JPS5913196B2 - 微生物による１２−ケトケノデオキシコ−ル酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物による１２−ケトケノデオキシコール酸
の製造法に関するものである。

１２−ケトケノデオキシコール酸は下記構造式（Ｉ）に
て表わされるようにステロイド核の３８および１ａの位
置に水酸基を有する物質である。

この物質から化学的方法（Ｈｕａｎｇ Ｍｉ ｌ ｔｏ
ｒｆｆｉ）で１段階で収率よく変換されるケノデオキシ
コール酸（ｎ）は胆石溶解作用が窮められ、経口投与に
よる胆石の治療に効果があるといわれ、最近多数の治験
データが報告されている。

本発明の１２−ケトケノデオキシコール酸Ｉは上記ケノ
デオキシコール酸■を製造する上で欠くべからざる前１
駆体であり、安価で簡単に生産する方法の開発が望まれ
ている。

従来、１２−ケトケノデオキシコール酸（Ｉ）はコール
酸（Ｉ）より下記の化学反応により合成されている。

即チコール酸…をメタノールでエステル化し、次いで３
一位および７−位の水酸基を部分アシル化し、次に１２
一位の遊離水酸基を酸化してオキン体として工２−ケト
ケノデオキシコール酸を得ている。

しかし、この方法は３段階の反応を必要とし、煩雑であ
る上に、収率も低く、反応工程を短縮し、収率を上げる
ことが望まれている。

本発明者らはコール酸の誘導体であるデヒドロコール酸
■を原料として用い、３−位及び７−位のケトン基を特
異的に還元する微生物により１２−ケトケノデオキシコ
ール酸を簡単に収率よく生成させることを目的として、
種々鋭意研究した結果、土壌よりデヒドロコール酸を原
料として１２−ケトケノデオキシコール酸を高収率で生
産する菌株を嫌気的条件で分離し、本発明に到達した。

すなわち本発明はデヒドロコール酸より１２−ケトケノ
デオキシコール酸への変換能を有するブレビバクテリウ
ム属に属する細菌をデヒドロコール酸と接触させて１２
−ケトケノデオキシコール酸を製造することを特徴とす
る微生物による１２−ケトケノデオキシコール酸の製造
法である。

デヒドロコール酸■よシ１２−ケトケノデオキシコール
酸（１）への変換は下記式にて表わされる。

本発明により得られる１２−ケトケノデオキシコール酸
（Ｉ）は前述の通り、化学的方法（ＨｕａｎｇＭｉ ｌ
ｔｏｎ法）により一段で収率よくケノデオキシコール
酸に変換できるので、本発明方法に従えに１コール酸…
を出発原料として胆石溶解剤として不動なケノデオキシ
コール酸（社）を３段階で製造す４ことができ、前記純
化学合成法に比較して操作力著しく、簡単で安価に製造
できる。

本発明者等が土壌中よシ分離採取して本発明に於て用い
た菌株（、ＤＣ３３株）の菌学的性質に−いて述べる。

ａ 形態 ■ 細胞の形および大きさ・・・短桿菌（Ｃｏｒｙｎｅ
ｆｏｒｍではない） ■ 細胞の多形性・・・無 ■ 運動性の有無・・・無 ■ 胞子の有無・・・無 ■ ダラム染色性・・・ダラム陽性 ■ 抗酸性・・・なし ｂ 多培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養・・・良好 ■ 肉汁寒天斜面培養・・・良好 ■ 肉汁液体培養・・・良好 ■ 肉汁ゼラチン穿刺・・・溶解しない ■ リドマス・ミルク・・・凝固しない Ｃ生理学的試験 ■ 硝酸塩の還元 十 ■ ＭＲテスト − ■ ｖｐテスト − ■ インドール生産 − ■ 硫化水素の生成 − ■ デンプンの加水分解 − ■ クエン酸の利用 十 ■ 無機窒素源の利用 − ■ 色素の生成 黄緑色の色素を生成する［相］ ウ
レアーゼ 陰性 ［Ｆ］ カタラーゼ 陽性 ■ 生育の範囲 最適ｐＨ７，８（ｐＨ７〜８．５）湿
度３０〜４０°Ｇ Ｏ酸素に対する態度 通性嫌気性菌（酸素要求［相］
糖類から酸およびガスの生成の有無を記載する。

（１）Ｄ−グルコース − （２）Ｄ−ガラクトース − （３）ショ糖 （４）デンプン − 以上の菌学的性質のうち、菌の形態は短稈であるがｃｏ
ｒｙｎｅ ｆｏｒｍでないこと及びダラム染色性が陽性
であることからパージエイズ・オブ・マニュアル・オブ
・ザ・デターミネイティブ・バクテリオロジイズ第７巻
により、本菌はブレビバクテリウム属に属する細菌と同
定された。

更にその他の生理学的諸性質により、本菌はプレビバク
テリウムフスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆ
ｕｓｃｕｍ）類縁菌であると同定され、Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｆｕｓｃｕｍ Ｔ Ｓ−１（微工研菌
寄第４９０３号）と命名した。

