JPS59109175A - 固定化酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化酵素およびその製造方法に関するもの
である。

本発明によると極めて高活性の固定化酵素が得られる。

本発明により得られる固定化酵素は、医療用分析計等の
酵素センサー等として有用である。

従来、生体試料中の物質を選択性よく定量する方法とし
て、固定化酵素を用いた分析法が種々提案されている。

これらの方法は、酵素のもつ基質特異性と高い触媒活性
とを利用して、多成分液中の微量成分の検出に有効な手
段である。

トランスアミナーゼは、アミノ酸のアミノ基転移を触媒
する酵素で、その内、グルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（以下ＧＯＴと略記する）は心筋、肝、骨
格筋、腎に多量に含まれ、グルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（以下ＧＰＴと略記する）は肝、腎に多
量に含まれている。このＧＯＴ又はＧＰＴの測定は、急
性ウィルス性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝腫瘍、急性ア
ルコール性肝炎等の肝疾患、胆のう、胆管炎、胆石症等
の肝外閉塞性黄痕、心筋価基、進行性筋ジストロフィー
、感染性疾患等の診断に有用な役割を果し、ＧＯＴ又は
ＧＰＴを簡便に精度よく測定することは臨床的に童義が
大きい。

従来、ＧＯＴの測定方法としては基質のアスパラギン酸
とα−ケトグルタル酸に試料を加え、生成したオキザロ
酢酸をリンゴ酸脱水素酵素と補酵素ＮＡＤＨの存在下で
共役させ、このときのＮＡＤＨの３４０１の吸光度の減
少を初速変法で測定するカルメン法と、上記の様に生成
したオキザロ酢酸を２，４−ジニトロフェニルヒドラジ
ント反応させヒドラゾンを生成させて、これをアルカリ
性にしてキノイドを作り発色させるライトマン−フラン
ケル法がある。しかしカルメン法では使用する試薬が不
安定でありまた恒温セルを付属きせた特殊な分光光度計
が必要である等の問題がある。

一方、ライトマン−フランケル法では基質のα−ケトグ
ルタル酸も発色して生成物の発色を妨害するため、基質
量を極度に減らす必要があり更に検量線が変曲すること
や測定可能範囲が狭い等の欠点がある。

またＧＰＴの測定方法には、基質のアラニンとα−ケト
グルタル酸に試料を加え、生成したピルビン酸を乳酸脱
水素酵素と前記ＮＡＤＨの存在下で共役させ該ＮＡＤＨ
の減少を測定するカルメン法と、上記の様に生成したピ
ルビン酸に２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを作用
させて発色させるライトマン−フランクル法がある。し
かしこれらの方法にも上記ＧＯＴの測定方法と同様の欠
点がある。

これらの欠点を解決する目的で最近、ピルビン酸オキシ
ダーゼ（ＰＯＰと略記する）を利用してＧＰＴ、ＧＯＴ
を分析する方法が開発されている。

たとえばＧＰＴの測定方法としては、基質のアラニンと
α−ケトグルタル酸に試料を加えピルビン　５− 酸を生成する反応と、生成したピルビン酸をＰ。

Ｐと所要基質の存在下に酸化するピルビン酸酸化反応と
を共役させ、ピルビン酸酸化反応に伴う過酸化水素の発
生量を発色剤を用いて、比色定量するものがある。

またＧＯＴの測定方法としては、基質のアスパラギン酸
とα−ケトグルタル酸に試料を加えオキザロ酢酸を生成
する反応と、生成したオキザロ酢酸をオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼ（ｏＡｃと略記する）の存在下にピルビ
ン酸を生成する反応とを共役させピルビン酸を生成させ
る。次にこの生成したピルビン酸をＰｏＰと所要基質の
存在下にピルビン酸酸化反応を行わせ、ピルビン酸酸化
反応に伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定
量する。しかしながら上記ＰｏＰを利用する測定法は、
高価な酵素の使い捨て、測定時間が長いこと、ＰＯＰ自
身が溶液中では不安定であるため測定時の再現性が悪い
等の問題点がある。

