JPS63283583A - 酵素固定化膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発皿豊！量 酵素は生体内触媒であり、化学触媒と比較して毒性がな
く、中性溶液中にて低温で作用し、反応特異性および基
質特異性が高いという特徴を有するため、主に食品、医
薬品等の製造に使用されている。しかしながら一般に酵
素は不安定であり、高価であるという欠点を有している
ため、繰り返し利用ができ、安定性を向上させるための
種々の酵素固定化方法が知られている。固定化酵素はま
た、生成物の反応液からの分離回収が容易である利点が
ある。

酵素固定化法の一つに、不溶性の担体に酵素を吸着ない
し閉じ込める方法が知られているが、その場合の担体と
しては、ポリアクリルアミドゲル、ポリウレタンゲル、
光硬化性樹脂、イオン交換樹脂等の合成ポリマー、およ
びカラギーナンゲル、寒天ゲル、アルギン酸ゲル、キト
サンゲルなどの天然ポリマーがよ（用いられる。

近年膜状に成形した担体に酵素を固定化し、反応と生産
物の分離精製を同時に行ういわゆるメンブレンバイオリ
アクターへの応用が試みられている。その−例として、
ＮＡＤ　にコチンアミドーアデニンジヌクレオチド）ま
たはＮＡＤＰ　にコチンアミドーアデニンジヌクレオチ
ドリン酸）を共通補酵素とする、酸化酵素および還元酵
素を使用した共役酸化還元反応への応用が考えられる。

ＮＡＤおよびＮＡＤＰは酸化還元反応における電子供与
体、電子受容体となる補酵素である。ＮＡＤもしくはＮ
ＡＤＰを補酵素とする酵素を用いて酸化反応もしくは還
元反応を単独で行う場合、少なくとも基質と等モルのＮ
ＡＤもしくはＮＡＤＰを使用しなければならないが、例
えばＮＡＤを次のような共役酸化還元反応に使用するこ
とができれば、高価な酵素および補酵素を有効に利用す
ることができる。

そのためには、これら補酵素および酵素を固定化したメ
ンブレンバイオリアクターを開発する必要があるが、二
種類の酵素と−Ｍ類の補酵素を用いる複雑な系であるた
めと、二種の酵素を同時に高活性収率で異なる部位に固
定化することができ、かつ異なる部位に固定化した二種
の酵素間での電子伝達が十分に行われ、かつ強度のある
安定な酵素固定化膜を与えるような良好な膜素材がこれ
までなかったために未だ実現していない。

本発明の課題は、メンブレンバイオリアクターとして、
特に前記共役酸化還元反応に利用し得るメンブレンバイ
オリアクターとして使用するための酵素固定化膜を提供
することである。

笠次去失 本発明者らは、前記共役酸化還元に用いることができる
メンブレンバイオリアクターの酵素固定化膜の担体ポリ
マーとして種々のポリマーについて検討した結果、水溶
性ウレタンプレポリマーのイミダゾール付加物と、鎖延
長剤との反応により得られるカチオン性ポリウレタン膜
がこの目的を達成し得ることを知った。

この膜は、吸着によって種々の酵素を固定化し、特異的
酵素反応に使用することができるが、前記共役酸化還元
反応に使用するためには、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰを共
通補酵素とする酸化酵素および還元酵素を膜の表側およ
び裏側にそれぞれ吸着固定化し、膜全体に前記共通補酵
素を含浸して用いればよい。反応は、このようにして調
製したメンブレンバイオリアクターをもって反応槽を二
つに仕切り、膜で仕切った反応槽のそれぞれの側で酸化
反応および還元反応を同時に実施すればよい。

このようなメンブレンバイオリアクターを使用すれば、
複雑な共役酸化還元反応を一枚の膜を使って実施するこ
とが可能になり、また一般に模型反応器の特徴として連
続運転が可能であり、生産物の分離精製が容易になる。

