JPS59102393A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、改良された固定化酵素の製造方法に関するも
のである。

本発明の方法により製造された固定化酵素は、優れた活
性と著しく増大した使用安定性を有するものである。

近年、酵素の工業的利用の面から酵素を固定化する為の
種々の方法が提案されている。本発明者らもｌ侍開昭５
５−３９７１９号、同５７−１６６９８３号等の方法を
提案したが前者では、使用する酵累イ・Ｈ＋、基グ！を
溶液によっては固定化凸ン素の使用安定性が劣り、長期
間使用すると酵素活性が低下する等の問題があり、一方
後者では、強度の良好な高活性の膜状の固定化酵素を得
ることができず、ゲル担体内部での反応物、生成物の内
部拡散速度が小ざい為反応時間が長い等の為特に醇素電
祢センサーとして使用することができなかった。

本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ね
た結果、特定の担体を用いこれに酵素を担持した後に少
なくとも酵素担持部を常温硬化性ブロックトイソシアネ
ート化合物で被覆することにより、優れた酵素活性と著
しく増大した使用安定性を有する固定化酵素を般造でき
ることを見い出し本発明を完成した。

即ち、本発明は、塩化ビニル樹脂を一種または二種以上
の溶媒（５）に溶解して該樹脂濃度を２〜２５取量％の
溶液とし、該溶液を塩化ｐニル樹脂の貧溶媒でかつ溶−
媒（４）の良溶媒となる一種またはニセ（１以上の溶炉
ｃ−（Ｂ）中に浸漬して得られた担体を酵素を含む液に
接触させた後下記常温硬化性ブロックトイソシアネート
化合物の水溶液に接触させることを特徴とする固定化酵
素の製造方法 常温硬化性ブロックトイソシアネート化合物：ポリイソ
シアネートと親水性ポリオールプレポリマーとを反応さ
せて得られる遊離のＮＣＯ基を２個以上有するウレタン
プレポリマーと、分子中に−Ｎ　＝　Ｃ−Ｎ　Ｈ−骨格
を有する複素環式化合物、ヒドロキシピリジン、ヒドロ
ギシキノリン、及びｐＫａが５〜９．５のフェノールか
ら選ばれるイソシアネートブロッキング剤とを、該ウレ
タンプレポリマーのＮＣＯ基に対する該イソシアネート
ブロッキング剤のＯＨ基及び／又はＮＨ基の当量比が０
．２〜２になる割合において反応させて得られる常温硬
化性ブロックトイソシアネート化合物を提供するもので
ある。

本発明の方法で製造される固定化酵素は、特に膜状で使
用するに好ましいものであり、例えば酵素センサー等と
して用いることができる。

本発明の方法による固定化酵素は、製法が簡単で優れた
酵素活性と著しく増大した使用安定性を有するものであ
るので長期間安定に使用可能であり、又乾燥状伸で保存
後復水して使用する場合も親水性ポリマーで被覆されて
いる為、含水状態への復帰も早く取扱いが容易である。

次に本発明の実施態様を詳述する。

（塩化ビニル樹脂担体） 本発明の方法に用いられる塩化ビニル樹脂担体は、特開
昭５５−３９７１９号公報記載のものを用いることがで
きる。

特に好ましくは、Ｆ益化ビニル樹脂担体は以下の様にし
て製造される。

先ず塩化ビニル樹脂をジメチルホルムアミドなどの溶媒
■に溶解し、これを所望の担体形状に形成した後溶媒（
Ｂ）への浸漬処理を行なう。

本発明の上記塩化ビニル樹脂（ＰＶＲ）としては、ポリ
塩化ビニル（ＰＶＣ）、塩化ビニル共重合体、これらと
他の樹脂とのブレンド物があり、塩化ビニル共重合体と
しては、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニリ
デン、エチレン、アクリル酸、アクリロニトリルなどと
の二元または三元以上の共重合体がある。

溶媒囚は、ＰＶＲを溶解できる溶剤であって、ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭ
Ａ　）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ−ＭＰ　）、ヘキサ
メチルホスフォアミド（ＨＭＰＡ）、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、アセトンとベンゼンの混合溶媒などがあ
る。ＰＶＲ溶液のａ＝としては１〜３０重量％のものが
用いられる。酵素等の固定膜が優れた吸着活性を発揮し
て機能するためにはＰＶＲの重合度が約１０００におい
て６〜１２重量％が好ましい。