そこでＰＯＰを固定化し、これを酸化電位測定用電極に
装着した酵素電極を使用してＧＰＴ、Ｇ　６− ＯＴを測定しようとする研究が盛んに行なわれている。

（特開昭５５−１１１７８６号、同５６−１２４３’１
６号各公報、Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａ
ｃｔａ　。

と刷（１９８０）６５−７１等参照） しかし、これら上記の固定化法では、固定化ＰＯＰの活
性ならびに安定性は十分とはいえず、またＰＯＰのみの
固定化ではＧＯＴ測定特定時ＡＣ酵素を添加しなければ
ならない欠点があるため、ＧＯＴ又はＧＰＴ測定用の高
活性で安定性の優れるＰＯＰおよびＯＡＣ固定化酵素の
提供が切望されていた。

本発明者らは、この要望に応えるべく鋭意検討を行った
結果、ＰＯＰ及びＯＡＣの酵素活性及びその安定性に優
れ、基質拡散性がよく、洗浄しやすい固定化酵素が製造
でき、更にこの固定化酵素の膜を酸化電位測定用の電極
に装着して酵素センサーとし第１１用することにより、
従来の測定方法の欠点を解消し、生体試別中の微量のト
ランスアミナーゼを簡便な方法で、迅速に精度良く、定
量範囲も広く測定し得ることを見出し本発明を完成した
。

即ち、本発明の第一は、多孔性高分子担体をピルビン酸
オキシダーゼ（ＰＯＰ　）、オキザロ酢酸デカルボキシ
ラーゼ（ＯＡＣ）、補酵素フラビンアデニンジヌクレオ
チド（ＦＡＤ）、補酵素チアミンピロホスフェート（Ｔ
ＰＰ　）およびＭｇ２＋及び／又はＭｎ２＋イオンを含
む溶液に浸漬して得られる固定化酵素を提供するもので
あり、その第二は、多孔性高分子担体をピルビン酸オキ
シダーゼ（ＰＯＰ　）、オキザロ酢酸デカルボキシラー
ゼ（ＯＡＣ）、ｍ酵素フラビンアデニンジヌクレオチド
（ＦＡＤ）、補酵素チアミンピロホスフェ−）　（ＴＰ
Ｐ　’）およびＭｇ２＋及び／又はＭｎ２＋イオンを含
む溶液に浸漬することを特徴とする固定化酵素の製造法
を提供するものである。

以下に本発明の実施態様を詳述する。

本発明に用いられる多孔性高分子担体は、公知の塩化ビ
ニル樹脂担体、アセチルセルロース、ポリカーボネート
、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン
等を用いることができる。

この中でも塩化ビニル樹脂担体が特に好ましく用いられ
、該担体は、特開昭５５−３９７１９号公報記載のもの
を用いることができる。

特に好ましくは、塩化ビニル樹脂相体は以下の様にして
製造される。

先ス塩化ビニル樹脂をジメチルホルムアミドなどの溶媒
（４）に溶解し、これを所望の担体形状に形成した後溶
媒（Ｂ）への浸漬処理を行寿う。

本発明の上記塩化ビニル樹脂（ＰＶＲ）としては、ポリ
塩化ビニル（ｐｖｃ　＞、塩化ビニル共重合体、これら
と他の樹脂とのブレンド物があや、塩化ビニル共重合体
としては、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニ
リデン、エチレン、アクリル酸、アクリロニトリルなど
との二元または三元以上の共重合体がある。

溶媒（４）は、ＰＶＲを溶解できる溶剤であって、ジメ
チルホルムアミド（１）ｌＶｆＦ）、ジメチルアセトア
ミド（Ｔ’）ＩＶＩＡ　）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ
−ＭＰ）、ヘキサメチルホスフォアミド（ＨＭＰＡ）、
テトラヒドロフラン（Ｔ）（Ｆ　）　、アセトンとペン
　９− ゼンの混合溶媒などがある。ＰＶＲ溶液の濃度としては
１〜３０重！！：％のものが用いられる。酵素等の固定
膜が優れた吸着活性を発揮して機能するためにはＰＶＲ
の重合度が約１０００において６〜１２重１％が好まし
い。

