JPS592683A - 凍結乾燥微生物による種子の接種法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生産力を高めるための農業および園芸用種子
の微生物処理に関する。

植物種子に微生物を接種して、種子からの植物の成長を
向上させること゛が、多年にわたって行われている。た
とえば、窒素固定微生物を使用してマメ科植物を処理し
、発芽した植物の成育が土壌硝酸塩により左右されるの
を小さくすることが行われてきた。

接種技術は種子と微生物との接触を必要とする。

このような接触には、微生物培養液を水中に分散させた
ような接種液が多く使用される。微生物に加えて、表面
張力低下剤、成長促進物質などの有益な補助物質を接種
液に存在させることも時に行われてきた。ビート、炭素
などの担体に担持した菌を、希薄な水性シロップ中に分
散させて接種液とすることも行われている。微生物、種
子および植物に対して有害あるいは破壊作用があると認
められる物質は、接種液から排除されてきた。

接種液は、スラリー形成、噴霧および浸漬処理を始めと
する多様な方法により利用されてきた。種子の接種は、
種子をバレル内でタンブルさせながら、これに接種液を
噴霧するか、種子と接種液との混合物からなるスラリー
を形成することにより行われている。

種子の接種法においては、種子１精通たりの有効菌量が
最小となる均一に接種された種子を生ずるように試みる
のが普通である。この最小有効菌量は、処理を受けたす
べての宿主植物において目的とする種子の菌個体数は、
使用する種子および菌の種類に応じて決まる。

米国特許第２，９５４，６４３号では、流動床を使用し
て種子を接種している。微生物を含有する接種液が、不
活性ガスにより流動状態に保持されている種子の流動床
に導入される。

米国特許第３，０５４，２１９号には、最小有効菌量が
種子上に確実に保有されるように、種子に過剰量の微生
物を接種することが記載されている。

米国特許第２．３１３，０５７号、米国特許第２，９９
５，８６７号および米国特許第４，１４９．８６９号に
は、植物に有益な物質を含む材料による種子のペレット
化、すなわち種子の被覆が記載されている。

別の接種法が米国特許第３．４９９，７４８号に記載さ
れている。この方法では、粒状の焼石膏をアゾトバクタ
−（八ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　）またはリソ゛ビウム（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　。

根瘤菌）属の細菌の培養液で処理する。この粒状物を次
いで種子と混合し、この混合物を土壌に播種する。

米国特許第４．ｉ５５．７３７号では、微生物をポリマ
ーゲルに混入する。このゲルを小粒子に粉砕し、これを
種子とともに播く。

種子に適用する微生物の商品化は、乾燥種子上で微生物
生存能力を維持するのがが困難であることが障害となっ
ており、特にアクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒ　）　、アルスロバクタ−（八ｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ）、アゾトバクタ−およびシュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａＳ）属の乾燥感受性のある細菌ではそ
うであった〔Ｂｒｏｗｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈ
　ｔｏ　ａｔｈ、　１２　：　１８１−９７　（１９７
４）；　Ｋｌｏｅｐｐｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｒｏｔｈ、
　ハ■肚虹紅７１　　：　５９０−９２（１９８１）　
）。

本発明は農業用種子に微生物を接種する方法およびその
方法から得られた接種された種子に関する。

別の側面では、本発明は凍結乾燥した微生物を種子に接
種する方法に関する。さらに別の側面では、本発明は凍
結乾燥した微生物を含有するコーティングを種子に被覆
する方法に関する。

本発明を実施する場合、有用微生物を凍結乾燥し、これ
を結合剤とともに農業用種子に被覆し、植物の種類に応
じて３〜８重量％の水分含有量になるまで、約４５℃よ
り低温で乾燥する。別法として、凍結乾燥した微生物を
結合剤および充填剤とともに農業用種子に被覆してもよ
い。さらに別の方法として、農業用種子を予め結合剤お
よび充填剤により被覆ないしペレット化し、この種子に
凍結乾燥した微生物を追加の結合剤とともに接種するこ
ともできる。

本発明で使用しうる微生物は、植物に有利な根城作用を
及ばず土壌微生物として記載されたことのあるものであ
る。この種の微生物およびその作用については、米国特
許第４，１５５，７３７号に記載されている。

