JPS60145099A - 異種タンパクの製法およびそれに使用するｄｎａベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分裂酵母シゾサツカロミセス・ボムベ（Ｓｃ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）
に異種（１＋ｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチドを
発現させる方法、それに有用なりＮＡベクター、および
それによって発現されたタンパク生成物に関する。

微生物中にポリペプチド生成物、普通はは乳動物のタン
パク、を高収量で発現さセることが通常の目的である遺
伝子工学分野においては、宿主生物の選択は重要である
。真核生物ザソヵロミセス°セレビシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（パン酵母
）についてはいくつかの（σＹ究が行われている。しか
し、他の真核微生物が異種タンパクを同様のレヘルであ
るいはより高いレヘルで発現できるか否かはこれまで知
られていない。分裂酵母シゾサツカロミセス・ボムベ （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ　ｐｏｍ
ｂｅ　）はシゾサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）と遠縁であるが関係のある唯一のも
ので、これら２つの属は生化学および生理学の多数の側
面において異ｔっている。このような相異点は、例えば
、異↓！１ｔタンパクを分解することができる異種のプ
ロテアーゼの星および／または性質の相異として反映さ
れることがある。また、これら酵母の属は、異種タンパ
クを修飾する酵母が異なっており、その異種タンパクに
は４０・異的な切断場所、スルフヒドリル・ブリツジ、
グリ：１シル化、アミノ末端修飾等の相違があり得る。

発現される特定の異種タンパクにより、このような特異
的な修飾が望ましかったり望ましくなかったりする。さ
らに、異なる酵母属は、異なったタンパクであって時と
して所望の異種タンパクから精製、除去することか他の
タンパクよりも困鍾であるものを含んでいることがある
。

また、あるー・定レベルでば、異種タンパクの存在が細
胞の生存性に悪影響を及ぼずことがあり、したがって、
どの酵母属が特定の目的とするタンパクにとり最も耐性
があるかを決定することが望まれる場合もある。分泌の
過程は酵母の属ごとに異なるので、その性質を利用する
ことができる。

例えば、１も定の異種クンバクはある属において他の属
に比してより高レベルで分泌されることがある。また、
ある属においては、望ましくないプロテアーゼやタンパ
ク修飾酵素が低レベルで分泌される反面、異種タンパク
は低レベルで分泌される。

最後に、酵母の属は温度や圧力が異なり、異なった媒体
中では成長速度すなわち収量が異なることがあり、その
結果生産の時間およびコストが影響を受けることがある
。したがって、性質上のこのような相違を利用するため
に、異μった真核生物中で外来タンパクを生産する方法
を提供することが望ましい。たいていの場合、性質上の
このような相違は先験的（土肛旦亘）には決めることは
できない。

したがって、分裂酵母シゾサツカロミセス・ボムベ（Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｌ＋ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ
　）　（以下ｒｓ。

ボムベ」と称する）中で異種タンパクを製造する方法を
提供することが本発明の目的の１つである。

Ｓ、ボムベ中に異種タンパクを発現させるのに有用なり
ＮＡヘクターを提供することが本発明の別の目的である
。

また、Ｓ、ボムベ・アルコール・デヒトロケーナーセ・
プロモータからなる１つＮＡ発発現ヘタター提供するこ
とが本発明の別の目的である。さらに本発明の目的は、
Ｓ２ボムへが生産する実質的に純粋な、グリコジル化さ
れていないヒトのα１−アンチトリプシンを提供するこ
とである。

本発明■は、酵母Ｓ、ボボム属中で異種タンパクを製造
する方法であって、Ｓ、ボＪ、へ・プロモータの遺伝暗
号を指定するセグメントを含むＤＮＡヘクターにより形
質転換された酵母、を培養する」二程を有し、該タンパ
クの発現が前記プロモータの調節下で行なわれる方法に
関する。このような・＼ククーをつ（るのに有用である
［）ＮＡ構造も提供される。１、冒こ、Ｓ、ボムベ・ア
ル二ｌ−ル・デヒトロゲナーセ・プｌ：Ｊモータと、Ｓ
、ボムへに形質転換されるヒトのα１−アンチトリプシ
ンの構造遺伝子を含むヘクターが構成される。この形質
転換体は実質的にグリ：Ｊノル化されていないタンパク
であっ−Ｃ１は乳動物性α１−アンチ１−リブシンの活
性を自するタンパクを生産する。このタンパクは実質的
に純粋な状態で単離できる。