次に、かくして得たＰＶＲ溶液を所望の担体形状に形成
した後、ＰＶＲの貧溶媒であり且つ溶媒■の良溶媒とな
る溶媒（Ｂ）と接触させて担体層を形成する。この際、
溶媒ω）との接触はＰＶＲ溶液層が白化する前に行なう
ことが好ましい。ここで白化する前とは、ＰＶＲと溶媒
囚の溶液が目視できる白濁を生じて不透明となるまでの
期間である。

溶媒（８）としては水、アルコール系溶媒、エーテル系
溶媒などがある。

アルコール系溶媒としては、メチルアルコール、エチル
アルコール、ｎ−プロピルアルコール、１ｓｏ−７”ロ
ピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、５ｅＣ−ブチ
ルアルコール、ｔｅｒｔ　−フｆルアルコールナトのｍ
個アルコール類、エチｌ／ンクリコール、ジエチレング
リコール、グリ七リンなどの１０− 多（＋ｔｈアルコール類、エチレングリコールモノメチ
ルニーデル、エチレングリコールモノエチルエーテルな
どのグリコールモノエーテル類などが用いられる。浸漬
する溶媒としてはこれらアルコール系溶媒単独またはア
ルコール系溶媒を５０重量％以上含有して塩化ビニル樹
脂不溶の混合溶媒であってもよい。

殊ニ、メチルアルコール、エチルアルコールを用いた場
合には、固定化酵素活性の大きい固定化物が得られ好ま
しい。

なお、ＰＶＲと溶媒（４）の溶液には、担体の膨潤のｉ
合の調整すなわち担体の含水率の調節、孔径の調整等の
だめに、ポリエチレングリコール等の１）ＶＲに対し非
溶媒性の化合物を添加することができる。

相体形状としては膜状、管状、試験管状、ビーズ状等種
々の形状をとることができる。酵素電極等の用途には特
に膜状が好ましい。膜状担体はＰＶＲ溶液を流延し、そ
の後溶媒（Ｂ）に接触し、管状担体は管状支持体の内壁
に溶液薄膜層を形成し、その後溶媒（Ｂ）に接触し、試
験管状担体の場合には試験管の内壁に溶液薄膜層を形成
し、その後溶媒（Ｂ）に接触し、ビーズ状」１１体の場
合にはＰＶＲ済液を空気中に噴霧した後亀媒（Ｂ）に浸
漬ｌ〜て形成する。

この際、担体の強度を向上させる為膜状担体の場合には
不織布等の、ビーズ状担体の場合には多孔性の球状体等
の補強１′Ａを用いてもよい。

なお担体の形成後、相体を水中に浸漬して溶媒（［３）
を水とｌＮ換することが好ましい。

次に上記多孔性高分子相体を酵素ＰＯＰ、ＯＡＣと共に
補酵素フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡ、Ｄと略
記する）、補酵素チアミンピロホスフェ−）（ＴＰＰと
略記する）オ・よびＭｇ２＋イオン及び／又はＭｎ”　
イオンを含む溶液に浸漬して本発明の固定化酵素を得る
。

この場合、上記酵素を含む浴／ＩＭは、ＰＯＰとＯＡＣ
の合計の濃度が１００〜１０００η／　ｄｅ　、好まし
くは２００〜８００η／　ｔｉｉであり、ｐｏｐとＯＡ
Ｃとの重量組成比か５０１５ｏ〜９９／１、好゛ましく
は７０／３ｏ〜９８／２、特に好ましくは８５／／１５
〜９７／３　の間にあり、かつ該溶液のｐＨが６〜８．
５、好ま１−＜は６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液
である。

