JPS59128205A - 多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ）産業上の利用分野 この発明は、多孔性ゲル状担体の製造法に関する。さら
に詳しくは、各種クロマトグラフィーのカラム充填材や
酵素等生体触媒固定化用として好適な活性の優れた多孔
性ゲル状担体の製造法に関する。

（ロ）従来技術 最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担体に固定
化した固定化酵素が診断用や合成用のバイオリアクター
として用いられるようになってきた。これらの固定化酵
素の製造法としては、溶融法によって予め得られたＳ　
ｉｏｚ系ガラスの表面をアルカリ処理して水酸基を生成
させ、これに例えはアミノアルキル基を導入しこれに酵
素を付加して固定させる方法が知られており実用化され
ている。

しかし上記従来の方法においてはガラス表面に水酸基を
生成させる工程が必要であり、それによって生成しうる
水酸基の単位面積当りの量は限度かあって酵素等の固定
量を増大し活性の高い固定化酵素を得ることが困難であ
った。

この点に関し、この発明の発明者は先に、アルコキシシ
ラン等の金属アルコキシドを原料としこれを加水分解し
た際に得られる多孔性のガラス様ゲル状化合物を担体と
することにより水酸基を導入する工程を行なうことなく
活性の高い固定化酵素が得られる事実を見出した。これ
は、上記ガラス様ゲル状化合物は対応する水酸化金属化
合物やその低縮合物からなるためそれ自身非常に多数の
水酸基を有しておりその結果酵素の固定化能が増加する
ものと考えられる。

Ｖ号　　発明の目的 この発明は、上記知見を更に発展させることによりなさ
れたものである。すなわち金属アルコキシドからのガラ
ス様ゲル状化合物製造の際に、フッ化水素を接触させる
ことにより、水酸化金属化合物及び／又はその縮合物に
フッ素原子が置換導入された一種のフッ化ガラス様ゲル
状化合物が得られ、その導入割合を少量とした際に得ら
れるフッ化ガラス様ゲル状化合物が、フッ素化していな
いものに比して水酸基の反応性が優れており酵素等の固
定化能かさらに増加する事実を見い出すことによりなさ
れたものである。

に）発明の構成 かくしてこの発明によれば、加水分解触媒を任意に有す
る水性溶媒中で少量のフッ化水素酸の存在下、金属アル
コキシドの加水分解を行なってガラス様ゲル状化合物を
生成させることを特徴とする多孔性ゲル状担体の製造法
が提供される。

この発明における金属アルコキシドとしては、ガラス製
造分野やセラミックス製造分野に８ける原料として知ら
れた金属のアルコキシドが種々適用でき、具体的にはＳ
　ｉ　（ＯＣ■ｓ）　４．５ｉ（００２’Ｈｓ）＋、Ｔ
ｉ（ＱＣ！ｓＨ？）＋　、Ｖ（００ＺＨ５）８　　、Ａ
ｌ（００ｓＨ７）ａ、Ｎａ００Ｈａ等の低級アルコキシ
金属が挙げられ、これらのうち低級アルコキシシランを
用いるのが通常好適である。なお、これら二種以上の混
合物を用いてもさしつかえはない。

この発明における多孔性ゲル状担体は、上記金属アルコ
キシドを加水分解してゲル状化合物とする際に、フッ化
水素を反応に関与させることにより得られる。より具体
的には加水分解触媒を任意に有する水性溶媒中に、金属
アルコキシドを混合して加水分解させつつ少量のフッ化
水素酸を添加混合した後、徐々に溶媒や触媒を除去させ
ることにより得られる。

例えば低級アルコキシシランを用いる才１合には、水を
含む揮発性の親水性溶媒（例えば含水メタノールや含水
エタノールン中でかつ酸性下（例えば、加水分解触媒と
しての塩酸等の蕪機酸を添加して１）Ｈ１〜３程度とす
るのが好ましい）の緩和な条件下（例えは室温下うでア
ルコキシドの加水分解を開始すると同時に少量のフッ化
水素酸を添加し８０℃〜１００℃程度に加温しつつ徐々
に生成アルコール、溶媒、無機酸及び未反応のフッ化水
素を蒸発しかつ充分に乾燥させることにより得られる。