次に、かくして得たＰＶＲ溶液を所望の担体形状に形成
した後、ＰＶＲの貧溶媒であり且つ溶媒（４）の良溶媒
となる溶媒の）と接触させて担体層を形成する。この際
、溶媒ＣＢ）との接触はＰｖＲ溶液層が白化する前に行
なうことが好ましい。ここで白化する前とは、ＰＶＲと
溶媒囚の溶液が目視できる白濁を生じて不透明となる壕
での期間である。

溶媒（Ｂ）としては水、アルコール系溶媒、エーテル系
溶媒などがある。

アルコール系（６媒としては、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ　−フ
ロビルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、！ＩＩＱｃ
−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ　−）ｆルアルコールナ
ト（７）　−価アルコール類、エチレングリコール、ジ
エチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール
類、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレン
クリコールモノエチルエーテルナトのグリコールモノエ
ーテル類などが用いられる。浸漬する溶媒としてはこれ
らアルコール系溶媒単独またはアルコール系溶媒を５０
重量％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合浴６’ｉ
’ｊであってもよい。

殊ニ、メチルアルコール、エチルアルコールを用いた場
合には、固定化酵素活性の大きい固定化物が９４１られ
好ましい。

なお、Ｉ３　Ｖ　Ｒと浴Ｗ＝（ＡＪの溶液には、担体の
膨部の度合の調整すなわち担体の含水率の調節、孔径の
調整等のために、ポリエチレングリコール等のＰ　Ｖ　
Ｒに対し非溶媒性の化合物を添加することができる。

担体形状としては膜状、管状、試験管状、ビーズ状等種
々の形状をとることができる。酵素電極等の用途には特
に膜状が好ましい。膜状担体はＰＶＲ溶液を流延し、そ
の後溶媒（１３）に接触し、管状担体：１管状支持体の
内壁に溶液薄膜層を形成し、その後溶媒（Ｉ３）に接触
し、試験管状１■体の場合には試験管の内壁に溶液薄膜
層を形成し、その後溶媒（Ｂ）に接触し、ビーズ状担体
の場合にはＰ　Ｖ　Ｒ溶液を空気中に噴霧した後溶媒（
Ｂ）に浸漬して形成する。

この際、担体の強度を向上させる為膜状担体の場合に（
・よ不織布等の、ビーズ状担体の場合には多孔性の球状
体等の補強材を用いてもよい。

なお担体の形成後、担体を水中に浸漬して溶媒（Ｂ）を
水と置換することが好ましい。

次に上記担体と酵素を含む液を接触することによって固
定化酵素を得る。酵素を含む溶液の濃度は１〜５００ツ
／ｄ７！が用いられ、好ましくは２０〜２ｏｏｒｒｑ／
ｃｔｔであり、酵素はｐＨ緩衝溶液中に溶解して浸漬処
理を行なう。

（固定化される酵素） 固定化きれる酵素には特に制限はないが、例えば仄の様
なものが挙げられる。

酸化還元酵素 アミノ酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、カタラーゼ、グル
コースオキシグーゼ、グルコース−６＝リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダー
ゼ、コレステロールオキシダーゼなど、 転移酵素 アスパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ、グルタミ
ン酸オキザロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、タレアチ
ンホスホキナーゼ、ヘキソキナーゼなど、 〃口承分解酵素 一アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、トリプシン、β−グルクロニダーゼなど、 リアーゼ アスパルターゼ、フマル酸ヒドラターゼ、フマラーゼな
ど、 異性化酵素 グルコースインメラーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、乳
酸ラセマーゼなど、 リガーゼ アスパラギンシンターゼ、グルタチオンシンターゼなど
、 （常温硬化性ブロックトイソシアネート化合物）本発明
の方法に用いられる常温硬化性ブロックトイソシアネー
ト化合物は、特開昭５６−５９８３２号、同５６−１１
０７１７号又は同５７−１６６９８３号記載の常温硬化
性ブロックトイソシアネート化合物（常温水硬性ウレタ
ンプレポリマー又は常温水硬性ブロックトインシアネー
ト等と記載されていることもある）を用いることができ
る。

常温硬化性ブロックトイソシアネート化合物は、ポリイ
ノシアネートと親水性ボリオールプレボリマーとを反応
させて’？Ｈられた分子中に遊１’ｆｌＧイソシアネー
ト基を２仙以上有するウレタンプレポリマート特定のイ
ソシアネートブロッキング剤と全反応させて１１ノられ
るものである。

ポリイソシアオ・−トとしては、例えば２，６−ドリレ
ンジインシアネート、２．４−）リレン・ジイソシアネ
ート、ジフェニルメタン−４，４′−ジイソシアネート
、キノリレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシー
ｒネート、ポリフェニレンジイソシアネート、１１６−
ヘキサメチしノンジイソ・ン−ｒｓ−−ト、インホロン
ジイソシアネートが、得らＪしるフ゛ロックドイノシア
ネート化合物の硬化時間、安定性及びコス］・等の面か
ら好ましい。