本発明ではデヒドロコール酸より１２−ケトケノデオキ
シコール酸への変換能を有するブレビバクテリウム属に
属する細菌をデヒドロコール酸と接触させて、１２−ケ
トケノデオキシコール酸を製造するが、具体的には培養
のいずれかの時期にデヒドロコール酸を存在せしめた培
地にてブレビバクテリウムに属する上記細菌を培養して
、培養液中に１２−ケトデオキシコール酸を蓄積させる
か、あるいは上記菌株をまず、よく成育する栄養培地に
て培養して得た菌体をデヒドロコール酸と接触させ、１
２−ケトケノデオキシコール酸を生成させ、これを採取
する。

すなわち、上記菌株をまずよく成育する栄養培地で培養
し、しかる後にデヒドロコール酸を加えて反応せしめる
かあるいは培養液より菌体を分離した後、菌体なデヒド
ロコール酸の溶液あるいは懸濁液に加え反応せしめても
よい。

このように菌体を分離して使用する場合、デヒドロコー
ル酸を加えた培地で培養した菌体でなくともよい。

本発明の菌体中に生成する酵素は誘導酵素でなく構成酵
素であることが特徴である。

本発明に用いられる培地組成としては炭素源（クルコー
ス、シュクロースナト）、窒素源（コーンステイープリ
カー、肉エキス、酵母エキス、カザアミノ酸）、無機物
質（リン酸カルウム、硫酸マグネシウム）等をほどよく
含有する培地を使用出来る。

培養は培養中でデヒドロコール酸から１２−ケトケノデ
オキシコール酸に転換させる時は副反応を避けるために
静置培養が望ましい。

また振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件で
行ない、短期間に菌体な生育させ、菌体分取後、デヒド
ロコール酸と接触させ１２−ケトケノデオキシコール酸
に変換させることも出来る。

培養温度は３０℃〜３７°Ｃ１ｐＨは６．５〜８．５に
あることが好ましい。

培養時間は通常２−７日で充分である。

デヒドロコール酸を１２−ケトケノデオキシコール酸に
転換する方法としては、前述のように培養中に転換反応
をおこなわせる方法と培養後、菌体分取後、反応させろ
方法があるが、転換反応は副反応をさけるため嫌気的条
件が望ましい。

分離菌体あるいは固定化菌体で転換反応をおこなわせる
時は、反応の補酵素として使用されるＮＡ、ＤＨの再生
をおこなわせるため反応液にエネルギー源としてグルコ
ース等を添加することが望ましい。

本発明の菌体な利用する１２−ケトケノデオキシコール
酸の製造を効率的におこなうため、分離した菌体なアク
リルアマイドなどで固定化して、固定化菌体として反応
に使用することも可能である。

反応液には反応の補酵素として使用されるＮＡＤＨの再
生をおこなわせるために、反応液にエネルギー源として
グルコース等を添加してもよい。

原料であるデヒドロコール酸は水に難溶であるが、その
塩類は水に易溶であるので高濃度下での反応が可能であ
シ、逆反応は生じないので定量的な転換が可能である。

以下実施例にて説明する。

実施例 １ 水道水１ｔに対してグルコース２０ｆ、ポリペプトン１
０ ｆＩ、 Ｋ２ＨＰＯ４２グ、ＫＨ２ＰＯ４２ｔｉＩ
、寒天２グおよびデヒドロコール酸０．２７を混合し、
ｐＨ７，２に調節して培地液とし、３を容の坂ロフラス
コにて２ｔの培地を入れてデヒドロコール酸より１２−
ケトケノデオキシコール酸に変換能を有するブレビバク
テリウム属菌、プレビバクテＩＪウムフスカム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｃｕｍ）ＴＳ−１（微
工研菌寄第４９０３号）を培養した。

培養後、２０ｍ１の培養液に酢酸エチルを等量加えて抽
出する。

抽出液を１Ｍに濃縮し薄層クロマトグラフィーをおこな
った。

クロロホルム：アセトン：酢酸（５０：５０：１）の組
成の展開溶媒を用い、１０ｃｒｒｌ展開した後、風乾し
濃硫酸を噴務し、１６０℃で５分間加熱すると標品の１
２−ケトケノデオキシコール酸（メイカー・ケミカル社
製）と同一位置に同色のスポットが見られた。

原料であるデヒドロコール酸のスポットは残っていなか
った。

収率は５０％であった。実施例 ２ 実施例１と同様の培地３ｔで、６日間３４°Ｃにて実施
例１と同じ菌株を静置培養した。

その後、培養液をｐＨ２に塩酸で調節した後、２倍量の
酢酸エチルで３回抽出した。

これに硫酸ナトリウムを加え１晩放置後、濃縮した。

これをシリカゲルＧ−６０（７０〜２３０メツシユ）４
０ｇ′をつめたカラムに吸着させ（クロロホルム：アセ
トン：酢酸）からなる溶媒で溶出し、１２−ケトケノデ
オキシコール酸を含む溶出液を採取した。

これを溶媒としてクロロホルム：アセトン：酢酸＝５０
：５０：１を用い、シリカゲルＧ−６０の厚さ０．７５
．、の薄層クロマトグラフィーをおこない１２−ケトケ
ノデオキシコール酸を含む層より酢酸エチルで抽出した
。