なお、場合によっては水分は空気中から供給されるため
水を含ませなくてもよい。従って、この発明の水性溶媒
とは親水性溶媒自体−をも８味するものである。−万、
水のみで加水分解を行なうことも可能であるが、この場
合は加水分解が不均一になる惧れがありさらに、ゲル状
物の乾燥上不利であり好ましくない。

他の金属アルコキシドにおいても基本的に同様にして意
図する多孔性ゲル状担体を得ることができる。

かようなフッ化水素の処理により、ゲル化が促進される
と共に金属アルコキシドの加水分解物である水酸化金属
化合物及び／又はその縮合物（ガラス様ゲル状化合物〕
における一部の水酸基（エーテル結合も含む）がフッ素
原子で置換され、フッ素原子を化学的に結合した多孔性
ゲル状担体が得られる。この際置換導入するフッ素原子
は少量であることが必要である。この量としては、原料
の金属アルコキシド（１モル）に対するモル比として表
わせば０．０５〜１．０モル程度が適切であり、０．２
モル前後が最も好ましい。０．０５モル以下ではフッ素
原子導入による効果が不充分で好ましくなく　、　１．
０モルを越えると水酸化金属化合物及び／又はその縮合
物に窓ける水酸基の置換度が過剰となり以後の反応に関
与しうる水酸基の量が実質的に減少するため好ましくな
い。

このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、基本的に
多数の水酸基を有するゲル状化合物からなるため、従来
のガラスを担体とするものに比して反応性が良好である
。さらに、その水酸基やエーテル結合の一部はフッ素原
子で置換されているため、単なるゲル状化合物に比して
活性はより優れている。なお、フッ素原子の導入による
効果は、アルコキシシランで説明すれば上式（Ｄに示さ
れるように、 水酸化金属化合物やその縮合物に少量置換導入されたフ
ッ素原子の誘起効果（Ｉ効果〕によって隣接するシラノ
ールの水酸基の分極の程度が大きくなって水素原子か活
性となり、反応性がより上昇するものと信じられる。さ
らに、前述のごとくフッ化水素を合成反応に関与させて
得たゲル状化合物の多孔度は、フッ化水素の反応モル比
によって制御することができるが、いずれに８いても単
なるゲル状化合物のものよりも多孔であることからそれ
による表面積の増加による効果も加わっているものと考
えられる。

このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、そのまま
用いてもよく、所望の粒子状に粉砕して用いてもよく（
例えは、グルコースオキシダーゼ固定化カラムを作製す
る場合は１００〜２００メツシユが適切である）、液体
クロマトグラフィーやその他の各種のクロマトグラフィ
ーのカラム充填材の基材として有用であり、また、酵素
、抗原、抗体等の固定化用折体としても有用である。

なお、この発明の方法によって得られた上記多孔性ゲル
状担体ことにアルコキシシランを用いた担体を実用に供
する番こ当って、予め３００℃前後の温度で数時間熱処
理しておくことが、残留する未反応物質、不純物等の除
去や担体自体の保型強度の向上の点好ましい。たたし、
熱処理の程度が３００°Ｃ前後を越える（例えは、５０
０℃桿度）とガラス様ゲル状化合物内にシロキサン結合
が増加して測縮合物化し、活性が低下する点好ましくな
い。

３００℃前後の熱処理ではシラノール基はほとんどシロ
キサン結合に変化せず活性の低下はほとんど見られない
。

また、ゲル状担体の作製は、前記アルコキシド溶液をチ
ューブ、ネット等の基材にコーティングし１こ状態で行
なってもよく、この際、活性の優れたゲル状担体薄膜を
形成することができる。