次に、親水性ポリオールプレポリマーとしては、次の（
イ）〜（ホ）に挙げたものが好ましい。

（イ）分子量が１００　ｔ１〜２０００ｎのエチレンオ
キナイド付加重合体・ （ロ）エチレンオキサイドと炭素数３〜６個のアルキレ
ンオキサイド５０モル％以下との共重合付加体であって
、分子量が１０００〜２００００のポリエーテルポリオ
ール。

（ハ）脂肪族アミン、脂肪族アミド、ジカルボン酸又は
多官能性アルコールとエチレンオキサイドとの付加物で
あって、分子量が１０００〜２００００のもの。たとえ
ばヤシ油アミン、大豆油アミン、牛脂アミン、ステアリ
ルアミン、エチレンジアミン、テトラメチレンジアミン
、ヘキサメチレンジアミン、ピペラジン、水添牛脂アミ
ド、オレイルアミド、フタル酸、マレイン酸、コハク１
Ｆ、マロン酸、アジピン酸、トリメチロールプロパン、
グリセリン等の各エチレンオキサイド付加物。

に）脂肪族アミン、脂肪族アミド、ジカルボン酸又は多
官能性アルコールと、エチレンオキサイド及び炭素数３
〜６個のアルキレ／オキサイド５０モル％以下との付加
物で分子量が１０００〜２００００のもの。たとえばヤ
シ油アミン、大豆油アミン、牛脂アミン、ステアリルア
ミン、エチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘ
キサメチレンジアミン、ピペラジン、水添牛脂アミド、
オレイルアミド、フタル酸、マレイン酸、コハク６だ、
マロン酸、アジピン酸、トリメチロールプロパン、グリ
セリン等ト、エチレンオキサイド及び炭素数が３〜６個
のアルキレンオキーリ゛イド５０モル％以下との付加物
〇（ホ）分子量が１０００〜２００００のポリエステル
ポリオール。だとえはテトラメチレングリコール、ポリ
エチレングリコール等ト、フタル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、マロン酸、アジピン酸等との共エステル化物に、
さらにエチレンオキサイドを付加したもの、或いは分子
量２００以上のポリエチレングリコールと７タル酸、マ
レイン酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸宿との共エ
ステル化物で末端ＯＨ基を有するポリエステルポリオー
ルであって、いずれも分子針が１０００〜２００００の
もの。

本発明におけるウレタンプレポリマーヲ得るには、上記
のポリイソシアネートと上記の親水性ポリオールプレポ
リマーとを、ポリイソシアネートのＮＣＯ基に対する親
水性ポリオールプレボｌ）　マーの０１（基の当量比（
ＯＨ／ＮＧＯ）が０．５〜１．０になる割合において、
２０〜１２０℃の温度で１〜５０時間反応させればよい
。そのウレタンプレポリマーは分子中に遊離のＮＣＯ基
を２個以上有するものであって、分子量１０００〜２０
０００のものになるようにするのが特に好捷しい。

次に、本発明におけるインシアネートプロツキング剤は
、分子中に−Ｎ＝Ｃ−ＮＨ−骨格を有する複素環式化合
物が好ましく、具体的にはイミダゾール、ベンズイミダ
ゾール、２−メチルイミダゾール、２−エチルイミダゾ
ール、２−メチル−４−エチルイミダゾール、２−フェ
ニルイミダゾール、２−メチルイミダシリン、２−クロ
ロ−４，６−ビスエチルアミノ−Ｓ−トリアジン等が挙
けられる。

次に、本発明における常温水硬性ブロックトイソシアネ
ート化合物は、上記のウレタンプレポリマーと上記のイ
ソシアネートブロッキング剤とを、ウレタンプレポリマ
ーのＮＣＯ基に対するインシアネートブロッキング剤の
ＯＨ及び／又１ｄ　Ｎ　Ｈ基の当漬比〔すなわち（ＪＪ
（、／ＮＣＯ，Ｎ）（／ＮＣＯ。

又は（ＯＨ＋ＮＨ）／ＮＣ０）が帆２〜２になる割合で
反応さすて得られるが、その反応栄件は、温度（）〜１
５０℃で１〜５０時間、好ましくは温度５０〜９０℃で
１〜４時間でおる。

