌株做5个平行对照，测定发酵液中 D-泛解酸内酯酶的发酵活力以及酶的立体选择性。对诱变菌种的发酵活力进行比较，选择酶的立体选择性没有下降，而发酵活力最高的8 个突变株作为下一轮诱变的出发菌株。如此重复诱变、筛选。
其中，斜面固体培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L，琼脂1.5％，pH7.0；
固体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，琼脂1.5％，pH7.0；
液体丰富培养基：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl 1.0g/L，MgSO40.5g/L，pH 7.0。
通过10轮的迭代诱变、筛选，获得一株D-泛解酸内酯酶产量显著提高的突变菌株BFA010-7，酶的摇瓶发酵产量达到120.5U/L，是母本菌株的11.7倍，并且该菌株所产D-泛解酸内酯酶的酶促水解产物D-泛解酸的光学纯度仍然高于99％。突变菌株BFA010-7已经保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC NO. 14631，保藏时间为2017年11月03日。
实施例4 黑曲霉菌株BFA010-7的摇瓶培养
液体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，pH 7.0。
将购买的海绵，切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，加到液体丰富培养基中，培养基中海绵的体积密度为50cm3/L，115℃灭菌 30min，冷却备用。
将黑曲霉菌株BFA010-7接种到斜面固体培养基表面，30℃培养 2天，向试管斜面中加入1ml无菌水，用接种环将黑曲霉的孢子刮到无菌水中，按2％的接种量接种到装有25ml液体丰富培养基的250ml 三角烧瓶中，30℃、200rpm振摇培养24h。将培养的种子液按1％的接种量接种到装有25ml含有海绵块的无菌发酵培养基的250ml 三角烧瓶中，30℃、150rpm振摇培养6h，然后将振摇频率提高到 200rpm，在30℃继续振摇培养48h，发酵活力为82U/L。
实施例5 黑曲霉菌株BFA010-7的摇瓶培养
液体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，pH 7.0。
将购买的海绵，切割成0.3cm×0.3cm×0.3cm的小块，加到液体丰富培养基中，培养基中海绵的体积密度为300cm3/L，115℃灭菌30min，冷却备用。
将D-泛解酸内酯酶高产菌株黑曲霉菌株BFA010-7接种到斜面固体培养基表面，30℃培养2天，向试管斜面中加入1ml无菌水，用接种环将黑曲霉的孢子刮到无菌水中，按5％的接种量接种到装有25 ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，25℃、200rpm振摇培养24h。将培养的种子液按5％的接种量接种到装有25ml含有海绵块的无菌发酵培养基的250ml三角烧瓶中，25℃、150rpm振摇培养6h，然后将振摇频率提高到200rpm，在25℃继续振摇培养48h，发酵活力为157U/L。
实施例6 黑曲霉菌株BFA010-7的摇瓶培养
液体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，pH 7.0。
将购买的海绵，切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，加到液体丰富培养基中，培养基中海绵的体积密度为500cm3/L，115℃灭菌30min，冷却备用。
将D-泛解酸内酯酶高产菌株黑曲霉菌株BFA010-7接种到斜面固体培养基表面，30℃培养2天，向试管斜面中加入1ml无菌水，用接种环将黑曲霉的孢子刮到无菌水中，按5％的接种量接种到装有25 ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，35℃、200rpm振摇培养24h。将培养的种子液按5％的接种量接种到装有25ml含有海绵块的无菌发酵培养基的250ml三角烧瓶中，35℃、150rpm振摇培养6h，然后将振摇频率提高到200rpm，在35℃继续振摇培养48h，发酵活力为107U/L。
实施例7 黑曲霉菌株BFA010-7的机械搅拌发酵罐培养
液体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L， NaCl 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，pH 7.0。
将购买的海绵，切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，加到液体丰富培养基中，培养基中海绵的体积密度为300cm3/L，115℃灭菌30min，冷却备用。
