JPS5856686A - 酵素利用による水性液体中の酸素除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水性液体中の酸素の濃度を低下させる組成物
及び方法に関する。

酸素と水との存在により、多くの物質が品質の低下をお
こす。この種の物質の代表的な例には、冷却水、堀さく
泥水等におけるごとく、水及び酸素に触れて腐食する鉄
のような種々の金属のほか、工業用又は食品として用い
られる有機性の物質多数が含まれる。

一部加水分解したポリアクリルアミドや、アクリルアミ
ドとアクリル酸とのコポリマー、及びそれらのアルカリ
金属塩は、二次及び三次採油法における移動度低下剤（
ｎｏｂｉｌｉｔｙ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）と
して有用な粘度調節剤（ｖｉｓｃｏｓｉｆｉｓｒ　）で
ある。

しかしながら、かかる粘度調節剤を含む増粘された水性
液中に通常存在する酸素によ、す、ポリマーが分解され
て溶液の粘性が失われやすい。

水と接触する構造材料に及ぼす酸素の有害影響を避ける
ため、種々の塗料、防食剤、酸素と反応させる還元剤、
及び安定剤を含む種々の方法が用いられた◇しかし、毒
性、反応性、価格及び（又は）長期有効性の欠如につい
ての欠点を有するものばかりである。

缶づめの食品及び飲料製品、例えばワイン、ビール、サ
イダーをはじめ他の密閉容器貯蔵食品は、色、におい、
風味、ビタミン含有量の変化又は缶の銹付きでわかると
おり、容器に入っていても酸素が共存すると品質が劣化
する。容器をあけた後では、酸化による分解が起こりつ
る。アップルサイダー、オレンジジュース等のような缶
づめ果汁に対しても酸素は有害な影響を与える。缶づめ
の野菜や缶入りミルクも有害な影響を受ける。

酸素が原因をなす食品の劣化や油田液ｌご用いるポリマ
ー性の粘度調節剤の分解に関する問題について、従来多
くの対策がたてられた。

油田液の例は、さく井に用いられる掘さく液又は掘さく
泥水である。この種の掘さく液には１例えば重みっけの
泥水、非重みっけの（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ）獣、及び
加塩泥水が包含され、さらにカルボキシメチルセルロー
ス等のようなカルボキシアルキルエーテルやポリグリコ
サン、ポリアクリルアミドその他のような、これらの泥
水にしばしば加えられる添加剤が含まれる。最後にあげ
た添加剤は、遊離酸素の存在下において酸化分解を生じ
やすい。

そのうえ、掘さく液は、水性相さく液中における遊離酸
素の存在によって酸化分解をおこしやすい器具で搬送さ
れるのが常である。

油田液という用語の範１１Ｈこは、坑井鋼管（ｗｅｌｌ
ｃａｓｌｎｇ　）を組立てた後、そして必らずというわ
けではないが、通常炭化水素の一次採取、すなわち、自
然圧力採取の後に用いられる水性液体である改修液（ｗ
ｏｒｋｏｖｅｒ　１ｉｑｕｉｄ　）のような液が包含さ
れる。従って、改修液には、二次採油に用いられる水又
は水攻シライン（ｂｒｉｎｅ　ｆ’１ｏｏｄ　）のほか
、三次採油に用いられる苛性水攻液、界面活性剤、水攻
水等が含まれる。また、この月給には、例えばポリアク
リルアミド、カルボキシアルキルセルロースエーテル、
生物多糖類（ｂｉｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒＬｄｅ）の
添加で水が増粘処理された、移動度緩衝液も包含される
。炭化水素の粘度を現場で低下させて高率採油をはかる
目的で地層内にポンプ送入される二酸化炭素も含まれる
。

これらの液体中に酸素が存在することは、液体の１種又
はそれ以上の成分にとって有害である、すなわち、液体
の１種又はそれ以上の成分が酸化分解をおこしやすいか
、又はそれ以外の方法で酸素の存在が有害要素となりつ
る。

例えば、遊離酸素の存在下において、ポリアクリルアミ
ドが分子量の低い成分に分解することは公知である。同
様に、セルロースのカルボキシアルキルエーテルやポリ
グリコサン又は生物多糖類も、直接又は好気性微生物の
媒介によって酸素の悪影響を受けやすい。さらに、高率
採油法に用いられる二酸化炭素のようなものに含まれる
少量の酸素は、現場におけるＣＯ，の炭化水素に対する
溶解度を低下させて、高率採油法におけるＣＯ２の効用
を低減させることもありうる。