Ｓ、ボムベ中で異種タンパクを発現させるためには、Ｓ
、ボムベに固有のプロモータの制御下で発現せしめるこ
とが望ましい。このようなプロモータは、プラスミドル
＾叶９０１から分離できる、Ｓ、ボムベＡＤＨを含む約
７００の塩基対５ｐｈｌ−Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントで
もよい。前記プラスミドは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ
）ほか、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８．１４３−
１４９１９８３）に開示されているもので、この開示は
その全体を参照として本明細書乙こ含める。他のＳ、ボ
ムベ・プロモータとしては、解抛系プロ千り、例えは、
トリオース・ホスフェート・イソメラーゼ、ホスホフル
ク１ヘ　キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼを挙げることができる。発現の
ために選択された異種タンパクはα１−アンチトリプシ
ン、即ちは乳動物の血液中に存在し、その明６′ωな主
な生理学的作用がエラスターセ（構造タンパクを加水分
解する強力なプロテアーゼ）を阻害するプロテアーゼ・
インヒビターである。α１−アンチトリプシンは他のセ
リン・プロテアーゼを阻害することもできる。血液中の
α、−アンナトリプシンの低濃度は、慢性閉塞性肺気腫
および乳児性肝硬変に関連していることがある。したか
って、α１−アンーｙ−トリプシン活性をイ１するタン
パクの製造は、α１−アンチ１〜リブシン欠乏性を治療
するのに、また月俸の炎ｊｎ性異常下で起る蒋１：１応
答（ごれによりσ、−アンナトリプシン濃度が人（１１
に増加舅る）の機構をＷ＋＋、Ｉ−＼るのに有用である
。

にＩ・のα１−Ｊ′ンーノートリソ°ソンの４０４１７
４本（１＋ｒｃ＋Ｉｏｍｉｎ＋＋ｎｔ　ｆｏｒｍ）につ
い°Ｃの遺伝子を図１に小ず。利用できるこのような遺
伝ｒ−を含む１．）　Ｎ　Ａフラグメン１−は、ソ°ラ
スミＩ１１八′１゛４から９六導することが（きる。Ｉ
Ｉ　Ａ　ｉ’　４の調製の概略を図３にボ４゜ １１△′１゛４を製造するために、中間ヘクターＣＩ／
１を利用する。図３を参照すると、針　９肛芦」士硫′
じＰＩＩＩ、Ｉモータ（ｌＬｌｂｅｒおよびＫａｖａｓ
ａｋｉ、　Ｊ。

Ｍｏ１ｅｃ、八ｐｐ１．　ＧｅｎｅＬ、＋　１　、４　
１　９−４　３　４　（１９８２）に記載）が、′Ｉ″
ＰＩ遺伝暗号指定区域内のＫｐｎｌ制限部位から、Ｂａ
１３Ｌエクソヌクレアーゼーし消化される。生したプラ
ント末端は、５”プラント末端Ｅｃｏ　Ｒ１アダプター
の添加によラフ１！ｃｏ１４ｑ着Ｏ：１；（ｓｔｉｃｋ
ｙ　ｅｎｄ）に転換される。配列へΔＴＴＣＡＴＧＧＡ
ＧＧＡＴＣＣを有する合成オリコ゛ヌクレオチド”・リ
ンカ−が、１ｉｃｏ　Ｒ１（”１着端に連結された後、
Ｂａｍ　ＩＩＩで消化される。生したＦ１）Ｉプｌコモ
ータを含むフラグメンＩ・をヘクターＣ１／１のＢａｍ
　Ｉ１１部位へ挿入してもよい。ｃ１／】の制限マツプ
１０４−１０９（１９７８））から、ρＪＩＩＢ２４Ｂ
のρＭＢ９配列を、ｌ１ｃｏ　Ｒ１によって部分消化す
ることにより除去することで調製することができる。次
に、Ｅｃｏ　Ｒ１消化ｐＢＲ３２２を挿入し−ｒｃＩ／
ｌが得られる。、Ｅｃｏ　Ｒ１とＢａｍ　ｔｌｌ制限部
位を設りるほかに、リンカ−配列はＡ　Ｔ　Ｇ開始コド
ンおよびＧΔＧコドン（このコドンはグルタミン酸、即
ち天然に存在するヒ＋α、−アンチトリプシンの第１の
アミノ酸の逍イＩ、暗＋シを指定するもの）も提供する
ことがわかろう。したかって、α、−アンナ１−リブシ
ンの（１へ造遺伝ｒ−の残部がｌｉａｍ　ＩＩＩ部位に
挿入された時、これら−１「ンは“枠の中（ｉｎ　ｒｒ
ａｍｃ）　”にある。

