JPH0318876B2

JPH0318876B2 -

Info

Publication number: JPH0318876B2
Application number: JP57211117A
Authority: JP
Inventors: Kunio Kihara; Shigeoki Yasukawa; Noritaka Hosokawa; Kenji Hijikata
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1982-12-01
Filing date: 1982-12-01
Publication date: 1991-03-13
Also published as: JPS59102393A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、改良された固定化酵素の製造方法に
関するものである。本発明の方法により製造された固定化酵素は、
優れた活性と著しく増大した使用安定性を有する
ものである。近年、酵素の工業的利用の面から酵素を固定化
する為の種々の方法が提案されている。本発明者
らも特開昭55−39719号、同57−166983号等の方
法を提案したが前者では、使用する酵素種、基質
溶液によつては固定化酵素の使用安定性が劣り、
長期間使用すると酵素活性が低下する等の問題が
あり、一方後者では、強度の良好な高活性の膜状
の固定化酵素を得ることができず、ゲル担体内部
での反応物、生成の内部拡散速度が小さい為反応
時間が長い等の為特に酵素電極センサーとして使
用することができなかつた。本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検
討を重ねた結果、特定の担体を用いこれに酵素を
担持した後に少なくとも酵素担持部を常温硬化性
ブロツクドイソシアネート化合物で被覆すること
により、優れた酵素活性と著しく増大した使用安
定性を有する固定化酵素を製造できることを見い
出し本発明を完成した。即ち、本発明は、塩化ビニル樹脂を一種または
二種以上の溶媒(A)に溶解して該樹脂濃度を２〜25
重量％の溶液とし、該溶液を塩化ビニル樹脂の貧
溶媒でかつ溶媒Ａの良溶媒となる一種または二種
以上の溶媒(B)中に浸漬して得られた担体を酵素を
含む液に接触させた後下記常温硬化性ブロツクド
イソシアネート化合物の水溶液に接触させること
を特徴とする固定化酵素の製造方法常温硬化性ブロツクドイソシアネート化合物：
ポリイソシアネートと親水性ポリオールプレポリ
マーとを反応させて得られる遊離のNCO基を２
個以上有するウレタンプレポリマーと、分子中に

【式】骨格を有する複素環式化合物、ヒドロキシピリジン、ヒドロキシキノリン、及び
pKaが５〜9.5のフエノールから選ばれるイソシ
アネートブロツキング剤とを、該ウレタンプレポ
リマーのNCO基に対する該イソシアネートブロ
ツキング剤のOH基及び／又はNH基の当量比が
0.2〜２になる割合において反応させて得られる
常温硬化性ブロツクイソシアネート化合物を提供
するものである。本発明の方法で製造される固定化酵素は、特に
膜状で使用するに好ましいものであり、例えば酵
素センサー等として用いることができる。本発明の方法による固定化酵素は、製法が簡単
で優れた酵素活性と著しく増大した使用安定性を
有するものであるので長期間安定に使用可能であ
り、又乾燥状態で保存後復水して使用する場合も
親水性ポリマーで被覆されている為、含水状態へ
の復帰も早く取扱いが容易である。次に本発明の実施態様を詳述する。（塩化ビニル樹脂担体）本発明の方法に用いられる塩化ビニル樹脂担体
は、特開昭55−39719号公報記載のものを用いる
ことができる。特に好ましくは、塩化ビニル樹脂担体は以下の
様にして製造される。先ず塩化ビニル樹脂をジメチルホルムアミドな
どの溶媒(A)に溶解し、これを所望の担体形状に形
成した後溶媒Ｂへの浸漬処理を行なう。本発明の上記塩化ビニル樹脂（PVR）として
は、ポリ塩化ビニル（PVC）、塩化ビニル共重合
体、これらと他の樹脂とのブレンド物があり、塩
化ビニル共重合体としては、例えば、塩化ビニル
と酢酸ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、アク
リル酸、アクリロニトリルなどとの二元または三
元以上の共重合体がある。溶媒(A)は、PVRを溶解できる溶剤であつて、
ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセト
アミド（DMA）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ−
MP）、ヘキサメチルホスフオアミド（HMPA）、
テトラヒドロフラン（THF）、アセトンとベンゼ
ンの混合溶媒などがある。PVR溶液の濃度とし
ては１〜30重量％のものが用いられる。酵素等の
固定膜が優れた吸着活性を発揮して機能するため
にはPVRの重合度が約1000において６〜12重量
％が好ましい。次に、かくして得たPVR溶液を所望の担体形
状に形成した後、PVRの貧溶媒であり且つ溶媒
(A)の良溶媒となる溶媒(B)と接触させて担体層を形
成する。この際、溶媒(B)との接触はPVR溶液層
が白化する前に行なうことが好ましい。ここで白
化する前とは、PVRと溶媒(A)の溶液が目視でき
る白濁を生じ不透明となるまでの期間である。溶媒(B)としては水、アルコール系溶媒、エーテ
ル系溶媒などがある。アルコール系溶媒としては、メチルアルコー
ル、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコー
ル、iso−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアル
コール、sec−ブチルアルコール、tert−ブチル
アルコールなどの一価アルコール類、エチレング
リコール、ジエチレングリコール、グリセリンな
どの多価アルコール類、エチレングリコールモノ
メチルエーテル、エチレングリコールモノエチル
エーテルなどのグリコールモノエーテル類などが
用いられる。浸漬する溶媒としてはこれらアルコ
ール系溶媒単独またはアルコール系溶媒を50重量
％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合溶媒で
あつてもよい。殊に、メチルアルコール、エチルアルコールを
用いた場合には、固定化酵素活性の大きい固定化
物が得られ好ましい。なお、PVRと溶媒(A)の溶液には、担体の膨潤
の度合の調整すなわち担体の含水率の調節、孔径
の調整等のために、ポリエチレングリコール等の
PVRに対し非溶媒性の化合物を添加することが
できる。担体形状としては膜状、管状、試験管状、ビー
ズ状等種々の形状をとることができる。酵素電極
等の用途には特に膜状が好ましい。膜状担体は
PVR溶液を流延し、その後溶媒Ｂに接触し、管
状担体は管状支持体の内壁に溶液薄膜層を形成
し、その後用媒(B)に接触し、試験管状担体の場合
には試験管の内壁に溶液薄膜層を形成し、その後
溶媒(B)に接触し、ビーズ状担体の場合にはPVR
溶液を空気中に噴霧した後溶媒(B)に浸漬して形成
する。この際、担体の強度を向上させる為膜状担体の
場合には不織布等の、ビーズ状担体の場合には多
孔性の球状体等の補強材を用いてもよい。なお担体の形成後、担体を水中に浸漬して溶媒
(B)を水と置換することが好ましい。次に上記担体と酵素を含む液を接触することに
よつて固定化酵素を得る。酵素を含む溶液の濃度
は１〜500mg／dlが用いられ、好ましくは20〜200
mg／dlであり、酵素はPH緩衝溶液中に溶解して浸
漬処理を行なう。（固定化される酵素）固定化される酵素には特に制限はないが、例え
ば次の様なものが挙げられる。酸化還元酵素アミノ酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、カタラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、ピルピン酸オキシダーゼ、コレステロール
オキダーゼなど、転移酵素アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、
グルタミン酸オキザロ酢酸アミノトランスフエラ
ーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヘキソキナー
ゼなど、加水分解酵素アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクト
シターゼ、トリプシン、β−グルクロニダーゼな
ど、リアーゼアスパルターゼ、フマル酸ヒドラターゼ、フマ