油田液の成分又は油田液自体の有効性に及ぼす酸素によ
るこれらの有害影響のほかに、酸素が存在することによ
って、これらの液の輸送に用いられる機器類、例えばポ
ンプ、導管、坑井鋼管等が著るしくおかされる。

処理される水及び酸素含有液の例には冷却水等のような
循循水がある。この種の液中に遊離酸素が含まれること
は、貯油装置、ポンプ、導管等のような関連機器の腐食
の原因となる。

古くからの問題に対する新規解決策、特に従来の方法よ
りも有意にまさる新規方法が所望されている。

本発明者により、水性液体中に存在する酸素の童を低減
することによって、遊離（溶解）酸素の存在下において
酸化分解を受けやすい物質を保護する有効な方法が発見
された。その方法は、アルコールオキシダーゼの存在下
において、メタノール、エタノール、プロパツール及び
エタノールからなる群から選ばれるアル」−ルと酸素と
を反応させることからなるものである。本明細書で用い
る酸素含有水性液体というのは、水及び遊離酸素を含む
液体のことである。遊離酸素を含む液体の例には、油田
液、循環水、食料品等が含まれる。

本方法は、特に水性油田液系に用いて油田機器を保護し
、かつ液中に用いられるポリマー性の粘度調節剤の分子
崩壊を防ぐこと、及び食料品を処理することに適してい
る。

本発明によると、アルコールの存在下において、場合に
よってはカタラーゼを含むアルコールオキシダーゼから
なる酵素脱酸素システムによって、水性液体からの溶解
酸素の除去が有効に触媒される。本発明による好適な脱
酸素システムは、移動度緩衝液及び掘さく泥水のような
油田液体、循環水システム、貯水タンク、アルコール飲
料をはじめ他の食料品、その他の腐食及び酸化分解を防
止するのに有効である。この酵素系は支持体上に固定し
、または浴液として用いることもできる。

酸素除去についての酵素による触媒作用は、次の方程式
で説明される。

上記式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基であり、そし
てｙは水素又は炭素数１〜３のアルキル基である。

酵素カタラーゼは、透析精製を施したきわめて純度の高
いアルコールオキシダーゼプレバレージョンを除き、単
細胞蛋白質製造法に由来するアルコールオキシダーゼプ
レバレージョンに含まれている。上記の方程式（４）、
（Ｂ）及び（Ｃ）を一覧すると、夾雑物としての酸素を
含む水性アルコール系に対してアル」−ルオキシダーゼ
／カタラーゼの組合せを適用することによって、酸素と
副生物の過酸化水素との両者が最低限度こと抑えられる
ことがよくわかる。

酸素の存在は望ましくないが、副生物のアルデヒド及び
過酸化水素（アルコールオキシダーゼによる）は有害と
ならない時には、カタラーゼを必要とせずに高純度のア
ルコ−／Ｌ／オキシダーゼを用いることができる。例え
ば、メタノールを含む系においては、副生物はホルムア
ルデヒドとＨｚＯｇとである一： （Ｄ）　　　　ＣＨ，ＯＨ”Ｏ，イー二二つ＝−ユニ４
二４−とシど一＝二μ’４ＨＣＨＯ十Ｈ２Ｏ２アルコー
ルオキシダーゼ及びカタラーゼ各酵素は、例えばメタノ
ール又はエタノールの存在下における酸素除去を触媒し
、最終生成物としてそれぞれホルムアルデヒド又はアセ
トアルデヒド及び水を生じる。

触媒であるため、酵素は消費されることがなく、酸素と
水性アルコールとが存在する限り、その機能は継続する
。周囲酸素が枯渇すれば反応は停止するが、系内に酸素
を補給すれば回復することに注目すべきである。従って
、追加酸素が連続的に除去される０慣用の酸素捕集剤と
は異なり、酵素が消費されてしまうことはない。それ故
、水性アルコール混合物から比較的大量の酸素を除去す
るの番こ必要な酵素の量は比較的少量ですむ。