将D-泛解酸内酯酶高产菌株黑曲霉菌株BFA010-7接种到斜面固体培养基表面，30℃培养2天，向试管斜面中加入1ml无菌水，用接种环将黑曲霉的孢子刮到无菌水中，接种到装有50ml液体丰富培养基的500ml三角烧瓶中，30℃、200rpm振摇培养24h。将150ml 种子液接种到装有3L含有海绵块的液体丰富培养基的5L-机械搅拌发酵罐中，培养温度30℃，初始通气量为1vvm，初始搅拌转速为 200rpm，培养12h后将搅拌转速提高至400rpm，继续培养48h，发酵活力为2237U/L。
实施例8 黑曲霉菌株BFA010-7的气升式发酵罐培养
使用气升式发酵罐进行黑曲霉菌株BFA010-7的发酵培养。使用的发酵罐型号为10QS-30，购自上海保兴生物设备工程有限公司，筒体直径20cm，高1000cm，导流筒直径15cm。
液体丰富培养基配方：甘油20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏7.5g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，pH 7.0。
将购买的海绵，切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，加到液体丰富培养基中，培养基中海绵的体积密度为300cm3/L，115℃灭菌30min，冷却备用。
将D-泛解酸内酯酶高产菌株黑曲霉菌株BFA010-7接种到斜面固体培养基表面，30℃培养2天，向试管斜面中加入1ml无菌水，用接种环将黑曲霉的孢子刮到无菌水中，接种到装有100ml液体丰富培养基的1000ml三角烧瓶中，30℃、200rpm振摇培养24h。将1000 ml种子液接种到装有20L含有海绵块的液体丰富培养基的30L-气升式发酵罐中，培养温度30℃，初始通气量为1vvm，培养12h后将通气量提高至1.5vvm，继续培养48h，发酵活力达到2605U/L。
实施例9 黑曲霉菌丝体的化学交联固定化
在实施例8的发酵液中，无须分离，直接加入80ml浓度为50％ (w/v)的戊二醛溶液，30℃、通气0.5vvm进行混合，交联反应1h。反应结束后，纱布过滤除去发酵液，用自来水多次洗涤，除去未反应的戊二醛，然后挤干去除多余的水分，得到海绵包埋交联固定化细胞920g。固定化细胞的比活力约51U/g固定化细胞。
实施例10 固定化细胞催化拆分制备D-泛解酸内酯
称取800g如实施例9所述的固定化细胞，加到10L含有3kg 消旋泛解酸内酯的水溶液中，30℃、200rpm，机械搅拌反应，间歇取样检测反应转化率。反应2.5h后，转化率为35.1％。反应液过滤除去固定化细胞，滤液中加入10L乙酸乙酯萃取，萃取液分层，取下层水相溶液，再次加入10L乙酸乙酯萃取，如此重复5次，在萃余的水相溶液中加入硫酸至pH低于2，80℃加热1h，待冷却后，再次使用10L乙酸乙酯萃取，重复4次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，得到1.01kg D-泛解酸内酯，收率33.7％，产品的比旋光度[α]20(水，c＝1.0)为-50.5。
实施例11 D-泛解酸内酯的光学纯度检测
分别称取10mg消旋泛解酸内酯和实施例10制备的D-泛解酸内酯，溶解于1ml乙酸乙酯中，然后再分别取0.1ml溶液，稀释至1ml，进行气相色谱检测，分析D-泛解酸内酯的光学纯度(ee值)。
使用的色谱分析柱为：CP-Chirasil-Dex CB，分析条件为：进样器280℃，检测器280℃，采用程序升温：初始柱温100℃，维持8min，然后按20℃/min的速率升温至160℃，再维持5min。
D-泛解酸内酯的ee值的计算公式为：
ee＝(AD-酯-AL-酯)/(AD-酯+AL-酯)×100％
其中，AD-酯和AL-酯分别为气相色谱分析中，D-泛解酸内酯和L- 泛解酸内酯的峰面积。
附图1是消旋泛解酸内酯样品的色谱图，可以看出，L-泛解酸内酯和D-泛解酸内酯分离比较完全，出峰时间分别为11.64min和11.89 min。附图2是D-泛解酸内酯样品的色谱图，对L-泛解酸内酯和D- 泛解酸内酯的峰面积进行积分，分别为10888和2428717，计算得到 D-泛解酸内酯的光学纯度(ee值)为99.1％。
结合实施例10的反应转化率数值，计算得知本发明中固定化细胞的对映选择率(E)为426。
实施例12固定化细胞的重复使用
将800g实施例9的固定化细胞，加到10L含有3kg消旋泛解酸内酯的水溶液中，30℃、200rpm，机械搅拌反应。反应3h后，反应液抽滤，分离的固定化丝状真菌细胞加到新鲜的含有3kg消旋泛解酸内酯的10L水溶液中，再次反应，如此重复200次。每隔50 批反应，取样检测固定化细胞的活力，其结果如表1所示，重复使用 200次，固定化细胞的残余活力为51.6％。继续重复使用10次，固定化细胞的残余活力为48.0％。
表1固定化细胞重复使用的活力回收
实施例13固定化细胞的活力再生
如实施例12中，固定化细胞重复使用210次后，加到装有20L 无菌丰富培养基的1L搅拌反应釜中，30℃、300rpm搅拌培养48h，在培养液中加入80ml浓度为50％的戊二醛溶液进行交联，反应1h 后，过滤，用自来水充分洗涤，获得的固定化丝状真菌细胞充分挤压除去水分，得到固定化丝状真菌细胞781g，比活力42.7U/g。与实施例9的固定化细胞相比，再次培养的活力收率为81.5％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州百福安酶技术有限公司