ラーゼなど、異性化酵素グルコースイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼなど、リガーゼアスパラギンシンターゼ、グルタチオンシンタ
ーゼなど、（常温硬化性ブロツクドイソシアネート化合物）本発明の方法に用いられる常温硬化性ブロツク
ドイソシアネート化合物は、特開昭56−59832号、
同56−110717号又は同57−166983号記載の常温硬
化性ブロツクドイソシアネート化合物（常温水硬
性ウレタンプレポリマー又は常温水硬性ブロツク
ドイソシアネート等と記載されていることもあ
る）を用いることができる。常温硬化性ブロツクドイソシアネート化合物
は、ポリイソシアネートと親水性ポリオールプレ
ポリマーとを反応させて得られた分子中に遊離イ
ソシアネート基を２個以上有するウレタンプレボ
リマーと特定のイソシアネートブロツキング剤と
を反応させて得られるものである。ポリイソシアネートとしては、例えば２，６−
トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジ
イソシアネート、ジフエニルメタン−４，4′−ジ
イソシアネート、キシリレンジイソシアネート、
ナフタレンジイソシアネート、ポリフエニレンジ
イソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソ
シアネート、イソホロンジイソシアネートが、得
られるブロツクドイソシアネート化合物の硬化時
間、安定性及びコスト等の面から好ましい。次に、親水性ポリオールプレポリマーとして
は、次の(イ)〜(ホ)に挙げたものが好ましい。 (イ) 分子量が1000〜20000のエチレンオキサイド
付加重合体。 (ロ) エチレンオキサイドと炭素数３〜６個のアル
キレンオキサイド50モル％以下との共重合付加
体であつて、分子量が1000〜20000のポリエー
テルポリオール。 (ハ) 脂肪族アミン、脂肪族アミド、ジカルボン酸
又は多官能性アルコールとエチレンオキサイド
との付加物であつて、分子量が1000〜20000の
もの。たとえばヤシ油アミン、大豆油アミン、
牛脂アミン、ステアリルアミン、エチレンジア
ミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレ
ンジアミン、ピペラジン、水添牛脂アミド、オ
レイルアミド、フタル酸、マレイン酸、コハク
酸、マロン酸、アジピン酸、トリメチロールプ
ロパン、グリセリン等の各エチレンオキサイド
付加物。 (ニ) 脂肪族アミン、脂肪族アミド、ジカルボン酸
又は多官能性アルコールと、エチレンオキサイ
ド及び炭素数３〜６個のアルキレンオキサイド
50モル％以下との付加物で分子量が1000〜
20000のもの。たとえばヤシ油アミン、大豆油
アミン、牛脂アミン、ステアリルアミン、エチ
レンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキ
サメチレンジアミン、ピペラジン、水添牛脂ア
ミド、オレイルアミド、フタル酸、マレイン
酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、トリメ
チロールプロパン、グリセリン等と、エチレン
オキサイド及び炭素数３〜６個のアルキレンオ
キサイド50モル％以下との付加物。 (ホ) 分子量が1000〜20000のポリエステルポリオ
ール。たとえばテトラメチレングリコール、ポ
リエチレングリコール等と、フタル酸、マレイ
ン酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸等との
共エステル化物に、さらにエチレンオキサイド
を付加したもの、或いは分子量200以上のポリ
エチレングリコールとフタル酸、マレイン酸、
コハク酸、マロン酸、アジピン酸等との共エス
テル化物で末端OH基を有するポリエステルポ
リオールであつて、いずれも分子量が1000〜
20000のもの。本発明におけるウレタンプレポリマーを得るに
は、上記のポリイソシアネートと上記の親水性ポ
リオールプレポリマーとを、ポリイソシアネート
のNCO基に対する親水性ポリオールプレポリマ
ーのOH基の当量比（OH／NCO）が0.5〜1.0に
なる割合において、20〜120℃の温度で１〜50時
間反応させればよい。そのウレタンプレポリマー
は分子中に遊離のNCO基を２個以上有するもの