この発明の方法によって得られたゲル状担体にシランカ
ップリング剤を反応させ、その反応物に酵素を固定化す
ることにより固定化酵素を得ることができる。

上記ゲル状担体に反応させるシランカップリング剤とし
ては、アミノ基、チオール基、エポキシ基などの官能性
基を有する当該分野で公知のシラン誘導体が適用でき、
具体的にはγ−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ
−クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリエト
キシシラン、γ−グリシドキシプロビルトリメトキシシ
ラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピル
トリメトキシシラン等が使用される。かようなシランカ
ップリング剤との反応は、当該分野で公知の条件下で行
なわれる。例えばγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを用いた場合、このカップリング剤を水に溶解して約
１０％水溶液としかつｐＨを３〜５に調整した後、この
溶液に充分に乾燥された前記ゲル状担体又はその粉砕物
を加え加温上混合して数時間処理した後水洗して未反応
のカップリング剤を除去することにより得られる。

上記、シランカップリング剤を導入したゲル状担体は、
それ自身従来のガラスに導入したものに比して担体とし
て多くのカップリング基を有しており、酵素等との反応
活性が高く固定化酵素用担体やカラム充填材として有用
なものである。

このようにして処理されたゲル状担体Ｇこ公知の方法で
酵素が固定化される。例えは、カップリング剤としてγ
−アミノプロピルトリエトキシシランを用いてアミノア
ルキル基を水酸基にエステル結合で多数導入したゲル状
担体を用いる場合、上記アミノアルキル基にグルタルア
ルデヒドを用いてアルデヒド基を有するシッフベースを
導入し、これに酵素等を接触させてアルデヒド基と酵素
等のアミノ基間でさらにシーツベースを形成させて結合
することにより固定化を行なうことができ、これ以外に
もアミノアルキル基をジアゾ化して芳香族アミノ基を導
入しこれに酵素等を固定化してもよく、マたカルボジイ
ミドを用いてアミノアルキル基と酵素等との間に直接ペ
プチド結合を行ない固定化を行なってもよく酵素等の種
類に応じて適宜選択すればよい。他のカップリング剤使
用時にも同様に直接又は適宜変換したカップリング基に
よって酵素等を固定化することができる。また、ブロモ
シアン等で活性化することによっても容易に固定化する
ことができる。

固定化用の酵素としては具体的にはグルコースオキシダ
ーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレアチニナーゼ、０
ｏＡ−シンテターゼ、０ＯＡ−オキシダーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ、コレステロールヒドロラーゼ等が
挙げられるが限定されることはなく、抗原や抗体その他
生体触媒を固定化することもできる。

このようにして得られた固定化酵素は従来の固定化酵素
と同様に、種々の形態で診断用や合成用のバイオリアク
ターとして有用であり、さらに従来の固定化酵素に比し
て押体当りの酵素等の固定量は多くバイオリアクターと
しての能力が増大されたものである。

（ホ）発明の効果 以上述べたように、この発明の方法によれば、各種クロ
マトグラフィーのカラム充填材や酵素等生体触媒固定化
用として好適な活性の優れた多孔性担体を簡便に得るこ
とができる。ことに担体としては従来のガラス担体に比
して製造コストは１／１０　ＪＵ下と極めて安価である
。

（へ）実施例 以下、この発明を実施例により説明する。

実施例１（多孔性ゲル状担体の製造〕 テトラエトキシシラン５ｉ（００２Ｈｓ）４０．５２モ
ル、エタノール１．７２モル、水１．８２モル、塩酸０
．０２８モル及びフッ化水素ｆｉ　０．０５８〜０．１
１５モルの混合物（ｐＨ約１）を室温下で均一になるま
で数十分混合攪拌した。

次いで８０°Ｃのウォーターバス中で３昼夜加熱して加
水分解反応で生じたエチルアルコール、水及び残存する
塩酸や未反応の微量のフッ化水素酸を蒸発することによ
り約３０ｙの多孔性ゲル状担体を得た。

（アミノアルキル化〕 上記で得られたゲル状担体を粉砕して１２０／２００メ
ツシユのビーズを得た。

５　ｗｔ　％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラン
水溶液を５Ｎ塩酸でｐＨ３，５に調整し、この溶液４５
ｍＫに対し上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入し、さ
らにｐｎ　　３．５になるように調整した。