本発明に使用する上記緩衝溶液は、Ｇｏｏｄ　ら（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５．４６７（１９６６））によ
るＰＫａ６〜８．５の公知の緩衝剤を用いることができ
る。例えばＮ置換型双極性アミノ酸としては、Ｎ−（２
−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−
（２−アセトアミド）イミノジ酢酸、Ｎ、Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、
、　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）クリシン、
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ヒベラジンーＮ’−２−
エタンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、
ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）
、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノ
プロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）
メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−）リス（ヒ
ドロキシメチル）メチルグリシン１３− 等がある。また脂肪族アミンとしては、２，２−ビス（
ヒドロキシメチル）　−２，２’、２“−ニトリロトリ
エタノール、１，３−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル
）メチルアミン〕プロパン、グリシンアミド等がある。

またトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等を用い
ることもできる。

これらは単独で使用する他、２種以上を混合して使用す
ることができる。

また、Ｍｇ２＋イオンおよびＭｎ２＋イオンはｌＶＩｇ
　Ｃ１２およびＭｎ　Ｃ１２の形態で使用することが好
ましい。

本発明の固定化酵素は、昭和５７年１２月１日出願の特
許の明細書に記載した常温硬化性ブロックトイソシアネ
ート化合物の水溶液に接触させて該化合物で被覆するこ
ともできる。

本発明の固定化酵素の用途は、例えば次のとおりである
。膜状の固定化酵素は酸素電極、過酸化水素電極、二酸
化炭素電極などの電極に装着することにより酵素センサ
ーとして使用できる。管状体の固定化酵素は固定化酵素
反応装置として臨床検査分野での分析計への前処理反応
部とし７て使用１４− でき、ビーズ状の固定化酵素は充填型反応装置として使
用できる・ 筐だ測定対象試料系としては、ピルビン酸そのもの、あ
るいはピルビン酸を直接または間接的に遊離する系を有
してなる試料系であればよく、例えば血清、尿中などに
存在するピルビン酸の分析あるいはトランスアミナーゼ
（ＧＯＴ、ＧＰＴ）の分析、乳酸と乳酸脱水素酵素（以
下Ｌ　Ｄ　Ｈと略記スル）、アデノシンジホスフェート
（以下ＡＤＰと略記する）とピルビン酸キナーゼ（以下
ＰＫと略記する）の分析、トリグリセライドの分析等に
適用することかできる。

上記の利用例の代表的なものを挙げると次の通りでをン
る・ （イ）ピルビン酸を含有する試料中のピルビン酸の測定
を目的とするものニ アセチルリン酸＋ＣＯｚ　　＋Ｈ２Ｏ２測定すべき酵素
または基質の存在下における酵素反応により、ピルビン
酸を直接遊離する系として、例えば、 （ロ）ＧＰＴ活性の測定を目的とするもの：ヒルピン酸
十グルタミン酸 （ハ）乳酸まだはＬＤＨ活性の測定を目的とするもの： また、測定すべき酵素または基質の存在下における酵素
反応と、この反応の生成物と所要基質からピルビン酸を
生成する酵素反応との共役によりピルビン酸を間接的に
遊離する系として、例えば、に）ＧＯＴ活性の測定を目
的とするもの：ＯＴ アスパラギン酸＋α−ケトグルタル酸−一−→オキザロ
酢酸十グルタミン酸 （ホ）ＡＤＰまだはＰＫ活性の測定を目的とするもの： アデノシンジホスフェート（ＡＴＰと略記する）＋ピル
ビン酸 （へ）トリグリセライドの測定を目的とするもの；３−
リン酸十ＡＤＰ ピルビン酸十ＡＴＰ 次に実施例、比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明す
る。尚、例中に用いる「部」は型針基準である。又、例
中の固定化されたＰＯＰ又はＯＡＣ酵素の酵素活性の測
定においてＰＯＰ活性の測定は、Ｌ、Ｐ、　Ｈａｇｅｒ
　ａｎｄ　Ｆ、Ｌｉｐｍａｎｎ　　らの方法（ＭＣｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　ｇｎｚｙｍｏｌｏｇ）ｒ　、　Ｖｏｌ、
　１、４８２（１９５５））に従い、１　ｕｎｉｔ（Ｕ
）は３７℃、ｐＨ６，７において、ピルビン酸、リン酸
および酸素より１μｒｎｏｔの過酸化水素を生ずる酵素
活性量である。