得られた常温硬化性ブロックトイソシアネートの水浴液
を前記固定化酵素に被覆し、常温で２０分乃至１日放置
することによりウレタンプレポリマーで被覆された固定
化酵素が得られる。該ブロックトイソシアネート化合物
の水溶液の４度は５〜９５市恒％、好ましくは２０〜６
０重お％で用いられ、また水溶１ｆｆｌの代りにｐＨ緩
衝溶液を使用することもできる。１１ｍする方法は任意
の方法が採用されるが、担体が膜状体の場合は塗布法、
浸漬法、管状又は試験管状体の場合は管又は試験管智の
内壁に該ブロックトイソシアネート化合物の水溶液を流
入させ、またビーズ状体の場合には浸漬法哲が使用され
る。該ブロックトイソシアネート被膜の厚みは通常約１
μ〜約１０μである。

本発明の方法で製逮される固定化酵素の用途の例は次の
とおりである。固定化酵素膜は酸素電極、過酸化水素電
極、二酸化炭素電極、アンモニウムイオン電極などの電
極に装着することにより酵素センサーとして使用できる
。又固定化酵素管状体は固定化酵素反応装置として臨床
検査分野での分析計への前処理反応部として使用でき、
ビーズ状固定化酵素は医薬品合成、食品加工切の分野で
の充填型反応装置として使用できる。

次に実施例、比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明す
る。

実施例１ ［，１）　　ブロックトイソシアネートプレポリマーの
製造 分子量ｘｏｏｏのポリエチレングリコール７０７ｆｚ拓
部とトリレンジイソシアネー）３０ｍ賛部を反応させ未
反応のトリレンジイソシアネートを５．６モル％含むイ
ンシアネートプレポリマーを得た。このインシアネート
プレポリマー中の遊離のＮＣＯ基は８．６モル％であっ
た。

次いでこのインシアネートプレポリマー８７重尾部にイ
ミダゾールを１３町量部添加し、攪拌下、９０℃、３時
間反応させてブロックトイソシアネートプレポリマーを
得た。

［ｎｌ　　固定化酵素膜の製造 塩化ビニル樹脂（重合度１０００）８重置部、ジメチル
ポル中アミド溶媒９２重量部より均一な溶液を調製し、
この溶液の一部をポリエステル製不織布（日本バイリー
ン■製、膜厚約３８μｍ）をおいた２０Ｘ２０ｃＪｎの
ガラス板上に流延し、直ちにメタノール浴中ヘガラス板
ごと３０分間浸漬した。その後これを水中に入れ水置換
を行った。

次に膜を直径９門の円形に打ち抜き（膜厚６５μｍ）、
グルコースオキシダーゼ（東洋紡績社製）溶液（０，１
モルリン酸塩バッファー、ｐＨ５，６の１００Ｗ／　ｄ
ｉ　）　Ｏ，ｆ５　ｍｅ中に４℃に２４時間浸漬した。

この膜を前記インシアネートプレポリマーの２０重量％
水溶液（０，１モルリン酸塩バッファー、ｐｉ−１５，
６）に５分間浸漬した後、室温下、４時間放置してウレ
タンポリマーで被覆された固定化酵素膜を１１ｔだ。こ
の同別化酵素膜の酵素活性は２７０　ｍＵ　／　ｔｒＩ
であった。

尚、酵素活性の測定は、酵素反応により生じたＨ２Ｏ２
をペルオキシダーゼ存在下、３−メチル−２−ペンゾチ
アゾロンヒドラプンとジエチルアニリンを酸化縮合させ
、生じたインダミン色素を吸光度５９０ｎｍで測定した
。ＩＵ（ユニット）は３７℃、ｐｌ（５゜１において１
分間に１マイクロモルノβ−Ｄ−グルコース’＆Ｄ−グ
ルコンＨトＨ２０２に酸化する活性量とした。

次にこの固定化酵素膜を過酸化水素電極（例えば、Ｅｎ
ｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｅｈｎｏｔ、　、１９
８１、Ａ３．３２６　参照）に装着し、酵素電極を作製
した。

叫　グルコースの定量 上記酵素電極を３７℃、ＰＨ５，６の０．１モルリン酸
塩バッファー液０．９９ｍＡ！を入れたセルに浸漬し、
次にＯ〜１０００　ｍｙｌｄｔの各種濃度のグルコース
標準液１０μｔを攪拌しながら、マイクロディスベンザ
−を用いてセル中に投入し、酵素反応を１５秒間行なわ
せて発生した過酸化水素の酸化電流をポーラログラフ法
により測定したところ、グルコース濃度と電流値の間に
良好な直線関係が得られた。次に３７℃、ｐＨ５，６の
０．１モルリン酸塩バッファー液帆９９ｍ１を入れたセ
ルに、１５０η／　ｃｔｅのグルコース標準液１０μｔ
を投入し、約２０００回、２ケ月測定を繰り返した。そ
の結果２ケ月後においても電極活性の低下は認められず
、使用安定性は良好であった。