ヒ１−のαＩ　−アンチトリプシンの優荀体のｉｆｆ伝
１１ｆ１号を有する遺伝子（図１に示す）は、ヒトの配
列をｔ）　Ｎへ父夕１Ｆプ［１−ゾとして用いることに
より、ヒトのＩ）Ｎへのライブラリー（Ｉ　ｉ　１Ｉｒ
ａ　ｒｙ）（Ｋ　ｕ　ｒ　８ｔ：　ＩＩ　（；　は力）
、　ＩＩＮＡＳ　ｌｌ５Ａ、−７１’ｊ−１６８２６〜
Ｇ　８３　（１（１９８１）　；Ｃｂａｎｄｒａほか、
旧０　＜：　ｌ＋　ａ　ｍ。

旧ｏｐｌ＋ｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ、　、−↓−Ｏ，（
，７５１〜７５８（１９８１））から分離される。この
ｉｆｆ伝子は次に図３に示すように、Ｐｓｔｌフラグメ
ントとしてヘクターｆノυＣ１３（ν１ｅｉｒａほか、
砂懸、　−１−９−１２５９−２６８（１９８２）によ
ってヘクターｐ　＋１　ＣＢおよびｐ　ＩＩ　（：　９
について記載されたように製造されたものであるが、Ｉ
■Ｚ遺伝子の開始位置に図２に］ＩＫず制限部位を多数
有している）にｐＨｃ１３の中−のｌ’ｓ１１部位ｔこ
おいてＪｊｌｉ人される。４Ｆした構造では、アンチト
リプシン遺伝子にＧコ、Ｘｂａ１部位およびＥｃθＲ１
部位が多りローニンク配列で続いた。

したがってこれら２つの部位の間に、酵母ＴＰＩターミ
ネータがｐＴＰＩｃ　１０からの７００塩基対Ｘｂａ　
１−　Ｅｃｏ旧フラグメントとして挿入された。プラス
ミドｐＴＰＩｃ　１０はＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａ
ｋｉ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、＾ｐｐ、　Ｇｅｎｅ、上、
４１９〜４３４　（＋９８２）に記載されている。こう
して得られた、図３に示すプラスミドは、ｐＵｃα−１
＋　Ｆ　Ｇ　ｌであって、ヒトのα、−アンチトリプシ
ンを酵母転写ターミネータとともに含んでい■る。ｐ［
Ｊｃα−１＋ＦＧｌの詳細な構造を図５に示す。

図３を参照すると、次に酵母ターミネータの３”末端に
Ｂａｍ　）目部位を創り出すために、ＩＥｃｏ　Ｒ１、
Ｂａｍ旧合成りＮＡアダプターがｐＵＣα−１＋ＦＧＩ
のＥｃｏ　Ｒ１部位に加えられる。このアダプターの使
用により、Ｂａｍ旧で切断して約２１００の塩基対フラ
グメントを遊離させ、ヒトα１−アンチトリプシン酵母
ターミネータ配列を除去できる。