この混合物を、攪拌機、温度計、ジムロートを付設した
四ツ目フラスコに入れウォーターバスで温度を７５℃に
保ち、攪拌させながら３時間反応を行なった。反応終了
後、ビーズを吸引メンブランフィルタ−に移し、１１の
蒸留水で未反応のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを除去した後、デシケータ−で乾燥させてアミノアル
キル化ゲル状担体を得た。このアミノアルキル化ゲル状
物はデシケータ−内で保存する。

（酵素の固定化） 上記アミノアルキル化ゲル状担体（ビーズ状〕を二官能
性のグルタルアルデヒド（２，５ｗｔ　　％）のリン酸
塩緩衝溶液（ｐＨ７，０）に浸漬し、アスピレータ−で
減圧させつつ約３０分攪拌下反応させた。続いてさらに
約３０分常圧で攪拌不反応させた。反応温度は３０℃で
あった。これをｐＨ７，０のリン酸塩緩衝液で充分に洗
浄し、乾燥させた。

この処理によりゲル状物にアルデヒド基を有するシッフ
ベースが導入される。

得られたゲル状物１ｇを１η／艷（グルコースオキシダ
ーゼ／　ｐＨ７，０リン酸塩緩衝液）１〇−中に浸漬し
、２５°Ｃ下ます３０分減圧下で緩やかに撹拌して反応
を行ない、続いて６０分常圧下で緩かに攪拌して固定化
反応を行なった。この処理によりグルコースオキシダー
ゼのアミン基が反応に関与し、担体（ゲル状物）のアル
デヒド基とさらにシッフベースを形成し固定化される。

このようにしてグルコースオキシダーゼ固定化ゲル状物
（固定化酵素）が得られた。

このようにして得られた固定化酵素の活性の経時変化を
ポーラログラフイーで測定した結果を第１図に示す。な
お測定条件は以下の通りである。

試験　液：β−Ｄ（＋）−グルコ−７、３００１ｎ？測
定温度＝２８°Ｃ 保存温度：４℃ なお、測定は固定化酵素１ｇを試験液１１＋ｎｅと共に
５分間攪拌混合し、その１０　ｍｌ、をメンブランフィ
ルタ−で沢別した後滴下水銀電極によるポーラログラフ
イーで行なった。酵素反応で発生したＨ２Ｏ２の半波電
位は０．８５Ｖ（ｖすＡｙ／Ａｙ　Ｃ１電極とした。

このように２ケ月半を経過してもその活性に変化は見ら
れなかった。

−１、フッ化水素酸を用いない以外同材にして作製した
ゲル状担体を用い同様に処理して得た固定化酵素との比
較を行なった結果を第２図に示す（■は実施例、■は比
較例）。このように、フッ素原子を導入しない同様な固
定化酵素に比してこの発明のゲル状担体を用いた固定化
酵素は約２．５倍の活性を有することか判る。

実施例２ 実施例１と同様にしてＨＦ／Ｓ　ｉ　（ＯＣ２Ｈ５）　
４かモル比で０．１〜０．５の条件下で反応を行ない多
孔性ゲル状担体をそれぞれ得た。これらの担体について
前記と同様にしてグルコースオキシダーゼを固定化して
固定化酵素を得た。これらの固定化酵素の活性と前記モ
ル比との関係を第３図に示す。なお活性の測定も前記に
準じた。

このように、酵素活性が担体製造時のフッ化水素酸の量
に影響を受けており、ことにモル比が０２近傍で最大活
性（ブランクに比して約７倍程度）が示されていること
が判る。また、担体製造時に塩酸等の無機酸を添加する
ことが好ましいことか判る。

なお、モル比０．１及び０．５の際に得られる多孔性ゲ
ル状担体のＳＥＭ像（２００００倍）を第４図及び第５
図に示した。また、第６図はフッ素原子を導入していな
い多孔性ゲル状担体のＳＥＭ像（２００００倍〕である
。このように、この発明によって得られる担体はその表
面の多孔度もフッ素原子を導入していないものに比して
より多孔であることが判る。