単細胞蛋白質製造法で得られる（１）全細胞懸濁液（ｗ
ｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　）及び（
２）崩壊細胞ホモジネート（ｒｕｐｔｕｒｅｄ　ｃｅｌ
ｌ　ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ　）にセける酵素は、掘さく
泥水のような閉基が問題でない分野における腐食防止に
適用可能である。（３）無細胞上澄液に含まれる酵素、
さらには（４）精製アルコールオキシダーゼ酵素は、装
置及び地下構造組織の閉塞が望ましくない分野での酸素
除去に用いるのがよい。上記の４種の酵素ゾレパレーシ
ョンは、すべて単細胞蛋白質製造法で得ることができ、
広い意味での水性液中の酸素除去触媒作用に有用である
。

濃厚水攻水の場合のように副生物のＨ２Ｏ２が不都合で
あるような用途番こおいては、アルコールオキシダーゼ
とカタラーゼとの両者が酵素含有系曇こ含まれることが
必要である。従って、全細胞懸濁液、崩壊細胞ホモジネ
ート及び無細胞上澄液が最も有用である。無細胞上澄液
は、例えば隙間のない地下構造組織（ｔｉｇｈｔ　ａｕ
ｂｔｅｒｒａｎｅａｎ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）における
ポリマー液や閉鎖冷却水システムのような水分配系に用
いるのが望ましい。所望によっては、アルミナのような
支持体上番こ酵素を固定することにより、酵素が水中に
は入りこまないで、溶解酸素とアルコールとを含む水が
酵素の内部又は上方を通過する際に、酸素除去を触媒す
るようにすることもできる。

特定の掘さく泥水のようにＨ，０２副生物が好ましい場
合には、精製アルコールオキシダーゼを使用する。発生
したＨ２Ｏ２は、掘さく泥水に含まれるカル〆キシメチ
ルセルロース又は殿粉と反応して、製品の改良に役立つ
。精製アルコールオキシダーゼの別の用途は水攻水の場
合であって、副生物のＨ黛Ｏ１１が地下坑内の嫌気性微
生物に対する殺生物剤として機能する。このような用途
においては、添加されたアルコール、例えばＣＨ３０Ｈ
と、その場で発生する副生物のＨ２Ｏ２との両者から重
複殺生物効果が得られる。地下坑内への０２の注入によ
って、さらに現場生成のＨｚＯｇ　ｔは増加し、付加的
な殺生物効果がもたらされる。

アルコール飲料及び食品に用いる場合には、副生物のＨ
２Ｏ２及びアルデヒドが有害である場合と１そうでない
場合とがあるので、各用途は別個に考える必要があり、
それぞれの条件に応じて酵素含有システムを選択すべき
である。

冷却水システムにおける主要な腐食成分の一つ゛は溶解
酸素であるため、冷却水に含まれる溶解酸素を低濃度に
保つ本発明を用いて金属腐食の低下をはかることができ
る。

水システムに含まれる溶解酸素以外の腐食成分は、例え
ばナトリウム、マグネシウム及びカルシウムの炭酸塩、
重炭酸塩、塩化物及び硫酸塩のような無機塩類である。

溶解酸素を含むシラインは清水よりも腐食性であると認
められている。腐食速度が高温及び低−によって促進さ
れることは公知である。一般に冷却水システムにおいて
は、普通の水道水に較べて無機塩類又はイオンの濃度が
着るしく高い場合がしばしばある。

本発明による脱酸素システムは、例えば凝縮器、エンジ
ンジャケット、熱交換器、蒸発器、水分配系、ならびに
貯水槽を通過する酸素含有の閉鎖循環水系に接触する鉄
その他の腐食しやすい金属の腐食を低減又は防止するの
に有効である。この酸素捕集システムは、循環水システ
ムに普通用いられる金属、特に鉄及び鋼を含む鉄系の金
属、それに亜鉛めっき鋼のほか非鉄金属、例えば銅とそ
の合金、アルミニウムとその合金、及び黄銅といった金
鵬類の防食に役立つ。実用条件から考えて、絶えず空気
（酸素）で再飽和される冷水塔又は蒸発凝縮器の脱酸素
が不可能であることはいうまでもない。

風味や色の変化、及び含有ビタミンの破壊などによって
わかるように、固形又は液体の食品における酸化分解の
有害作用は急速に進む。食品のなかには、これらの反応
がきわめて急速に進行し、加工処理がすまないうちに変
質する場合すらある。