さらにＮＡＤもしくはＮＡＤＰは、酸化酵素の、働きに
よって還元型となったものが還元酵素の働きによって酸
化型へ変換され、循環して共役反応に関与するのでその
利用効率が高まる。

また前記膜素材は、鎖延長剤として適当なものを選ぶこ
とにより、極めて薄い膜（１５０７ｊｎ以下）にするこ
とができ、共役酸化還元反応にあずかる酸化酵素と還元
酵素との物理的距離が短くなり、補酵素による電子伝達
がスムースに行われる。さらにウレタン樹脂の特徴であ
る強度によって膜が破れに＜＜、長期にわたって劣化の
心配がない。

本膜はカチオン性のハイドロゲル膜であり、通常負に帯
電している酵素タンパクに対する吸着性が大きいので、
吸着法による酵素固定化を行っても酵素固定化率は高（
、酵素のリークは少ない。当然吸着法のメリットとして
固定化に際し酵素の失活が少ない。また製膜時イミダゾ
ールブロック剤がはずれ、ウレタンプレポリマーと鎖延
長剤とが反応した後でも一部イミダゾールでブロックさ
れたイソシアネート基が残り、これが酵素もしくは補酵
素と反応し、固定化を助ける。通常のブロックタイプの
ウレタンプレポリマーを用いる場合は製膜に加熱を必要
とするが、イミダゾールブロックウレタンプレポリマー
を用いる場合は室温で製膜が可能である。

一般に、ポリオール成分と過剰のポリイソシアネートと
を常法により反応させてウレタンプレポリマーをつくり
、その末端遊離イソシアネート基をイミダゾールとの反
応によってブロック化する。

この時のプレポリマーの分子量は８００〜４０００位が
好ましい。

このようにして得られたブロック化ウレタンプレポリマ
ーは水溶性であり、常温では安定であるが、加熱または
活性水素含有化合物によりイソシアネート官能基を再生
し、水、ポリアミン、ポリオール等の鎖延長剤と反応し
て鎖延長し得る。

プレポリマーのポリオール成分としては、公知のポリエ
ーテルポリオール、ポリエステルポリオール、ポリジメ
チルシロキサン含有ポリオール等を使用することができ
、またグリセリンやトリメチロールプロパン等の活性水
素を３個以上含む出発物質にアルキレンオキシドを付加
して得られるポリエーテルポリオールまたはポリエステ
ルポリオールも使用し得る。

ポリイソシアネートとしては通常のものでよく、例えば
トリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネー
ト、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイ
ソシアネートなどがある。

１■亙法 上述の方法によって製造したウレタンプレポリマーイミ
ダゾール付加物と鎖延長剤を混合後、水平に保った板上
に流延し、室温にて一昼夜放置することにより膜化する
。この際４０℃程度に加温すると膜化時間は短縮される
。

鎖延長剤としては、この場合水およびポリアミン、例え
ばヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリアミン等が
好ましい。

、および　　の　　　　゛ 膜によって反応槽を垂直方向に二つに区切り、ＮＡＤも
しくはＮＡＤＰを共通補酵素とする酸化酵素および還元
酵素の水溶液をそれぞれの側へ加え、−夜から一日程度
放置し、酵素を吸着固定化する。

次に同じ槽内で、または膜を取り出してＮＡＤもしくは
ＮＡＤＰの水溶液中に膜を４８時間程度浸漬し、補酵素
を含浸させた後、再び反応槽へ装着して二種に仕切り、
それぞれの側へ基質溶液を加え、反応を開始する。また
、あらかじめ補酵素を含浸させた膜を装着し、酵素およ
び基質溶液を同時に加えて反応を開始してもよい。