またＯＡＣ活性の測定は、Ａ、Ａ、　Ｈｏｒｔｏｎ　ａ
ｎｄ　Ｈ，Ｌ。

１７− Ｋｏｒｎｂｅｒｇらの方法（Ｂｊｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅ
ｔ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ　１８９．３８Ｄ１
９６４））に従い、１　ｕｎｉｔ（Ｕ）は３７℃におい
て、オキザロ酢酸より１分間に１μｍｏｔのピルビン酸
を生成する酵素活性量である。

実施例１〜６、比較例１〜４ （１）　　担体の製造 ＰＶＣ（鐘渕化学社候、重合ｊ息１　（１００）　Ｉ　
０部、ＤＭＦ溶媒９０部より均一な溶液を調製し、この
溶液の一部を１５Ｘ１５ｍのガラス板上に流延し、直ち
にメタノール浴中にガラス板ごと浸漬した。３０分後、
このガラス板を蒸留水中に浸漬してメタノールを水に置
換したＰＶＣ膜（膜厚４０μｍ）担体を得た。

罰］　固定化複合酵素膜の製造 」二記ＰＶＣ膜を直径８陥の円形に打ち抜き、これをＰ
ＯＰ（東洋醸造社！りとＯＡＣ（東洋醸造社製）（表−
１に示すＰＯＰ１０ＡＣ組成比であり、ＰＯＰとＯＡＣ
合計の濃度：５０（ｌり／ｄｉ）と共に、補酵素ＦＡＤ
（牛丼化学社製、２ミリモル／ｌ）、補酵素ＴＰＰ（牛
丼化学社製、２ミリ１８− モｈ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２　（２０ミリモル／ｌ）を含む
Ｔｒｊｃｉｎｅ緩衝液（牛丼化学社製、５０ミリモル／
Ｌ％ｐＨ７，０）の０．６　ｍｅ中に４℃にて２４時間
浸漬し固定化酵素膜を得た。この固定化酵素膜のＰＯＰ
及びＯＡＣ活性を測定した結果、活性は表〜１の通りで
あった。

衣−１ 実施例７〜１１および比較例５ 実施例１〜６のｍで得られたＰＶＣ膜を直径８簡の円形
に打ち抜き、複合酵素膜の製造における緩衝液の種類を
表−２の様に変えた他は実施例３と同様の操作により固
定化酵素膜を得だ。

この際使用した緩衝液（５０ミＩＪモル／ｌ−，ｐＨ７
，０）の種類による得られた固定化酵素膜のＰＯＰ及び
ＯＡＣ活性は表−２のとおりであった。

（以下余白） 表−２ ＭＥＳ　　　　　：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸１）ＩＰＥＳ　　　　：　　ピペラジン−Ｎ、Ｎ
′−ビス（２−エタンスルホ４浚）ＨＥＰＥＳ　　　　
：　　Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸 Ｔｒｉｓ　　　　　　：　　トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタンＰｈｏｓｐｈａｔｅ　：　ＫＨｚＰＯａ
−ＮａＯＨ２１− 比較例６〜８ 実施例１〜６の（ＩＦで得たＰＶＣ膜を直径８ｍの円形
に打ち抜き、固定化酵素膜の製造における補酵素ＦＡＤ
、補酵素ＴＰＰおよびＭｇＣｊ２を除いた他は実施例７
．８および比較例５と同様の操作により固定化酵素膜を
得だ。得られた固定化酵素膜のＰＯＰ及びＯＡＣ活性は
表−３の通りであった。