抽出液を濃縮し、結晶化をおこない、これを更に酢酸エ
チルから再結晶をおこない、水で洗浄後、真空乾燥をお
こなった。

収量は１．５ ｆ （５０％）の結晶物質が取得された
。

本物質の同定は次の方法でおこなった。

１ 薄層クロマトグラフィーによる固定。

クロロホルム：アセトン：酢酸（５０：５０：１）の組
成の展開溶剤を用いて展開し、乾燥後、濃硫酸を噴務し
、１６０°Ｃで５分間加熱すると１２−ケトケノデオキ
シコール酸と同一位置に同色のスポットが見られた。

２ ＩＲ（赤外吸収スペクトル）による同定。

１７００ｃｍ−にＣ二〇の吸収がみられる。

又、２５００ｃｍ ’ 〜３０００ｃＷｌ ’ にか
げてＣ０ＯＨ基特有の幅広い吸収がみられる。

３０００〜３５００（７）−１に幅広いＯＨ基の吸収が
みられる。

吸収パターンは標準５−ケトデオキシコール酸とよく一
致している。

３ 質量分析による同定。

゛分子量は標準物質と同一の４０６．８である。

４ 核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨ２，ＮＭＲ）に
よる同定。

Ｃ−２１のメチル基はとなりのメチレンによるスプリン
トを示し、０．９ ｐ ｐ ｍに現われている。

Ｃ−１８及びＣ−１９のメチル基はｌｐｐｍに重なって
出現しているが、これは１２位にＣ二〇が存在すること
による。

３．４ｐｐｍにみられる幅広いピークはＣ−７位のプロ
トンを示す。

以上により１２位のカルボニル基、Ｃ−３、Ｃ−７位に
水酸基が確昭された。

５ 融点による同定。

実施例で得られた物質の融点を標準品と比較した。

（１）実施例で得られた物質 ２１４”卜２１５℃（２
）標準サンプル ２１５°Ｇ−２１６’Ｃ（３
）混晶（（１）＋（２） ） ２１４°ト２１
γＣ６元素分析による同定。

以上の同定法によシ明らかなようにデヒドロコール酸よ
り１２−ケトケノデオキシコール酸が生成していること
が証明された。

実施例 ３ 水道水１を当シグルコース２０７、ポリペプトン１０７
、酵母エキス５グ、Ｋ２ＨＰ０．２ｆ 、Ｋ２ＨＰＯ４
２グからなる培地１．５ｔに実施例１と同じ菌体を植菌
し、ミニジャファメンター（東京理化製Ｍ−１００型）
で３４℃にてＩＶＶｍ、５００ｒｐｍで３６時間培養し
最大菌体量に達した後、デヒドロコール酸０．３７およ
びグルコース７．５７を添加し、窒素ガスを吹きこみ転
換反応をおこなわせた。

反応時間３時間でほぼ完全にデオキシコール酸が１２−
ケトケノデオキシコール酸に変換していた。

反応液に２倍量の酢酸エチルを投入して抽出し、実施例
２の方法に従って精製し結晶０．２０ Ｆを得た。

実施例 ４ 水道水１を当りグルコース２０グ、ポリペプトン１０７
、酵母エキス５７、Ｋ２ＨＰＯ４２グ、ＫＨ２ＰＯ４２
ｆからなる培地１．５ｔをミニジャーフアメンター（東
糸理化製Ｍ−１００型）で３４℃ＩＶＶｍ、５００ ｒ
ｐｍの培養条件で３６時間培養し集菌した。

集菌後、水で洗浄し、ｐＨ７，８，０，２Ｍリン酸緩衝
液で菌体ｌＯＹ／ｌになるように菌体懸濁液を調製し、
これにデヒドロコール酸を０．２７加え３０°Ｃで２４
時間静置反応させた。

生成した１２−ケトケノデオキシコール酸をガスクロス
トグラフィーで測定した。

反応率は９０％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ デヒドロコール酸より１２−ケトケノデオキシコー
   ル酸への変換能を有するブレビバクテリウム属に属する
   細菌をデヒドロコール酸と接触させて１２−ケトケノデ
   オキシコール酸を製造することを特徴とする微生物によ
   る１２−ケトケノデオキシコール酸の製造法。 ２ デヒドロコール酸より１２−ケトケノデオキシコー
   ル酸への変換能を有するブレビバクテリウム属に属する
   細菌を栄養培地にて培養して得た菌体をデヒドロコール
   酸と接触させ、１２−ケトケノデオキシコール酸を生成
   させ、これを採取することを特徴とする特許請求の範囲
   １に記載される微生物による１２−ケトケノデオキシコ
   ール酸の製造法。 ３ デヒドロコール酸を含む培地にて、デヒドロコール
   酸より１２−ケトケノデオキシコール酸への変換能を有
   するブレビバクテリウム属に属する細菌を培養し、培地
   中に１２−ケトデオキシコール酸を蓄積させ、これを採
   取することを特徴とする微生物による１２−ケトケノデ
   オキシコール酸の製造法。