前記共役酸化還元反応に使用し得る酵素としては、ＮＡ
ＤもしくはＮＡＤＰを共通補酵素とする酸化酵素および
還元酵素であれば任意である。ＮＡＤを補酵素とする還
元酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシ
トレートデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナー
ゼ等があげられ、酸化酵素としてはピルベートデヒドロ
ゲナーゼ、グリセリルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ等があげられる。ＮＡＤＰを補酵。

素とする還元酵素としては、例えばイソシトレートデヒ
ドロゲナーゼ、マリックエンザイム、グルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ等があげられ、酸化酵素
としてはグルタチオンレダクターゼ、キノンレダクター
ゼ、ニトレートレダクターゼ等があげられる。

実施例 ヘキサメチレンジイソシアネート　　１４．６　ｇジオ
キサン　　　　　　　　　　　　　５０ｍ１アジピン酸
　　　　　　　　　　０．０８６７　ｇ上記配合物を８
０℃〜９０℃にて加熱攪拌し、Ｓｉｇｇａ−Ｈａｎｎａ
法にてイソシアネート基を定量し、当初の半分になった
時点で反応を終了した。４０℃にまで放冷後、ジオキサ
ンに溶解した６、　５６　ｇのイミダゾールを加え、室
温で２４時間攪拌してウレタンプレポリマーイミダゾー
ル付加物を合成した。

ウレタンプレポリマーイミダゾール付加物３０ｇに０．
５Ｍジエチレントリアミン３０ｍｆを加え、水平に保っ
た板上に流延し、室温で一夜放ヱして製膜した。膜厚は
１４５Ｊｘｎであった。水洗後膜電位を測定したところ
、　５４．８　ｍＶであり、カチオン性を帯びていた。

この理由は正確には不明であるが、添加したジエチレン
トリアミンの一部がイソシアネートとの反応にあずから
ず、遊離しているためと考えられる。

膜によって二種に仕切ることができる反応器に有効膜面
積１０ｃｄを持ち、あらかじめ１０−３ＭＮＡＤ“に４
℃で２４時間浸漬した前述の膜を装着し、それぞれの槽
を酵母菌属のアルコールデヒドロゲナーゼ１■を含む２
Ｘ１０−４Ｍアセトアルデヒドと、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ１■を含む２Ｘ１
０−４Ｍグリセルアルデヒド−３−リン酸、２Ｘ１０−
４Ｍ　リン酸、１０−４ＭＮＡＤ＋で満たした。反応槽
を３０’Ｃに保ち、以下の共役酸化還元反応を行った。

一方の槽中の生成したエタノールをガスクロマトグラフ
ィーで定量し、反応率を算出した。それを下表に示す。

エタノール生成が、膜の反対側の槽で生成したＮＡＤＨ
の透過によるものとして、エタノール生成初期速度より
Ｆｉｃｋの第１式を使って計算したＮＡＤＨの拡散流速
は３．２５　Ｘ　１０−１０−１ｌ　／　ｃｊ−ｓｅｅ
であった。

これとは別に、酵素を固定化していない同じ膜について
ＮＡＤＨ拡散流速をあらかじめ測定したところ、５　Ｘ
　１０　＝　ｍｏｌ／ｃｆｆｌ−ｓｅｃであり、約１７
６であった。

このことは本共役系においてＮＡＤＨは単純拡散以外の
因子によって通常考えられる６倍の速度で電子伝達を行
っていると考えられ、膜中に含浸されたＮＡＤ＋とＮＡ
ＤＨ間の自己電子伝達作用によるものと推定される。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）水溶性ウレタンプレポリマーのイミダゾール付加
   物と鎖延長剤との反応によって得られるカチオン性ポリ
   ウレタンの膜に吸着によって酵素を担持させてなる酵素
   固定化膜。
2. （２）ＮＡＤもしくはＮＡＤＰを共通補酵素とする酸化
   酵素および還元酵素を膜の表側および裏側にそれぞれ吸
   着固定化し、膜全体に前記共通補酵素を含浸してなる第
   １項記載の酵素固定化膜。