有用微生物の例としては、リゾビウム、エンテロバクタ
−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）　、スピリルム（Ｓｐ
ｔｒｉｌｌｕｍ）、バクラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、
シュードモナス、アシドバククー、アルスロバクタ−、
アクロモバクタ−および放線菌類（＾（ｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ　）に属するものが挙げられるが、これらに限
定されるわけではない。

真菌の例としては、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕ＋ｓ　）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　
）　、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）　、ならび
に外菌根および胞状（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ）−フルハス
キュクー（ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ）菌根を形成するもの
が挙げられる。別の微生物は、菌寄生真菌（ｍｙｃｏｐ
ａｒａｓｔｉｃ　ｆｕｎｇ＋）　、線虫捕捉菌ならびに
関連植物病原体により引き起こされる病気を抑制するこ
とができる病原真菌もしくは細菌の無毒隔離物である。

本発明の方法により被覆することができる種子としては
、すべての農業用または園芸用種子が包含される。「農
業用種子」という用語は、本明細書においては、農業用
および園芸用のいずれの種子をも包含する広い意味で使
用している。このような種子の例としては、レタス、ブ
ロッコリ、カリフラワー、キャベツ、セロリ、にんじん
、たまねぎ、ラディシュ、トマト、とうもろこし、カラ
ス麦、マメ科植物、イネ科植物、および観賞用花卉が挙
げられる。

微生物の凍結乾燥は、任意の市販各種凍結乾燥機により
実施することができる。凍結乾燥機の１例は、ラブコン
コ社（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、米国ミズーリ州カンザスシチ
ー）製の凍結乾燥機５型である。

凍結乾燥操作は約−４０℃未満、好ましくは約−７６℃
〜−６５゛Ｃの凝縮機温度で実施しうる。有用な圧力範
囲は約０．２５トル以下、好ましくは約０．０２５　　
トル以下である。

、　凍結乾燥操作を実施する場合、微生物を含有す名培
養液を直接凍結乾燥してもよい。しかし、菌体から過剰
の培地を例えば遠心分離または濾過により除去し、次い
で菌体を別の液体に懸濁させるのが好ましい。懸濁用液
体として水を使用してもよム、）が、菌体を凍結保護剤
中に懸濁させるのが好ましい。凍結保護剤の例としては
、グリセリン、スキムミルク、しょ糖およびジメチルス
ルホキシドが挙げられる。

好ましい凍結保護剤の１例は、Ｏ，１ＭＬよ糖、０．０
５Ｍグリセリン、０．０７Ｍ安息香酸ナトリウムおよび
０．０１と硫酸マグネシウムの水溶液から調製されたも
のである。菌体ば、凍結保護剤：菌体の体積比で約３＝
１ないし約１：１、好ましくは約２：１となる量の凍結
保護剤中に懸濁させる。凍結乾燥すると、微生物は乾燥
粉末状で回収される。凍結乾燥した生成物は、−ｉに、
１ｇ当たり１０　のオーダーでコロニー形成単位（ｃ　
ｆ　ｕ）を含んでいる。微生物の凍結乾燥および凍結乾
燥操作に使用する凍結保護剤についての詳細は、米国メ
リーランド州ロックビル所在のＡＴＣＣの「アメリカ模
式菌培養蒐集法」に説明されているので、参照されたい
。

凍結乾燥した微生物を、一般には少量の結合剤とともに
、好ましくは結合剤および充填剤とともに、種子に均一
に被覆する。この被覆は、回転皿もしくは回転式セメン
トミキサーあるいは流動床で実施することができる。微
生物を直接種子に被覆する場合、微生物粉末が種子を均
一に被覆するように種子と微生物を一緒にタンブルさせ
る。次いで、微生物を種子に付着させるために、タンブ
ル中の種子に少量の結合剤を噴霧する。接種された種子
を、その後約２０〜４５“Ｃの温度で強制空気流により
、接種された種子の重量に基づいて約３〜８重量％の水
分含有量になるまで乾燥する。