別の面から見た問題点は、酸素の存在によって促進され
る腐食に弱い金属のよう９食品容器向体に用いられる構
造物質についてである。アップルサイダー、オレンジジ
ュース等の缶づめ果汁は、周囲酸素による悪影響を受け
る。缶づめ野菜、缶づめミルクのような他の製品も、周
囲酸素の存在によって悪影響されて酸敗及び変色環を起
こす。

本発明による酵素を触媒とした脱酸素システムは、包装
食品に含まれる周囲酸素を有効に除去することにより、
上述した酸化分解という悪影響を緩和することができる
。

本発明によれば、アルコールオキシダーゼと、Ｃ１〜Ｃ
４の直鎖アルカノールから選ばれたアルコールとを用い
て遊離酸素を含む水性液体を処理することにより、溶解
酸素が低減又は除去される。

アルコールオキシダーゼは、短鎖アルカノール上で成長
可能な種々の微生物から単離される。このアルコールオ
キシダーゼは次のような反応を触媒する： 上記式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基であり、モし
てＷは水素又はＲよりも１個炭素数が少ないアルキル基
である。

水性メタノール含有基質で培養することができ、アルコ
ールオキシダーゼの供給源となる好適な微生物を列挙す
ると次のとおりである： ブリオフラジウム・デリケセンス（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉ
ｕｍｄｅｌｉｑｕｅｓｃｅｎｓ　）　、ペシロミセス・
ヴアリオチ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｖａｒｉｏｔ
ｉ　）、トリコデルマ・リグノラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ　ｌｉｇｎｏｒｕｍ　）、カンシダ・ボイゾニイ
（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ　）、カンジダ・
メタノリカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ
　）、カンシダ・バラゾシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐ
ａｒａｐｓｉｌｏａｉａ　）　、　／％ンセヌラ拳カダ
スラタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｃａｐｓｕｌａｔａ　）
。

ハンセヌラ・グリコチマ（Ｈａｎａｅｎｕｌａ　ｇｌｙ
ｃｏｚｙｍａ）。

ハフ　４ｚ　ヌラ・ヘンリシイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　
ｈｅｎｒｉｃｉｉ）、ハンセヌラ轡ミヌタ（Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ）、ノ１ンセヌラ・ノンフェル
メンタンス（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔ
ａｎｓ　）　、ｔｚンセヌラ・フイロデンドラ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ　ｐｈｉｌｏｄｅｎｄｒａ　）、ノ１ンセ
ヌラ１１１１ｅリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａ　）、ノ翫ンセヌラ・ウイツケルハミ
イ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｖｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、
クロッケラ（１ｕｏｅｃｋｅｒａ　）種、ピチア・ノへ
ゾロフイラ（Ｐｉｃｈｉａ　ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ　）
、ビチア・リンドネリイ（Ｐｉｃｈｉａ　１ｉｎｄｎｅ
ｒｉｉ　）、ビチア・ツクスト１ノス（Ｐｉｃｈｉａ　
ｐａｓｔｏｒｉｓ　）、ビ、チア・ピヌス（Ｐｉｃｈｉ
ａ　ｐｉｎｕｓ　）、ぎチア・トレノ１０フイラ（Ｐｉ
ｃｈｉａ　ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ　）、トルロプシ
ス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉａ　ｇＬａｂｒａ
ｔａ　）、トルロプシス・ビヌス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ　Ｐｉｎｕｌ！ｌ）、トルロプシス・メタノドメルキ
イ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｍｅｔｈａｎｏｄｏｍｅｒ
ｑｕｉｉ）。

トルロプシス・メタノロヴエッセンス（Ｔｏｒｕｌｏｐ
ｓｉｓｍｅｔｈａｎｏｌｏｖｅｓｃｅｎｓ　）、トルロ
ゾシスーメタノソルボサ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｍｅ
ｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ　）、トルロプシス・ニトラ
トフイラ（Ｔｏｒｕｌｏｐａｉａｎｉｔｒａｔｏｐｈｉ
ｌａ　）等Ｏ 特に好ましいアルコールオキシダーゼは、ノ）ンセヌラ
・ポリモルファ及びビチア・パストリスの細胞から取得
される。