次に、このＢａｍ旧フラグメントが、ゴＰＩプロモーク
をＨａｍ　ｌｌｌ−１ダブクーとともに含んでいる変性
Ｃ１／１プラスミドに挿入される。生したプラスミド■
ＡＴ４：よ、′Ｉ’　Ｉ）　Ｉプロモータ、＾ＴＧＧ八
らアダプター、ヒトα１−アンチトリプシン遺伝子およ
びｉ”　Ｉ）　ｌターミネータを含んでいる。Ｉ］八へ
Ｆ４の詳細な構造を図６に示す。１図７を参１（なする
と、ｌｌ１１１１゛４はＩＥ　（：Ｏ旧および１ｌｉｎ
ｄｌｌで消化され、約１４００の基部対ｌ１ｉｎｄｌｌ
ｌ　−Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントが分離された。ごのフ
ラグメントは、上述したＳ、ボムベＡ１１ｌｌプロモー
タを含む１４ｃｏ　Ｒ１−５ｐｂ　ｌ　７００塩基対ソ
ラグメン（・に連結された。生したｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ
　−Ｓｐｒ＋　１線状フラグメン１−を、次に、Ｓｐｂ
　Ｉと１ｌｉｎｄｌｌｌで消化したソ千１〜ルヘクター
ｐＣＡＳに挿入した。プラスミドｐ　ＣΔＳはＣＶ　ｌ
　３　（ＹＥｐｌ　３としても知られる；　１ｌｒｏａ
ｃｈほか、販朋、−８−１１２１〜１２３（１，９７９
））の誘導体であり、単一の５ｓｔｌ部位は、５ｓｔｌ
による切断、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄ　ＮＴＰ
−を用いる末端のブラント末９：１ｊ化および線状分子
の再連結によって破壊されている。図７に示す、Ｓ、ボ
ムベΔ１）１１プ１コモータ、Ｃ１−アンチトリプシン
暗号配列、および′Ｉ’　Ｐ　１ターミネータを含む最
終的構造はｐＲ１０３−５として知られている。ｐＲ１
０３−５の詳細な構造を図８に示す。このプラスミドは
Ｓ、ボムベの１ｅ１１１−３２突然変異体を補足する針
　匹匹■旦匹　囮遺伝子も含んでいる。

プラスミドｐＲ１０３−５は、通常の方法によってＬ　
ボムヘ株を形質転換するのに使用することができる。形
質転換された細胞を増殖すると、ヒトα、〜アンチトリ
プシンのプロテアーゼ阻害活性を示すポリペプチドを発
現する。これらのクンバクは遺伝的なＣ１−アンチトリ
プシン欠乏症やＣ１−アンチトリプシンの不足に関係す
る他の病気の治療に有用の可能性がある。したがって、
肺気腫および肺のうの進行性消化（ｐｒｏ８ｒｅｓｓｉ
ｖｅｄｉｇｅｓｔ＋ｏｎ＞に関連する肺疾患のような他
の異常、例えば慢性閉そ（性肺病又は成人の呼吸困難症
候群を治療することができる。非遺伝的な肺気腫、例え
ばタバコの吸い過ぎによる肺気腫も治療することができ
る。必ずしも肺に限らない異常、例えばのう脂性線維症
や関節炎も治療することができる。α１−アンチトリプ
シンの欠乏については、Ｇａｄｅｋ、　Ｊ、　ｌシ、Ｉ
およびＲ，ＣｒｙｓＬＩ、Ａｌｐｈａ　−１八ｎｔｉＬ
ｒｙｐｓｉｎ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ″、Ｔｂｅ　Ｍｅ
Ｌａｂｏｌｉｃｊ３ａｓ±ｓ　ｏ　ｒ　Ｉ　ｎ　ｈ　ｅ
　ｒ、１ｔｅｄＤ国明状、　Ｊ　、　Ｂ　、　Ｓ　Ｌ　
ａ　ｎ　ｂ　ｕ　ｒ　ｙ　＋、１．Ｂ、　Ｗｙｎｇａａ
ｒｄｅｎおよびり、Ｓ、　Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ。

ＭｃＧｒａｗ−Ｉｌｉｌｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１
４５０〜１４６７ページ（１９８２）を参照されたい。