<120> 高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7及其在制备D-泛解酸内酯中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 1
tgggatacgg actcgggtct ttgggccacc tcccatccgt gtctattata ccctgttgct 60
tcggcgggcc cgccgcttgt cggccgccgg 90
<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 2
tagggtgaat ggatcctacc tgatcgaggt cacctggaaa atggttggaa aacgtcggca 60
ggcgccggcc aatcctacag agcatgtgac aaagccccat acgctcgagg atcggacgcg 120
gtgccgccgc tgcctttcgg gcccgtcccc ccggagaggg ggacggcgac ccaacacaca 180
agccgggctt gagggcagca atgacgctcg gacaggcatg ccccccggaa taccaggggg 240
cgcaatgtgc gttcaaagac tcgatgattc actgaattct gcaattcaca ttagttatcg 300
catttcgctg cgttcttcat cgatgccgga accaagagat ccattgttga aagttttaac 360
tgattgcatt caatcaactc agactgcacg ctttcagaca gtgttcgtgt tggggtctcc 420
ggcgggcacg ggcccggggg g 441
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial)
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 4
tcctccgctt attgatatg 19

Claims (9)

1.一种高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7，其特征在于：该菌株已于2017年11月03日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 14631。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉菌株BFA010-7，其特征在于：该菌株的ITS 1和ITS 4序列的核酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述的黑曲霉菌株BFA010-7在制备D-泛解酸内酯中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：其步骤包括：
(1)细胞固定化培养：将权利要求1所述的黑曲霉菌株BFA010-7接种到含有海绵块的无菌培养液中进行培养；
(2)细胞化学交联：在步骤(1)的培养液中加入戊二醛进行丝状真菌细胞共价自交联，然后分离获得海绵包埋的固定化细胞；
(3)将步骤(2)的固定化细胞添加到外消旋泛解酸内酯的水溶液中，催化D-泛解酸内酯的水解反应，获得D-泛解酸；
(4)分离上述步骤(3)的反应液中的固定化细胞，固定化细胞可重复利用，使用有机溶剂萃取分离除去步骤(3)中未水解的D-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯；
(5)对上述步骤(4)中有机溶剂萃取剩余的水相溶液进行酸化处理，使步骤(1)中的水解产物D-泛解酸转化为D-泛解酸内酯，再用有机溶剂萃取得到目标产物D-泛解酸内酯。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，黑曲霉菌丝体生长在海绵块的内部和表面。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，无菌培养液中，海绵块的体积密度为50～500cm3/L，培养温度为25～35℃。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述固定化细胞的对映选择率高于200，重复使用的半衰期超过200批次。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：还包括步骤(6)：当固定化细胞的活力下降时，将固定化细胞再加到无菌培养液中进行复活增殖培养，实现固定化细胞的活力再生。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：还包括步骤(6)：当固定化细胞的活力低于原始固定化细胞活力的一半时，将固定化细胞再加到无菌培养液中进行复活增殖培养，实现固定化细胞的活力再生。
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