表−３ ２２− 実施例１２〜１６および比較例９ 実施例１〜６の［１］で得だＰＶＣ膜を直径８闘の円形
に打ち抜き、固定化酵素膜の製造におけるＰＯＰとＯＡ
Ｃとの合計の濃度を表−４の様に変えた他は実施例４と
同様の操作によ妙固定化酵素膜を得た。得られた固定化
酵素膜のＰＯＰ及びＯＡＣ活性は表−４の通りであった
。

表−４ 実施例１７ （Ｉ〕　　常温硬化性ブロックトイソシアネート化合物
の製造 分子量１０００のポリエチレングリコール７０部トドリ
レンジイソシアネート３０部を反応させ未反応のトリレ
ンジイソシアネートを５．６％含むウレタンプレポリマ
ーを得た。このウレタンプレポリマー中の遊離のＮＣＯ
基は８．６％であった。

次いでこのウレタンプレポリマー８７部にイミダゾール
を１３部添推力し、攪拌下９０℃、３時間反応させて常
温硬化性ブロックトイソシアネート化合物を得た。

１１１）固定化酵素膜の製造 ＰＶＣ（鐘渕化学社製、重合度１０００）１０部、ＤＭ
Ｆ溶媒９０部よ妙均−な溶液を調製し、この溶液の一部
をポリエステル製不織布（日本バイリーン■製、厚み約
３８μｍ）をおいた１５×１５ｃｒｎのガラス板上に流
延し、直ちにメタノール浴中ヘガラス板ごと３０分間浸
漬後、水中に入れ水置換を行ない多孔性高分子膜を得た
。

次にこの膜を直径８圏の円形に打ち抜き（膜厚７０μｍ
）、実施例３と同様にして固定化酵素膜を得た。

この膜を前記マスクドウレタンプレポリマーの３０％水
溶液（５０ミリモル、／１ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７，０）
に１分間浸漬した後、室温下３０分間放［してウレタン
プレポリマーで被覆された固定化酵素膜を得た。得られ
た固定化酵素膜の活性はｐｏｐ活性１９８　ｍＴＪＡｎ
　、　ＯＡ　Ｃ活性ａ　２０　ｍＵ／−であった。

実施例１８ ミリボア社製アセチルセルロース膜（タイプＨＡ。

孔径帆４５μｍ１厚さ１４０μｍ）を直径８ｍの円形に
打ち抜き、実施例３と同様にして固定化酵素膜を得た。

更にこの膜を実施例１７のＣＤで得た常温硬化性ブロッ
クトインシアネート化合物の゛３０％水溶液（５０ミリ
モル、ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７ｏＯ）を塗布した後、室温
下３０分間放置してウレタンプレポリマーで被覆された
固定化酵素膜を得た。得られた固定化酵素膜の活性は、
ｐｏｐ活２５− 性７３　ｍＴＪ／ｌｔ、　ＯＡ　Ｃ活性１６　ｓ　ｍＵ
／ｃＪであった。

参考例１ 〔■］　　複合酵素センサーの作製 アセチルセルロース６部、シクロヘキサノン８７部、イ
ソプロパツール７部より均一な溶液を調製し、この溶液
の一部を１５Ｘ１５６ｎのガラス板上に流延し、室温で
４８時間風乾して、厚さ１０μｍの透明なアセチルセル
ロース膜を得た。次いでこのアセチルセルロース膜を実
施例１７の（ｕｌで得られた固定化酵素膜と貼り合せ、
アセチルセルロース膜を電極側、該固定化酵素膜を試料
液に接する様に過酸化水素電極に装着し、複合酵素セン
サーを作製した。