本発明によるタンパクは通常の薬学的担体と混合するこ
とができる。このタンパクは、静脈性Ｕ＝１で又は吸入
によって好ましく投与することができる。有効投与■は
、異常の重さおよび患者の体重によって変わるが、静脈
注射でタンパクを導入する場合０．５〜１０．０　Ｂｍ
／ｗｋの投与量が多くの場合効果的である。投与法が吸
入による場合は、低段Ｉｊｑ］、が効果的である。経１
」投与も有効であるが、ただしα１−アンチＩ・リプシ
ンをカプセルあるいＧ、１世体（ｃｏｄｅｄ　ｔ：ａｒ
ｒ’ｆｅｒ）に入れ、消化管内での早過ぎる崩壊から守
る必要がある。次の実施例は本発明Ｇごよる具体的実施
態様を述べるものであるが、本発明をこれらに限定しよ
うとするものではない。

実施炎上 〔α１−アンチトリプシン活性を有するタンパクのＳ、
ボムへからの産生〕 ｐＲ１０３−５発現ベクターを用いて、Ｓ、ボムヘ株Ｐ
Ｒ１１８−４（ｈ−、川１−３２）、Δ”Ｉ’　ＣＣ寄
託１１ｋ１．２０６８０、を形質転換する。姪の株は、
株ＰＲｌ　３１　（ｈ＋、　Ｉｅｕ　１−３２）　（Ｋ
ｏｈｌｉ外によりＧｅｎｅｔｉｃｓ＋　８７．４７１−
４８９　（１９７７）に記載）と株ＰＲＰ１７（ｈ−、
り旦１Ｏ−１２９）に記載）を交雑させ、一致したコロ
ニーサイズを与えるクローンを分離することにより得ら
れる。

形質転換された細胞は、Ｒｕ５ｓｅｌｌ外によりＮａｔ
ｕｒｅ＋１−則り−１１６７−１６９（，１９８３）に
記載の選択的条件で増殖させることができる。ノザン法
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ　）　（Ｔｈｏｍａｓ
、ｒ’ＮＡｓＵｓＡ、　７−ご７□、５２０１〜５２０
５（１９８（］））および］３２Ｐ−ラヘル化ＥｃｏＲ
１−Ｈ１ｎｄｌｌｌα１−アンチトリプシン−１’　Ｉ
）　ＩターミネータブＩコープを用いる１ンＮＡ分机に
よって、α１−アンチトリプシンｃ、　Ｉ）　Ｎ　Ａの
高度の転゛りがＡ　Ｉ）　ｌ−（プＩコモータにより命
しられていることがわかる。選Ｈ＜四条イ′１で１＋’
ｌ　Ｍさ−ｌた対数１すＩ’ｒｌｌ￥’株からの細胞抽
出物を１？、１、ＩｓΔアッセイにより分）Ｊ１シ、全
ｉｊＪ　ｊ容性タンパクの０．８５〜０．９５％がα１
−）″ノナ１−リプソン活性を示すタンパクである、二
とがわかる。

実遣進Ｕ 〔α１−アンチ１−リプシン活性を示ずＳ、ボムへから
のタンパクの特徴〕 実施例１の上記Ｓ、ボムベ形質転換体からのα１−アン
チＩ・リプシンタンパクは、アミノ吸着カラム」４での
精製およびポリアクリルアミド／　Ｓ　Ｉ）　Ｓゲ月月
二での電気泳動によりさらに特徴がはっきりする。カラ
ムは、ヒトα１−アンチトリプシンに対するアフィニテ
ィー精製抗体をＣＮＢｒ−活性かセソアｌ」−スに、Ｃ
ｕａｔｒｅｃａｓａｓ２竪１棟時叩、＋２４５．３０５
９（１！１７０）の方法によって共有結合で結合させる
ことでｉｌｌ製する。破壊された細胞を、リン酸塩緩衝
食塩水（ｐＨ７，２，０，５ｍＮａＣ１２含有）で抽出
し、カラムに付ず。３ｍＮａ５ＣＮでカラムを溶離させ
、回収した物質を、Ｆデシル硫酸ナトリウムの存在下で
ポリアクリルアミド上で電気泳動させて分析する。Ｓ、
ボムベで産出されるα、−アンチトリプシンタンパクは
４２〜４３ｋｄａｌの範囲の分子量を有する。天然に存
在するヒトのα１−アンチトリプシンは約５４ｋｄａｌ
の分子量を有し、炭水化物の組成比が約１６重量％であ
る。ｌｌｏｄｇｅｓ外、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　２５
４．８２０８〜８２１２　（１９７９）を参照されたい
。Ｓ、ボムへが産出するα１−アン、チドリプシン活性
を有するタンパクは、したがって、グリコジル化されて
いないか、あるいは実質的にグリコジル化されていない
と思われる。