好ましくは、凍結乾燥した微生物を、ペレ・ノド化種子
、すなわち、結合剤と充填剤を被覆する種子に通用する
。ペレット化操作では、種子を回転装置内でタンブルさ
せながら、適当な大きさのペレ・ノド化種子が得られる
まで、結合剤と充填剤とを交互に添加する。ペレット化
した種子を、次いで、約３０〜４５°Ｃの温度で、ペレ
ット化種子の重量に基づいて約３〜８重量％の水分含有
量になるまで、強制空気流中で乾燥する。この方法では
、上記操作中の任意の時点で微生物を種子混合物に添加
することができる。好ましくは、微生物が被膜のほぼ中
央に（るように微生物の添加を行う。

既にペレット化した種子に対して微生物を被覆すること
もできる。これは、ペレット化された種子をタンブルさ
せ、結合剤の軽い噴霧を行いながら凍結乾燥した微生物
を添加し、次いで接種したペレ・７ト化種子を前述のよ
うにして乾燥することにより実施される。

種子への接種物の被覆量は、微生物、種子および土壌の
種類により異なる。一般に、この接種物の量は、約１０
２〜１０８ｃｆｕ／種子の程度であろう。

ｃｆｕ／種子で表した量を重量で表す場合、１０６ｃｆ
ｕ／種子が１種子あたり約１〜５マイクログラムの接種
物に相当する。これは、実際の種子に換算すると、レタ
ス種子１ｋｇ当たり０．５６〜１．１２ｇの接種物、ま
たはラディシュ種子１ｋｇ当たり０．０６〜０゜１１ｇ
の接種物という量になる。

接種および被覆操作に使用できる結合剤は、水溶性また
は水分散性合成ポリマーまたは天然ガム製品の希薄溶液
である。このような結合剤物質の例は、メチルセルロー
ス、メチルエチルセルロース、アラビアゴム、グアー、
カゼイン、ゼラチン加水分解物、ポリビニルアルコール
、ポリオキシエチレングリコール、澱粉、ヒドロキシエ
チルセルロース、カラヤゴム、トラガカントゴム、ポリ
酢酸ビニルなどである。

有用な充填剤は、種子に悪影響を与えずに種子上に被膜
を堆積するのに使用できる、有機および無機粉末である
。このような充填剤の例は、ベントナイト、二酸化チタ
ン、炭素１．バーミキュライト、サンド、ケイソウ土、
クレー、シリカ、マイカなどである。

肥料および保湿剤などの他の成分も、所望により被Ｖ！
操作に際に添加しうる。

ペレット化した種子に微生物を被覆する最初の試みでは
、野菜の種子のペレット化の操作中に、シュードモナス
属の菌株の微生物の水性懸濁液を、ポリビニルアルコー
ル（結合剤）およびケイソウ土（充填剤）とともに噴霧
した。この微生物はペレット化工程中は生存していたが
、２０〜４５℃の範囲内で変化させた乾燥温度および時
間には関係なく乾燥工程中に死滅した。水分含有量３０
％未満のペレット化種子からは生存能力のある菌を回収
することができなかった。ペレット化種子の水分含有量
は、一般に約３〜８重量％、好ましくは約４〜６重量％
の範囲内に保たれる。

メチルセルロース／ケイソウ土の組成の＋１１Ｆｆｔに
菌を存在させた場合、ペレット化種子を４３℃で乾燥す
ると、菌の生存は全く認められなかった。Ｍ、　Ｎ。

５ｃｈｒｏｔｈ研究室により調製された接種物中のシュ
ードモナス属の１菌種［Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ　７１　：
　５９０−９２　（１９８１ができなかった。

ＫＩｏｅｐｐｅｒおよび５ｃｈｒｏ　ｔｈの方法（Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈ　７１　：５９０−９２　（１９８１）
　）により、約３Ｘ１０８ｃｆｕ／ｇの菌含有量を有す
るキサンタンゴム／ケイソウ土混合物中の接種物を調製
した。この接種物を、ラディシュの種子のペレット化中
に、２Ｘ１０６ｃ　ｆ　ｕ／種子の測定値が得られるべ
き量で適用した。しかし、ペレット化した種子を強制空
気循環乾燥機により２０℃で乾燥した場合でも、種子上
の菌量体数は３×１０’ｃｆｕ／種子に減少していた。