（冒１　ピルビン酸の定量 上記複合酵素センサーを３７℃に＊！Ｉｔ、たセルに取
付は補酵素ＦＡＤ（ｏ、１ミ＋）モル／ｌ）、補酵素Ｔ
ＰＰ（１，０ミリモル／ｌ）、Ｍｇ（１２（１０ミＩＪ
　モル／　Ｌ　）、ＫＨ２ＰＯ４（１，０ミリモル／ｌ
）を含むＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（５０ミリ−Ｅニル／ｌ
、　　ｐＨ７，０）　０．６８ｍｌをセルに注入し、次
に０〜２０ミリモル／ｌのピルビン酸リチウム標準液の
１０μｔを攪拌しながら、２６− マイクロデイスベンザ−を用いてセル中にそれぞれ投入
し、酵素反応を１５秒間行なわせて発生した過酸化水素
の酸化電流をポーラログラフ法により測定した。

この測定に使用した測定装置を図１に示す。また測定の
結果を図２に示す。図２から明らかな様にピルビン酸濃
度と電流値との間には、良好な直線関係が認められ、本
発明の固定化酵素膜を使用すれば、少量の試料でθ〜２
０ミリモル／ｌの微量のピルビン酸が精度よく測定でき
る。

次に、この複合酵素センサーを３７℃で、上記ピルビン
酸の定量と同様の測定を１５ｏＯ回繰り返して行ったと
ころ電極活性の低下は認められず、使用安定性は良好で
あった。

参考例２ 川　ＧＯＴの定量 参考例１のｍで得た複合酵素センサーを、３７℃に調整
したセルに取付はアスパラギン酸（２００ミリモル／１
）、α−ケトグルタル酸（１０ミリモル／１）、補酵素
ＦＡＤ（ｏ、１ミリ％ル／ｌ）、補酵素ＴＰＰ（１，０
ミリモル／ｌ）、Ｍｇ　ｃｚ２（１０ミリモル／ｚ）、
ＭｎＣＬ２（４ミリモル／ｌ）およびＫＨ２ＰＯ４（１
，０ミリモル／／＝）を含むＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（５
０ミリモル／　ｔＳｐＨ７−０）０．６８＋ｍ！！をセ
ルに注入し、次にθ〜１６００国際単位（１，Ｕ）／ｚ
の既知の活性のＧＯＴ（ベーリンガー・マンハイム山之
内■製）を含む試料をそれぞれ５０μｔづつマイクロデ
ィスペンサーを用いて攪拌下のセル中に投入し、酵素反
応を１分間行なわせた。この反応によ抄発生した過酸化
水素の酸化電流をポーラログラフ法により測定した。

測定の結果を図３に示す。図３から明らかな様にＧＯＴ
活性と電流値変化速度との間には、良好な直線関係が認
められ、本発明の固定化酵素膜を使用すれば少量の試料
で０〜１６００　■、Ｕ／ｌの広範囲の濃度のＧＯＴが
簡便な方法で、迅速に精度よく測定可能である。なお１
国際年位（１，Ｕ　）Ｕ、ｐＨ７，５，３０℃において
、α−ケトグルタル酸より、１分間に１マイクロモルの
し一グルタミン酸を生成する酵素活性量である。

参考例３ ｍＧＰＴの定量 参考例２において基質のアスパラギン酸の代りにアラニ
ン（３００ミリモル／ｌ）とＯ〜１４００１、Ｕ／ｌの
既知の活性のＧＰＴ（ベーリンガー・マンハイム山之内
■製）を含む試料を用いた他は参考例２と同様にしてＧ
ＰＴを測定した。

測定の結果を図４に示す。図４から明らかな様にＧＰＴ
活性と電流値変化速度との間には、良好な直線関係が認
められ、本発明の固定化酵素膜を用いれば少量の試料で
０〜１４００１．Ｕ／ｌの広範囲の濃度のＧＰＴが簡便
な方法で、迅速に精度よく測定可能である。

参考例４〜１０ 比較例２．３．５・〜９で得た固定化酵素膜を参考例１
と同様な操作により過酸化水素電極に装着１−１参考例
１．２及び３と同様にしてピルビン酸、ＧＯＴおよびＧ
ＰＴの定量を試みた結果、酵素反応による酸化電流は小
さく、生体試料中のトランスアミナーゼの測定は困難で
あった。