本発明に好ましいアルコールオキシダーゼは、ピチア属
の微生物及び遺伝学的及び（又は）分類学的にピチアに
近縁のものからなる１、メタノールを利用するビチア凰
の微生物から得られる。この種のメタノール利用型のピ
チア酵母には、ビチア・パストリス、ビチア・ビヌス°
、ビチア・トレハロフイラ及びピチア・モリシアナ（Ｐ
、ｍｏｌｉａｃｈｉａｎａ）が包含される。

アルコールオキシダーゼは、化学及び生物学的供給部門
から商業的に入手できる。しかし、好ましい態様におい
ては、選択された微生物によるアルコールの発酵を行っ
た後、アルコールオキシダーゼを分離することによって
アルコールオキシダーゼを得る。

アルコールオキシダーゼ（アルコール：酸素酸化還元酵
素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）　）は、ビチア・
パス）　ＩＪスから溶液の形で単離され、又は透析沈殿
法によって純粋に結晶化される。この酵母は、その全蛋
白質の約２０％がアルコールオキシダーゼである。この
酵素は発酵槽から取出された細胞懸濁液から単離された
。ダイノミル（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ）式がラスビーズミル
で細胞懸濁液を均質化してからアルコールオキシダーゼ
を含む生成上澄液を遠心分離によって細胞滓から分離し
た。１ｄについて２００〜３００酵素単位（Ｅｕ　）を
含むこの上澄液は、−を６．５にｉ１４節し、１０倍容
の水に対して透析することによってさらにこれを精製す
ることができる６粗酵素溶液のモルイオン強度（ｍｏｌ
ａｒｉｏｎｉｃ　ａｔ）ｅｎｇｔｈ　）を約０．２Ｍ燐
酸ナトリウムまで下げると、アルコールオキシダーゼの
沈殿が生じる。この沈殿は、上澄液に含まれる酵素単位
の８０％以上を含み、純度的９５％のアルコールオキシ
ダーゼである。

また、比較的酵素活性度が高い前記上澄液（２００〜３
００　Ｅｕ　／　ｒｎｌ　）は、２モルの過酸化水素を
１モルの酸素がスと２モルの水とに同時に酸化還元する
酵素であるカタラーゼを大量に含む０従って、ビチア・
パストリスからは種々の純度を有するアルコールオキシ
ダーゼが得られる。

（ｍｌ　全単細胞蛋白質懸濁液：細胞膜を通る拡散によ
り、長期間に亘ってアルコールオキシダーゼとカタラー
ゼとの両酵素が有効に作用する０（ｂ）　　崩壊細胞の
ホモジネート：有意量の細胞滓を含む溶液中において、
アルコールオキシダーゼとカタラーゼとの両酵素が有効
に作用する。

（Ｃ）　　（ｂ）を遠心分離した後の上澄液：アルコー
ルオキシダーゼ及びカタラーゼを含む酵素活性度が比較
的高い（２００〜３００　Ｅｕ／１Ｍ　）無細胞上澄液
。

（ｄ）　　（ｃ）　（Ｄ　透析による高純度アルコール
オキシダーゼ： める約９５％の純度を有する沈降アルコールオキシダー
ゼ 概していえば、アルコールオキシダーゼの好ましい製造
法に従い、メタノール利用微生物を用Ｉ／）、炭素エネ
ルギー基質としてのメタノールを発酵させることにより
、アルコールオキシダーゼ活性を有する細胞の水性懸濁
液が製造される。以下「アルコールオキシダーゼプレ７
（レーションＩＪ又番ま［ＡＯＰＩＪと呼ぶこの水性細
胞懸濁液は１細胞膜を通過する酵素の拡散によって比較
的長期間アルコールオキシダーゼ活性を発揮する。

この水性細胞懸濁液を均質化することにより、以下「ア
ルコールオキシダーゼゾレパレーショ装置」又は［、Ａ
ＯＰＩＪと呼ぶアルコールオキシダーゼ活性を有するホ
モジネートが得られる。

遠心分離、濾過その他によってこの種のホモジネートか
ら懸濁固形分を除くことができ、得られた上澄液、すな
わち、無細胞液は、［アルコールオキシダーゼゾレパレ
ーション１又は「ＡＯＰＩＪと呼ばれ、アルコ−　ルオ
キシダーゼを含む粗製溶液としてこれを用り−ることが
できる。