また、このような低温で乾燥したにもがかわらず、種子
上の被覆はひび割れし、種子から剥脱していた。

ス呈狙上 シュードモナスＭＣＢ−ＩＡ菌株をキング（Ｋｉｎｇ）
ブロスで２日間振盪培養した培養液を遠心分離し、捕集
された菌体を蒸溜水で２回洗浄した。２Ｎのブロス培養
液から集めた洗浄菌体を１００　　ｍｌの蒸溜水に懸濁
し、０．２５）ル、−７６℃で８時間凍結乾燥した。得
られた粉末を分析したところ、５　ＸＩＯ’　ｃｆｕ　
７ｇの菌を含有していることが判明した。この粉末２ｇ
を、ポリビニルアルコールとケイソウ土でペレット化中
のブロッコリ種子２８ｇ（〜９７５０粒）に被覆した。

ペレット化が済んだ種子の試料を乾燥の前に分析すると
、計算上の理論量であるＩ　Ｘｌ０６ｃｆｕ　７種子の
菌量体数を有していることが判明した。強制空気循環乾
燥機で２０℃において５〜６重量％の水分含有量になる
まで乾燥した後、乾燥種子上の細菌の個体数を測定する
と、５　Ｘｌ０５ｃｆｕ　７種子であった。同様に被覆
した種子を４３℃の温度で乾燥した場合にも、種子上の
細菌の量は同じであった。

夫施皿ｌ シュードモナスＭＣＢ−１７０菌株（ＭＣＢ−１＾菌株
より乾燥感受性が高い）の培養液１５０ｍ１を遠心分離
し、捕集された菌体を蒸溜水で２回洗浄した。洗浄した
菌体（細胞数５×１０′２）を、０．ＩＭＬヨ糖、０．
０５Ｍグリセリン、０．０１Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，および０．
０７Ｍ安息香酸すトリウムを含有する水溶液６ｍｌに懸
濁させた。０．２５）ル、−７６℃で８時間凍結乾燥す
ると、得られた乾燥粉末は３　ＸＩＯｃｆｕ　７ｇの菌
を含有することが判明した。この粉末０．７７　ｇを、
ポリビニルアルコールとケイソウ土でペレット化中のレ
タスの種子７ｇに被覆した。強制空気循環乾燥機により
４３℃で５〜６重量％の水分含有量になるまで乾燥した
後、乾燥種子上の菌量体数を測定すると、４．７　ｘｉ
ｏ’　ｃｆｕ　７種子であった。

犬墨週１ 実施例２に記載の方法にしたがって、シュードモナスＭ
ＣＢ−１７０菌株の凍結乾燥粉末を、実施例２に記載の
凍結保護剤水溶液を懸濁媒として利用して調製した。こ
の粉末を、ポリビニルアルコールとケイソウ土でペレッ
ト化中のレタス種子に、３　ＸＩＯ’　ｃｆｕ／種子の
菌量体数を与える量で被覆した。その際、３種類の実験
を行った。第１の実験では、被覆すべき接種物を種子の
近くに位置させ、第２の実験では接種物を被膜の中間部
に位置させ、第３の実験では接種物を被膜の表面近くに
位置させた。最終的に得られたベレットの直径は３〜３
．５ｍｍであった。４３℃で強制空気流により６〜７重
量％の水分含有量になるまで乾燥した後、種子を分析す
ると、いずれの実験でも種子の菌量体数は１．４〜２．
ＯｘｌＯ’　ｃｆｕ　７種子であることがわかった。接
種した種子を野外土壌と滅菌鉢植用混合土の両方に播種
した。発根の個数の差異は非常に小さかったが、被膜の
中間部に接種した種子が発根の個数がやや多いことが認
められた。