であつて、分子量1000〜20000のものになるよう
にするのが特に好ましい。次に、本発明におけるイソシアネートブロツキ
ング剤は、分子中に

【式】骨格を有する複素環式化合物が好ましく、具体的にはイミダ
ゾール、ベンズイミダゾール、２−メチルイミダ
ゾール、２−エチルイミダゾール、２−メチル−
４−エチルイミダゾール、２−フエニルイミダゾ
ール、２−メチルイミダゾリン、２−クロロ−
４，６−ビスエチルアミノ−Ｓ−トリアジン等が
挙げられる。次に、本発明における常温水硬性ブロツクドイ
ソシアネート化合物は、上記のウレタンプレポリ
マーと上記のイソシアネートブロツキング剤と
を、ウレタンプレポリマーのNCO基に対するイ
ソシアネートブロツキング剤のOH及び／又は
NH基の当量比〔すなわちOH／NCO、NH／
NCO、又は（OH＋NH）／NCO〕が0.2〜２に
なる割合で反応させて得られるが、その反応条件
は、温度０〜150℃で１〜50時間、好ましくは温
度50〜90℃で１〜４時間である。得られた常温硬化性ブロツクドイソシアネート
の水溶液を前記固定化酵素に被覆し、常温20分乃
至１日放置することによりウレタンプレポリマー
で被覆された固定化酵素が得られる。該プロツク
ドイソシアネート化合物の水溶液の濃度は５〜95
重量％、好ましくは20〜60重量％で用いられ、ま
た水溶液の代りにPH緩衝溶液を使用することもで
きる。被覆する方法は任意の方法が採用される
が、担体が膜状体の場合は塗布法、浸漬法、管状
又は試験管状体の場合は管又は試験管等の内壁に
該ブロツクドイソシアネート化合物の水溶液を流
入させ、またビーズ状体の場合には浸漬法等が使
用される。該ブロツクドイソシアネート被膜の厚
みは通常約1μ〜約10μである。本発明の方法で製造される固定化酵素の用途の
例は次のとおりである。固定化酵素膜は酸素電
極、過酸化水素電極、二酸化炭素電極、アンモニ
ウムイオン電極などの電極に装着することにより
酵素センサーとして使用できる。又固定化酵素管
状体は固定化酵素反応装置として臨床検査分野で
の分析計への前処理反応部として使用でき、ビー
ズ状固定化酵素は医薬品合成、食品加工等の分野
での充填型反応装置として使用できる。次に実施例、比較列を挙げて本発明を更に詳細
に声明する。実施例１〔〕ブロツクイソシアネートプレポリマーの製
造分子量1000のポリエチレングリコール70重量
部とトリレンジイソシアネート30重量部を反応
させ未反応のトリレンジイソシアネートを5.6
モル％含むイソシアネートプレポリマーを得
た。このイソシアネートプレポリマー中の遊離
のNCO基は8.6モル％であつた。次いでこのイソシアネートプレポリマー87重
量部にイミダゾールを13重量部添加し、撹拌
下、90℃、３時間反応させてブロツクドイソシ
アネートプレポリマーを得た。〔〕固定酵素膜の製造塩化ビニル樹脂（重合度1000）８重量部、ジ
メチルホルムアミド溶媒92重量部より均一な溶
液を調製し、この溶液の１部をポリエステル製
不織布（日本バイリーン(株)製、膜厚約38μｍ）
をおいた20×20cmのガラス板上に流延し、直ち
にメタノール浴中へガラス板ごと30分間浸漬し
た。その後これを水中に入れ水置換を行つた。
次に膜を直径９mmの円形に打ち抜き（膜厚65μ
ｍ）、グルコースオキシダーゼ（東洋紡績社製）
溶液（0.1モルキリン酸塩バツフアー、PH5.6の
100mg／dl）0.6ml中に４℃に24時間浸漬した。この膜を前記イソシアネートプレポリマーの
20重量％水溶液（0.1モルリン酸塩バツフアー、
PH5.6）に５分間浸漬した後、室温下、４時間
放置してウレタンポリマーで被覆された固定化
酵素膜を得た。この固定化酵素膜の酵素活性は
270ｍＵ／cm²であつた。尚、酵素活性の測定は、酵素反応により生じ
たH₂O₂をペルオキシダーゼ存在下、３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾンとジエチ
ルアニリンを酸化縮合させ、生じたインダミン
色素を吸光度590nｍで測定した。1U（ユニツ
ト）は37℃、PH5.1において１分間に１マイク
ロモルのβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコン酸
とH₂O₂に酸化する活性量とした。次にこの固定化酵素膜を過酸化水素電極（例
えば、Enzdyme Microb.Technol.、1981、No.