実施例３ （ＡＴについてのＥＬｆＳＡアッセイ〕ＡＴを分析する
ために、アフィニティー精製したヤギ抗α１−アンチト
リプシン（０，１ＭＮａｚＣＯ＋中１０μｇ／ｍＪ、ｐ
Ｈ９，８）　２００μｌを９６六マイクロタイター・カ
ルナヤープレートの各穴に３７℃で２〜４時間置く。こ
の溶液を除きｐ１１７．２で１％ＢＳ八と０．０５％’
Ｉ’ｗｅｅｎ　２　（ｌを含有するリン酸塩緩衝食塩水
（Ｐ　Ｂ　Ｓ）　２００μｐを各穴に入れ、３７℃で２
時装置いた。

標準その他の試料を次に各穴に入れる・と、Ａ　ｉ”が
存在する場合はＡＴは特定の抗体に結合する。

１５〜３０分のインギュヘーシＥｌンの後、穴を１’　
Ｂ　Ｓでリンスする。ウザギの抗α１−Δｉ’２００μ
βを、Ｐ　Ｂ　Ｓ　１１１１％Ｉ３　ＳΔの存在下で各
人に加える。１５分間のインキュヘーシ９ン後、溶液を
除き、穴をＩ）　Ｂ　Ｓでリンスする。

１％ＢＳΔ中アルカリ性ボスファターゼに結合したヤギ
の抗つリ°ギＩｇＧの２００μβの試料およびＰＢＳを
各穴に加え、１５分間インキュベートする。穴をリンス
後、０．１ｍジェタノールアミン（ρ１１９．６）　５
０ｒｒ＋ｊ！にン容解したジニＩ・ロフェニルボスフェ
−１・３（１ｍ（Ｈを含有する基質溶液２００μｐを加
えた。黄色を発現させ（１５〜６０分）、濃度をタイタ
ーチック・マルチスカン・ディテクター（Ｔｉｔｅｒｔ
ｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）により
４０５ｎｍで記録する。この黄色は試験溶液中のＡＴ量
に比例する。