実施例２ 実施例１０ＦｌｌｌにてＷだ塩化ビニル樹脂膜を直径９
ｍｍの円形に打ち抜き（膜厚６５μｍ）、ウリカーゼ（
東洋紡績社製）溶液（０，０５モルホウ酸塩バッファー
、ｐＨ８，５の］　００　Ｔｒｑ／ｄｅ　）　０．３　
ｍｌ中に２４時間浸漬した。この膜に実施例１の［Ｉ］
にて得たイソシアネートプレポリマーの４０重険％水溶
液を塗布し、室温下、４時間放置してウレタンポリマー
で被僅された固定化酵素膜を得だ。この固定化酵素膜を
オーリング（Ｊ　Ｉ　Ｓ　−Ｗ−１５１６−５、内径６
．０７ｍ）に接着後、室温にて２日間風乾して乾燥固定
化酵素膜を得た。この膜を１０ケ月間冷蔵庫にて４℃で
保存後、約３分、０．０５モルホウ酸塩バッファー、　
　ｐＨ８，５）の溶液に浸漬して湿潤状態にもどし、酵
素活性の測定をしたところ、乾燥前の活性１１０　ｍＵ
／ｃｒｌに対し、１０５ｍＵ／ｃＡと保存安定性も良好
で、乾燥状態から湿潤状態への復帰も早かった。

なお酵素活性の測定は、尿酸の２９３肌における紫外部
吸収法により行なった。尚、ＩＵ（ユニット）は２５℃
、Ｉ）Ｈ８，５にて１分間に１マイクロモルの尿酸をア
ラントインに変える活性量である。

比較例１ グルコースオキシダーゼ（東洋紡Ｍ　社ＩＩ→５００ｍ
Ｗ　／　ｄｉ　、上記実施例１のＥｌ］記載のブロック
トインシアネートプレポリマー４０重カｌｓ％濃度の０
．１　モルリン酸塩バッファー（ｐＨ５，６）溶液を調
製し、この溶液の一部をポリエステル製不織布（日本バ
イリーン■製、膜厚約３８μｍ）をおいた２０Ｘ２０ｃ
ｍのガラス板上に流延し、室温下に１日放置後、０．１
モルリン酸塩バッファーにて洗浄を行ない膜厚約４０μ
ｍの固定化酵素膜を得た。この固定化酵素膜の酵素活性
は１５　ｍ　Ｕ　／　ｃｒｔｌと非常に低かった。

次に実施例１の（Ｉｌｌと同様にしてこの固体化酵素膜
を過酸化水素’ｔｌＩ：極に装着して酵素電極を作成し
、グルコースの定員を実施したところ、出力が低くグル
コースの定量はできなかった。

特８Ｆ出願人　　三菱油化株式会社 代理人　弁理士　古　川　秀　利 代理人　弁理士　長　谷　正　久

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）塩化ビニル樹脂を一種または二押以上の溶媒（４
   ）に溶解して該樹脂濃度を２〜２５重量％の溶液とし、
   該溶液を塩化ビニル樹脂の貧溶媒でかつ溶媒囚の良溶媒
   となる一種または二４１１１以上の溶ｈ　（Ｂ）中に浸
   漬して得られた担体を酵素を含む液に接触させた後下記
   常温硬化性ブロックドイソシアネ−１化合物の水溶液に
   接触させることを特徴とする固定化酵素の製造方法。 常温硬化性ブロックトイソシアネート化合物：ポリイソ
   シアネートと親水性ポリオールブレポリマーとを反応さ
   せて得られる遊離のＮＧＯ基を２個以上有するウレタン
   プレポリマーと、分子中に−Ｎ＝Ｃ−ＮＩ（−骨格を有
   する複素環式化合物、ヒドロキシピリジン、ヒドロキシ
   キノリン、及びｐＫａが５〜９．５のフェノールから選
   ばれるイソシアネートブロッキング剤とを、該ウレタン
   プレポリマーのＮＣＯ基に対する該イソシアネートブロ
   ッキング剤のＯＨ基及び／又はＮＨ基の当量比が帆２〜
   ２になる割合において反応させて得られる常温硬化性ブ
   ロックトイソシアネート化合物。
2. （２）　　インシアネートブロッキング剤が分子中に−
   Ｎ＝Ｃ−ＮＨ−骨格を有する複素環式化合物である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。