大施興土 シュードモナスＭＣＢ−１７０菌株（乾燥感受性が弗素
に高い）の培養液１ｉを遠心分離し、回収された菌体を
実施例２に記載の凍結保護剤水溶液５６０　ｍｌに懸濁
させ、０．０２５　　）ルの圧力、−６５℃の凝縮器温
度で２０時間凍結乾燥した。凍結乾燥した接種物を、ポ
リビニルアルコールとケイソウ土でペレット化中のにん
じんの種子に、１．５　Ｘｌ０５ｃｆｕ　７種子の歯間
体数を与える量で添加した。その際、３種類の実験を行
った。第１の実験では、被覆すべき接種物を種子の近く
に位置させ、第２の実験では接種物を被膜の中間部に位
置させ、第３の実験では接種物を被膜の表面近くに位置
させた。最終的に得られたペレットの直径は２．０〜２
．４ｍｍであった。４３℃で強制空気流により４〜５重
量％の水分含有量になるまで乾燥した後、種子を分析す
ると、種子の歯間体数はそれぞれ３．６　ＸＩＯ’　ｃ
ｆｕ　７種子（接種物が種子の近くの場合）　、１．３
　Ｘｌ０３ｃｆｕ　７種子（同被膜の中間部）および１
．９　Ｘｌ０２ｃｆｕ　７種子（同被膜の外面付近）で
あることがわかった。

実施例１ 前記と同様にして製造したシュードモナスＭＣＢ−１７
２菌株の凍結乾燥接種物を、ペレット化中のレタス種子
に被覆した。別に、予めペレット化して乾燥したレタス
種子にも、このペレットに凍結乾燥粉末を被覆し、これ
にポリビニルアルコール結合剤を噴霧し、ペレットを４
３℃で乾燥することにより、同じ接種物を被覆した。こ
の両者の方法の間で、菌生存率および発根数に差異は認
められなかった。

実施例１ シュードモナスＭＣＢ〜１１４菌株の凍結乾燥接種物に
よるレタス種子の処理を、この接種物をポリビニルアル
コール結合剤の軽い噴霧とともに被覆した後、４３℃で
短時間乾燥することにより行った。微生物の生存率は、
ペレット化中のレタス種子に同じ菌株を被覆した場合と
同等であるか、あるいはそれより良かった。ペレット化
中に接種した場合と裸の種子に接種した場合とを比較す
ると、接種後の種子の発根数に差異は認められなかった
。

実呈拠１ ペレット化種子上の凍結乾燥細菌の死滅率を検査した。

ブロッコリとラディシュの種子を、凍結乾燥したシュー
ドモナスＭＣＢ−ＩＡ菌株を添加しながらペレット化処
理した。ペレット化種子を密閉プラスチック容器に入れ
て、４℃、１４℃および２２℃で貯蔵し、３４週間にわ
たって定期的に分析した。１０　’　ｃｆｕ／種子の最
初の歯間体数が１０５ｃｆｕ／種子まで減少する期間は
、２２°Ｃでは２．５〜３週間、１４°Ｃでしま４〜５
週間、４℃では３４週間であった。４°Ｃで貯蔵した種
子上のＭＣＢ−ＩＡ菌株では、プロ・ノコリとラデイシ
ュのいずれの種子についても、種子の歯間体数番よ１８
週で最初の約１０％に、３４週で最初の約１％に減少し
た。

夫蓋班工 真菌のペニシリウムオギザリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍｏｘａｌｉｃｕｍ）　ＭＣＦ−６菌株を、ＡＴＣＣ
法に記載のように２０％スキムミルクの懸濁液中で凍結
乾燥した。この真菌でレタスの種子ペレットを充分に接
種できた。

トリコブルマスピーシースの菌株（ＭＣＦ−２０）　モ
、上記と同様に処理し、ベレ・ノド化種子に適用して好
結果を得た。

夫胤拠工 １１のキングブロス（ｇ／４２単位で、Ｄｉｒｃｏプロ
テオーゼペプトン階３を２０；グリセリンを１２．６　
ｉ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０を１．５；およびに２ＨＰＯ
ａを１．５含有）に、シュードモナスＭＣＢ−１２１菌
株を接種し、回転式振盪機を使用して、２０Ｏｒｐｍで
２０〜２２°Ｃにお（、Ｍて３日間培養した。その後、
遠心分離（５℃、１０，０００Ｘｇで２０分）により菌
体を培地から分離した。次いで菌体を凍結保護液（０，
１ＭＬよ糖および０．０５Ｍグリセリン）　４０ｍ１に
懸濁させ、０．０５１−ルの真空度および一７６℃の凝
縮器温度で６時間凍結乾燥した。得られた乾燥粉末を回
収し、秤量すると４．５４　ｇであった。