３、326）参照）に装着し、酵素電極を作製し
た。〔〕グルコースの定量上記酵素電極を37℃、PH5.6の0.1モルリン酸
塩バツフアー液0.99mlを入れたセルに浸漬し、
次に０〜1000mg／dl各種濃度のグルコース標準
液10μを撹拌しながら、マイクロデイスペン
サーを用いてセル中に投入し、酵素反応を15秒
間行なわせて発生した過酸化水素の酸化電流を
ポーラログラフ法により測定したところ、グル
コース濃度と電流値の間に良好な直線関係が得
られた。次に37℃、PH5.6の0.1モルリン酸塩バ
ツフアー液0.99mlを入れたセルに、150mg／dl
のグルコース標準液10μを投入し、約2000
回、２ケ月測定を繰り返した。その結果２ケ月
後においても電極活性の低下は認められず、使
用安定性は良好であつた。実施例２実施例１の〔〕にて得た塩化ビニル樹脂膜を
直径９mmの円形に打ち抜き（膜厚65μｍ）、ウリ
カーゼ（東洋紡績社製）溶液（0.05モルホウ酸塩
バツフアー、PH8.5の100mg／dl）0.3ml中に24時
間浸漬した。この膜に実施例１の〔〕にて得た
イソシアネートプレポリマーの40重量％水溶液を
塗布し、室温下、４時間放置してウレタンポリマ
ーで被覆された固定化酵素膜を得た。この固定化
酵素膜をオーリング（JIS−Ｗ−1516−５、内径
60.7mm）に接着後、室温にて２日間風乾して乾燥
固定化酵素膜を得た。この膜を10ケ月間冷蔵庫に
て４℃で保存後、約３分、0.05モルホウ酸塩バツ
フアー、PH8.5）の溶液に浸漬した湿潤状態にも
どし、酵素活性の測定をしたところ、乾燥前の活
性110ｍＵ／cm²に対し、105ｍＵ／cm²と保存安定性
も良好で、乾燥状態から湿潤状態への復帰も早か
つた。なお酵素活性の測定は、尿酸の293nｍにおけ
る紫外部吸収法により行なつた。尚、1U（ユニツ
ト）は25℃、PH8.5にて１分間に１マイクロモル
の尿酸をアラントインに変える活性量である。比較例１グルコースオキシダーゼ（東洋紡績社製）500
mg／dl、上記実施例１の〔〕記載のブロツクド
イソシアネートプレポリマー40重量％濃度の0.1
モルリン酸塩バツフアー（PH5.6）溶液を調製し、
この溶液の１部をポリエステル製不織布（日本バ
イリーン(株)製、膜厚約38μｍ）をおいた20×20cm
のガラス板状に流延し、室温下に１日放置後、
0.1モルリン酸塩バツフアーにて洗浄を行ない膜
厚約40μｍの固定化酵素膜を得た。この固定化酵
素膜の酵素活性は15ｍＵ／cm²と非常に低かつた。次に実施例１の〔〕と同様にしてこの固体酵
素膜を過酸化水素電極に装着して酵素電極を作成
し、グルコースの定量を実施したところ、出力が
低くグルコースの定量はできなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１塩化ビニル樹脂を一種または二種以上の溶媒
(A)に溶解して該樹脂濃度を２〜25重量％の溶液と
し、該溶液を塩化ビニル樹脂の貧溶媒でかつ溶媒
(A)の良溶媒となる一種または二種以上の溶媒(B)中
に浸漬して得られた担体を酵素を含む液に接触さ
せた後下記常温硬化性ブロツクドイソシアネート
化合物の水溶液に接触させることを特徴とする固
定涸化酵素の製造方法。常温硬化性ブロツクドイソシアネート化合物：
ポリイソシアネートと親水性ポリオールプレポリ
マーとを反応させて得られる遊離のNCO基を２
個以上有するウレタンプレポリマーと、分子中に
【式】骨格を有する複素環式化合物、ヒドロキシピリジン、ヒドロキシキノリン、及び
pKaが５〜9.5のフエノールから選ばれるイソシ
アネートブロツキング剤とを、該ウレタンプレポ
リマーのNCO基に対する該イソシアネートブロ
ツキング剤のOH基及び／又はNH基の当量比が
0.2〜２になる割合において反応させて得られる
常温硬化性ブロツクドイソシアネート化合物。２イソシアネートブロツキング剤が分子中に
【式】骨格を有する複素環式化合物である特許請求の範囲第１項記載の方法。