JPS6181785A - 酵素固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 八Ｂのμ畳および７“ 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。水溶液におけ
る酵素の不安定性を解消し、また連続的利用をはかるた
め酵素を不溶性とするいくつかの方法が知られている。

その一つとして包括法として知られる酵素をポリマーゲ
ル格子中に包み込んだり、あるいはポリマー皮膜で被覆
する方法がある。従来包括法に使用し得るポリマーゲル
としては、ポリアクリルアミドゲル、カラギーナンカリ
ウムゲル、アルギン酸カルシウムもしくはアルミニウム
等が知られているが、これらは膜強度が弱く、酵素のリ
ークが大きい欠点があった。

本発明者は、ウレタンプレポリマーと、水を含む鎖延長
剤との反応によって生ずるポリウレタンゲルによる酵素
の固定化を試みたが、通常のウレタンプレポリマーを使
用した場合、種々の困難があることがわかった。すなわ
ち反応が速いためゲルタイムが短く、操作が困難であり
、また発生するガスが逃げることができずゲル体に包み
込まれやすい。できたゲル体はそのため脆侶で酵素のリ
ークが大きく、連続長期使用に耐えられない。また、酵
素の安定性も小さく経日的に活性が低下する。さらに基
質透過性にも乏しい。さらにウレタンプレポリマーの遊
離イソシアネート基が酵素の蛋白自体と反応して酵素活
性を低下させる等の欠点もある。

本発明はこれらの困難を解消できる新しい酵素固定化法
を提供する。

族犬方跋 本発明は、水溶性ウレタンプレポリマー重亜硫酸塩付加
物と鎖延長剤との反応によって生ずるゲル中に酵素また
はその給源微生物菌体を包括することを特徴とする固定
化酵素の製造法に関する。

水溶性ウレタンプレポリマー重亜硫酸塩付加物すなわち
ウレタンプレポリマーの末端遊離イソシアネート基を重
亜硫酸塩でブロックしたプレポリマーの使用により、ゲ
ルタイムが長（なり、ゲル体内部にガス（ＣＯｚ）が包
み込まれることが少なくなり、酵素の固定化率も向上す
る。また、酵素活性残存率もよく、連続長期使用におい
ても安定性が大きい。できた股は強度が大であり、また
基質透過性にもすぐれている。また酵素蛋白とイソシア
ネート基との反応による酵素活性の低下も少ない。

好Ｉユ４惺様 水溶性ウレタンプレポリマー重亜硫酸塩付加物は織物の
防しわ加工等に使用される薬剤として市販されており、
周知である。それらは一般にポリオール成分とポリイソ
シアネートとを常法により反応させてウレタンプレポリ
マーをつ（す、その末端遊離イソシアネート基を重亜硫
酸塩、例えばナトリウム塩との反応によってブロック化
することにより製造される。例えばエチレンオキシド（
ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）とのプロ７り共重
合体よりなるポリエーテルポリオールおよびジイソシア
ネ−１・とから製造したウレタンプレポリ・　マーの重
亜硫酸塩付加物は次の式で表される。

Ｎａ０３ＳＯＣＨＮ−Ｒ−ＯＣＨＮ　　（ＥＯ）　＝（
ＰＯ）ｘ〜（ＥＯ）ｙ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＮＨＣＯＳＯａ
Ｎａ この化合物は水溶性であり、常温では安定であるが加熱
または活性水素含有化合物によりイソシアネート官能性
を再生し、水、ポリアミン、ポリオール等の鎖延長剤に
よって鎖延長し得る。

プレポリマーのポリオール成分としては公知のポリエー
テルポリオール、ポリエステルポリオール、ポリジメチ
ルシロキサン含有ポリオールなどを使用することができ
、またグリセリンやトリメチロールプロパン等の活性水
素を３個以上含む出発化合物にアルキレンオキシドを付
加して得られるポリエーテルポリオールまたはポリエス
テルポリオールも使用できる。これらポリオール成分は
生成物に適度の親水性を付与するためエチレンオキシド
を少なくとも１０重量％含むことが好ましい。

使用し得るポリイソシアネートとしては、通常のもので
よく、例えばトリレンジイソシアネート、キシリレンジ
イソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イ
ソホロンジイソシアネート等がある。

水溶性ウレタンプレポリマー重亜硫酸塩付加物は、例え
ば出願人会社からエラストロンなる商標名で市販されて
いる。

鎖延長剤としては、この場合水およびポリアミン、例え
ばヘキサメチレンジアミンが好ましく、特に両者を併用
するのが最も好ましい。

任意の酵素を固定化することができ、例えばアミラーゼ
、プロテアーゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ、
セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ等があり、これら
酵素の精製の程度は任意である。またこれら酵素の給源
微生物の菌体、例えばバチリス属等の細菌、アスペルギ
ルス属、リゾプス属、ペニシリウム属等のカビ、および
す、カロミセス属等の酵母、ストレプトミセス属等の放
線菌を固定化することもできる。

固定化手段としては、ポリマーゲル格子中に包み込む方
法がある。この方法では、ウレタンプレポリマー重亜硫
酸塩付加物を水または適当なｐＨ範囲、好ましくはｐＨ
９以上の緩衝液に熔解し、それへ酵素および必要に応じ
ヘキサメチレンジアミン等のポリアミンを加えてよくか
きまぜ、適当な大きさのバットへ注ぎ、全体を膜状にゲ
ル化させればよい。反応は室温でも進行するが、酵素が
失活しない温度、例えば５０℃までの温度に加温するこ
とによって促進される。

実流血 グリセリンへ、水酸基１個当たりエチレンオキシド９．
５モル、プロピレンオキシド９．５モルをそノ順序でブ
ロック状に付加して得られるポリエーテルポリオールと
、Ｏｆｔ／ＮＧＯ比１／２の割合で、２．５−ジメチル
ベンゼン−１，４−ジイソシアネートを反応させて得ら
れるウレタンプレポリマー０重亜硫酸ナトリウム付加物
の３５％水溶液１００部を室温でｐ）Ｉ９の緩衝液２５
０部に溶解し、これへリパーゼ（名糖産業社製）１００
■を加えてよくかきまぜ、次いでヘキサメチレンジアミ
ン４５部を加えて４０℃に加温し、これをホーローバッ
トへ注いで膜化した。膜化には２０分間か＼す、気泡は
殆ど入っていなかった。ゲル化完了後冷却し、ハサミで
ペレット状に細かく切断し、ビーカーに移し、５℃の冷
水で洗液が中性になるまで洗浄した。

このペレットのリパーゼ活性を測定したところ、用いた
酵素活性の５０％を保有していた。尚、本固定化物を１
ケ月間連続で基質を通して用いた後、酵素活性を測定し
たところ、固定化後の活性の９０％を保持していた。

止較桝 実施例と全く同じでただＮａＨＳＯａでブロック化して
いないウレタンプレポリマーを用いてリパーゼの固定化
を行った。　ｌｌｔ！化は２〜３分で起こり気泡が残り
脆弱な膜となった。この時のリパーゼ活性を測定したと
ころ、用いた酵素活性の１０％を保持しているに過ぎな
かった。尚、本固定化物を３日間連続で基質を通して用
いた後、酵素活性を測定したところ、固定化後の活性の
１０％を保持しているに過ぎなかった。また、５日後に
は膜はくずれ酵素は殆ど残っていなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 水溶性ウレタンプレポリマー重亜硫酸塩付加物と鎖延長
   剤との反応によって生ずるゲル中に酵素またはその給源
   微生物菌体を包括することを特徴とする固定化酵素の製
   造法。