実施例３ 実施例２で得られた多孔性ゲル状担体（ガラスピーズ状
）のＥＳＯＡ　（Ｘ線光電子スペクトル）による分析チ
ャートを第７図に示す（Ａは走査速度２　ｅＶ／ｓｅｃ
であり、Ｂは走査速度１　ｅＶ／ｓｅｃである）。

なお、ＥＳＣＡの測定条件は以下の通りである。

ターゲット：Ｍｇ 加速電圧’８ｋＶ フィラメント：３０ｍＡ Ａｒエツチング条件：加速電圧　２　ｋＶエミッション
　　３０　ｍＡ 時　　　間　　１５分 このように、結合エネルギーが７００　ｅＶ近傍にフッ
素原子によるピークが観察されることから、フッ素原子
が化学的に結合していることが判る。

また、表１は、ＨＰ／Ｓ　ｉ　（００ｎＨｓ　）　４が
モル比で０．１のときの担体のＥＳＣ！Ａのスペクトル
のＦｌｓとＳ　ｉｚ３ビークの強度比をバルクステート
とパウダーステートで比較したもので、両者の強度比の
値が近接していることから、この発明の多孔性ゲル状担
体は、表面のみならす全体がフッ素化合物になっている
ことが判る。

表　　　　１ 実施例４ テトラエトキシシラン１モル、エタノール３．５５７モ
ル、水３．７５９モル、塩酸０．２８モルを順次混合し
激しく攪拌して均一なゾルを得、これにフッ化水素＠０
．２モルを混合し実施ｆｌｌ　１と同様にして固形状の
ガラス様多孔性ゲル状担体を得た。

この多孔性ゲル状担体について３００℃及ヒ５００°Ｃ
での熱処理の影響を調べた。ｆなわち１２０／２００メ
ツシユに粉砕した担体５００■をそれぞれ電気炉中で３
００°Ｃ及び５００°Ｃ下３時間熱処珪した後、実施例
１のようにアミノアルキル化及びグルコースオキシダー
ゼの固定化を行なった。得られた固定化酵素の固定化率
（固定化前の酵素溶液と固定化後の酵素溶液におけるタ
ンパク量をＬｏｗｒｙ法で求め、ｌｉ＋７１者の差を差
引いて決定した）を測定した。

この結果を、比較例と共に第１表に示す。

第１表 一方、アミノアルキル化及び固定化前のそれぞれの担体
〔フッ化水素未処理担体・・・（４）、熱未処理担体・
・・（１１、３００°Ｃ熱処理担体・・・（０）　］に
ついて熱重量分析（ＴＯ）　７ｉ−行なった結果を第８
図に示し、微分熱重量分析（ＤＴＧ　）を行なった結果
を第９図に示す。

図に示すように、フッ化水累で処理した担体３００℃稈
度の熱処理ではシラノール基はほとんどシロキサン結合
に変化せす、また吸着水分量も非常に小さいことが判る
。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明で得られた固定化酵素の活性の経時変
化を示すグラフ、第２図は同じくグルコースの濃度に対
する活性の変化を比較例と共に示すグラフ、第３図はこ
の発明で得られた担体を用いた固定化酵素におけるフッ
素原子堝入による彰鞄を示すグラフ、第４図及び第５図
はこの発明で得られる多孔性ゲル状担体の多孔性表面を
それぞれ例示する走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ　）による
拡大写真、第６図は比較例のゲル状担体の多孔性表面を
例示するｓｍｒによる拡大写真、第７図は仁の発明で得
られる多孔性ゲル状担体のＥ８０Ａスペクトルを例示す
るグラフ、第８図及び第９図はこの発明で得られる多孔
性ゲル状担体の熱処理の影響をそれぞれ比較例と共に示
すＴＧチャート図及びＤＴＧチャート図である。 第１図 第２図 り°′ルコースε農度（ｍｇ／ｄｌ） 第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）加水分解触媒を任意に有する水性溶媒中で少量の
   フッ化水素酸の存在下、金属アルコキシドの加水分解を
   行なってガラス様ゲル状化合物を生成させることを特徴
   とする多孔性ゲル状担体の製造法。