【図面の簡単な説明】

図１は、ヒトのα１−アンチトリプシンの優位体の遺伝
暗号を有する遺伝子のｃＤＮＡ配列である。 図２は、リンカ−を含むｐＵｃ１３の部分配列を表わす
。 図３は、ベクター１１　Ａ　Ｔ４の製法を表わす。 図４は、ＨＡ　Ｔ　４の製造に利用されるベクターであ
る、ベクターＣ１／】の制限マツプを表わす。 図５は、ＨＡＴ４の製造に使用される中間ベクターであ
る、ベクターｐｃＵα−１＋　Ｆ　Ｇ　１の制限マツプ
を表わず。 図６は、ＨＡＴ４の制限マツプを表わず。 図７は、Ｓ、ボムベ中でα、−アンチトリプシンを産生
ずる産生（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクターである、ベ
クターｐＲ１０３−５の製法を表わす。 図８は、ｐＲ１０３−５の制限マツプを表わす。 ｒｇ：ｌｌ１ｉＩの浄獣（内容に変更−ＦＩＯ，１−号
Ｑ −１＋１ ０ ２９０　３００　３１υ ≧Ｌ） １０　２〇 １０ ０ ３２０　３３０　３４０ １　２３４５ １　２　３　４　ＰＲＯ’ＳＥＲＬＥＵＧＬＹＣＹＳＭ
１３ｍｐＨ／ｐＵｃ１３　ＴＨＲＭＥＴ　ＩＬＥ　ＴＨ
ＲＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　Ａ
ＧＣＴＴＧ　ＧＧＣＴＧＣＨｉｎｄｌｌｌ　Ｐｓｔｌ ＦＩＧ、２ ６　７　８　９　１０１１　１２１３１４１５１６ＡＲ
Ｇ　ＳＥＲＴＨＲＬＥＵ　ＧＬＵ　Ａ’ＳＰ　ＰＲＯＡ
ＲＧ　ＡＬＡ　５ＥＦＩ　ＳＥＲ５６７８ＡＳＮ　ＳＥ
ＲＬＥＵＡＬＡ ＫＧＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　Ｃ
ＣＣＣＧＧ　ＧＣＧ　ＡＧＧ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ
　ＣＴＧ　ＧＣＣ５ｏ目　Ｘｂａｌ　ｅａｄｌｌ　Ｘｍ
ａｌ　５ａｔｌ　ＥｃｏＲＩ　ＨａｅｌｌｌＡｃｃｌ、
ＨｉｎｃＩＩ　Ｓｍａｌ ＝ρｅＲ３２２ＦＩＧ、　４ ｍ　ＴＰ”−°“−’　ＦＩＧ、５ ＡＴ４ ＦＩＧ、　６　−□２１．・ｔ＋ｔ−”ｚＰＲ＋０３−
５ （Ｃ１２Ｎ　１５／Ｕｔｌ Ｃ１２Ｒ１：６４５） １、事件の表ボ　昭和５９年特許願第１７０９８８号３
、補正をする考 事件との関係　出　１頭　人 ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　酵母シゾサツカロミセス・ボＪ・へ（Ｓｃｂｉ
   ｚｏｓａ−ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）で
   異種タンパクを製造する方法であって、Ｌ）Ｎへベクタ
   ーにより形質転換された０；１記酵母の培養株を増殖さ
   セる］二程を倫え、前記ベクターがシゾサツカロミセス
   ・ボンへ・プし１モータの遺伝暗号を指定するセグメン
   Ｉ〜を含め、前記ポリペプチドの発現を前記プロモータ
   の調節１ｚで行う方法。 （２、特許請求の範囲第（１）項記載の方法であって、
   前記プｌ’：ｌモータが一？ルコール・デヒドロゲナー
   ゼ・プロモータからなる方法。 （３）特工′１請求の範囲第（２）項記載の方法であっ
   て、前記ポリペプチドが、は乳動物のα１−アンチトリ
   プシンのプ１」テアーゼ阻害活性を特徴とする力１去。 （４）特許請求の範囲第（３）項記１１＆の方法であっ
   て、前記ポリペプチドが、は乳動物のα、−アンチトリ
   プシンの優位体のアミノ酸配列を特徴とする方法。 （５）特許請求の範囲第（２）項記載の方法であって、
   前記ベクターがプラスミド１ｌＩ２１０３−５からなる
   方法。 （６）　シゾサツカロミセス・ボム・＼のプロモータと
   、異種タンパクのための遺伝子であって前記タンパクの
   シゾサツカロミセス・ボムベ中での発現が前記プロモー
   タの規制下になるように配置された遺伝子とを備えるＤ
   　Ｎ　Ａ　ｉＭ造。 （７）特許請求の範囲第（６）項記載の構造であって、
   前記１０モータがアルコール・デヒドロゲナーゼ・プロ
   モータからなる構造。 （８）特許請求の範囲第（７）項記載の構造であって、
   前記遺伝子がは乳動物のα１−アンチトリプシンの遺伝
   暗号を指定する配列を含むものである構造。 （９）　特許請求の範囲第（６１項記載のＤＮＡ構造を
   含有する、シゾサツカロミセス・ボムベの形質変換体。 （Ｈｌ）　特許請求の範囲第（７）項記載のＤＮＡ構造
   を含有する、シゾサツカロミセス・ボムへの形質変換体
   。 （ＩＩ）　’Ｉ、’？許請求の範囲第（Ｈｌ）項記載の
   ｌ）Ｎ△構造であって、１１目（］　３−５の］）ＮΔ
   配列を含むもの。