接種物中の細菌個体数を測定するために、この粉末０．
０１　ｇを滅菌蒸溜水９．９　ｍｌと試験管内で３０分
間振り混ぜて、再水和させた。その希釈液を半固体のキ
ングＢ寒天（キングブロスを１５ｇ／Ｊの寒天で補足し
たもの）で平板培養した。このようにして測定した歯間
体数は６．４　ＸＩＯｃｆｕ　７ｇであった。

残りの接種物（４，５３ｇ）をペレット化中の種子に添
加した。ラディシュの１変種チェリーベル（Ｃｈｅｒｒ
ｙ　Ｂｅ１ｌｅ）の種子２ボンド（９０６ｇ）　　（発
芽率９０％、７８．７７５粒／ボンド）を用いて、ペレ
・ノド化の実験を行った。１５％ポリビニルアルコール
Ｇｅ１ｖａｔｏｌ　４Ｏ−２０（モンサンド社製）およ
び１％グリセリンからなる結合剤と、ケイソウ土／セル
ロース繊維混合物（Ｆｉｂｒａｃｅｌ　８＾、Ｊｏｈｎ
ｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ　Ｃｏｒｐ、製）の充填剤とを使
用した。乾燥は強制空気循環乾燥機内で４３℃の温度で
１．５時間行った。

種子の理論菌個体数は次式により求めた。

−１，８ＸＩＯ’　ｃｆｕ　／種子 種子の実際の歯間体数は、種子１０粒を９．９　ｍｌの
滅菌蒸溜水中で３０分間振盪した後、希釈液をキングＢ
寒天で平板培養することにより測定すると、５Ｘ１０’
５ｃｆｕ／種子であった。

これらのベレット化種子を、米国サリナスパレ−（Ｓａ
ｌｉｎａｓ　Ｖａｌｌｅｙ）から採取した３種類の野外
土壌を入れた鉢に温室内で播種した。播種後の植物の成
長は、夜間温度１２〜１７℃、昼間温度１８〜２２℃で
３０〜３５日間行った。接種した種子から３種類の土壌
中で成長したラディシュの根の重量は、未接種のベレッ
ト化種子から同一条件下で成長させた根の重量のそれぞ
れ１１９％、１１９％および１５１％であった。

以上に本発明の原理、好適態様および実施方式について
詳述したが、これらは単に例示であって、制限を意図し
たものではないので、本発明は以上の具体的開示内容に
限定されると解されるものではない。

当業者により本発明の範囲内で多くの変更がなされよう
。

４２０−

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）農業用種子に有用微生物を接種する方法であって
   、前記微生物を凍結乾燥し、これを水溶性もしくは水分
   散性結合剤被覆とともに種子に被覆し、種子を乾燥する
   ことを特徴とする方法。
2. （２）該結合剤被覆が充填剤を含む特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. （３）被覆した種子を、約２０〜４５°Ｃの温度で、被
   覆した種子の重量に基づいて約３〜８重量％の水分含有
   量になるまで乾燥する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。
4. （４）温度が約３０〜４５℃、水分含有量が約４〜６重
   量％である特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）微生物の凍結乾燥を、−４０℃より低い温度で、
   ０．２５　）ル以下の圧力において行う特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
6. （６）温度が約−７６〜−６５℃、圧力が０．０２５１
   −ル以下である特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）接種された種子の重量に基づいて約３〜８重量％
   の水分含有量を有する、凍結乾燥した有用微生物が接種
   された農業用種子。
8. （８）約４〜６Ｍ量％の水分含有量を有する特許請求の
   範囲第７項記載の種子。
9. （９）被覆された種子の重量に基づいて約３〜８重量％
   の水分含有量を有する、凍結乾燥した有用微生物と水溶
   性もしくは水分散性結合剤とが被覆された農業用種子。
10. （１０）約４〜６重量％の水分含有量を有する特許請求
    の範囲第９項記載の種子。
11. （１１）被覆された種子の重量に基づいて約３〜８重量
    ％の水分含有量を有する、凍結乾燥した有用微生物と水
    溶性もしくは水分散性結合剤と充填剤とが被覆された農
    業用種子。
12. （１２）約４〜６重量％の水分含有量を有する特許請求
    の範囲第１１項記載の種子。