−２９＝

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の固定化酵素膜を過酸化水素電極に装着
した複合酵素センサーを用いたピルビン酸、ＧＯＴおよ
びＧＰＴ測定等のための装置の一例を示す概念図である
。 図２、図３および図４は、本発明の固定化酵素膜を過酸
化水素電極に装着した複合酵素センサーを用いてそれぞ
れ測定したピルビン酸リチウム濃度−電流値の、、ＧＯ
Ｔ活性活性流電流値変化速度およびＧＰＴ活性活性流電
流値変化速度れぞれの関係を示す相関図である。 １・・・試料注入器 ２、・・・反応および検出セル ３、・・・固定酵素膜 ４、・・・過酸化水素電極 ５、・・・増幅器 ６、・・・記録計 ７、・・・ディジタルマルチメーター ８．９．１０．・・・ポンプ １１、・・・基質および緩衝液槽 ３０− １２・・・廃液槽 特許出願人　　三菱油化株式会社 代理人　弁理士　古　川　秀　利 代理人　弁理士　長　谷　正　久 ３１− 図１ 図２ ピル已シ酸リチウムＪＪＲ（ｍＭ／１）図３

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　多孔性高分子担体を、ピルビン酸オキシダー
   ゼ（ＰＯＰ）、オキザロ酢酸デカルボギシラーゼ（ＯＡ
   Ｃ）、補酵素フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ
   ）、補酵素チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）および
   Ｍｇ２＋及び／又はＭｎ”＋イオンを含む溶液に浸漬し
   て得られる固定化酵素。
2. （２）多孔性高分子担体が、塩化ビニル樹脂を一種また
   は二種以上の溶媒（Ａ）に溶解して該樹脂濃度２〜２５
   重量％の溶液とし、該溶液を塩化ビニル樹脂の貧溶媒で
   かつ溶媒（Ａ、）の良溶媒となる一種または二種以上の
   溶媒（Ｂ）中に浸漬して得られたものである特許請求の
   範囲第１項記載の固定化酵′素。
3. （３）多孔性高分子担体をピルビン酸オキシダーゼ（Ｐ
   ＯＰ　）、オキザロ酢酸デカルホキ／ラーゼ（ＯＡＣ）
   、補酵素フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、
   補酵素チアミンピ目ホスフェート（ＴＰＰ）およびＭｇ
   ２＋及び／又はＭｎ　　イオンを含む溶液に浸漬するこ
   とを特徴とする固定化酵素の製造法。
4. （４）多孔性高分子担体が、塩化ビニル樹脂を一種また
   は二種以上の溶媒（Ａ）に溶解して該樹脂濃度２〜２５
   重量％の溶液とし、該溶液を塩化ビニル樹脂の貧溶媒で
   かつ溶媒（Ａ）の良溶媒となる一種まだは二種以上の溶
   媒（Ｂ）中に浸漬して得られたものである特許請求の範
   囲第３項記載の固定化酵素の製造法。
5. （５）酵素、補酵素およびＭｇ２＋及び／又はＭｎ”イ
   オンを含む溶液がＰＫａ６〜８．５ＯＮ置換型双極性ア
   ミノ酸、脂肪族アミンおよびトリス（ヒドロキシメチル
   ）アミノメタンの一種以上を含む緩衝溶液である特許請
   求の範囲第３項まだは第４項記載の固定化酵素の製造方
   法。
6. （６）酵素、補酵素およびＭｇ　２＋及び／又はＭｎ　
   ２”イオンを含む溶液中のＰＯＰおよびＯＡＣの合計の
   濃度が１００〜１０００■／ｄｌであり、Ｐ　ＯＰｌｏ
   　Ａ　Ｃの重匍比が５０１５ｏ〜９９／１である特許請
   求の範囲第３項または第４項まだは第５項記載の固定化
   酵素の製造方法。