「アルコールオキシダーゼゾレパレーションＩＶＪ又は
［ＡＯＰ　ＩＶ　Ｊと称さ、れる結晶性の電気泳動的番
こ純粋なアルコールオキシダーゼは、限界濾過、透析又
は他の適当な方法を用いてＡＯＰ　Ｉから製造すること
ができるが、現在のところ透析法によるのが便利である
し、また望ましくもある０副生物のＨ２Ｏ２が望ましく
ない場合が多いが、その場合には有害量の遊離酸素を含
む水性液の酵素処理にカタラーゼ酵素を併用するのが望
ましい。

アルコールオキシダーゼとカタラーゼとの酵素組合せに
よって触媒される反応の正味の効果は、遊離酸素の有効
捕集と副生物のＨ２Ｏ２の水への変換とである。

アルコールオキシダーゼプレバレージョンＡＯＰ１　、
ＡＯＰ　Ｉ及びＡＯＰ　Ｉは、それぞれ実質的なカタラ
ーゼ活性を有しているので、本発明によるアルコールオ
キシダーゼとカタラーゼとの組合せ活性度が要求される
場合に、付加的なカタラーゼを加えなくてもよい。

しかしながら、結晶性のアルコールオキシダーゼＡＯＰ
　ＩＶは、実質的にカタラーゼ活性を有しておらず、Ｈ
２Ｏ２が存在していてもさしつかえない場合における望
ましいプレバレージョンである。カタラーゼ又は他の適
当な酵素、例えばベルオキシダーゼが所望されるならば
、これらをＡＯＰ　ＩＶに添加できることはもちろんで
ある。

本発明による酵素を触媒とする脱酸素システムは、６〜
９の一範囲で操作できるが、最適…範囲は６．５〜７６
５である。０〜６０℃の温度範囲が適当であり、最適な
温度範囲は約４０〜５０’Ｃである。酵素プレバレージ
ョンは、０℃において活性度のｍ織しつる程度の損失を
きたすことなく無期限に保存することができる。本発明
による脱酸素システムの触媒酵素は、５００ｐｐｍの全
溶解固形分（’Ｉ’Ｄ８　）から約３００ｓ　０００　
ｐｐｍ　ＴＤ８　（Ｄ　塩分範囲に亘って活性を示す。

安定剤について述べると、１００〜５００　ｐｐｍのホ
ルムアルデヒド又は０．ｏ２重ｆ％のアシ化ナトリウム
が、上記の−及び温度範囲内において酵素活性度を高水
準に保つのに有効である。

パチア・パス）　ＩＪス種の好適な酵母のうち、本発明
に好ましい代表的な２稽類の菌株は、イリノイス州ペオ
リアの米国農務省農業研究部の北部地方研究所（Ｕｎｉ
ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＡ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　　％　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　５ｅｒｖ１ｃｅ。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｌｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｌｅｓ　ｊに前もって供託され
た、ＮＲＲＬＹ−１１４３ｏ及びＹ−１１４３１と命名
された菌株である。

本発明によれば、炭素エネルギー源としてメタノールを
用いる好気性の水性発酵条件下において、メタノールに
対する反応性を有するビチア型酵母種を培養する。

メタノールが成長制限要因となるような条件下でメタノ
ールを供給するのが望才しい。メタノール制限条件は、
所与の発酵培養条件下に奢いて最大成長速度をもたらす
メタノールの最低洟度として定義される◎高細胞密度条
件下、すなわち、１）の７エルメント（細胞プラス水性
液）に対して乾燥重量基準で細胞密度が５０ｇ、より好
ましくは１００ｇ又はそれ以上の条件下ですさせるのが
望ましい。酸素、メタノール及び同化可能窒素源の存在
下において、選定酵母をバッチ式又５連続的に成長させ
る。癌技術分野で公知の種々のタイプの発酵法及び発酵
装置を用いることかできる。

例えば、米国特詐第５．９８２，９９８号に記載されて
いるような泡立ちタイプの発酵槽又は他の適当な発酵槽
を用いることができる。

必要酸素は、酸素の形そのまま、又は空気もしくは酸素
富化空気の形において、当業界で公知の圧力、例えば約
０．１〜１００気圧で発酵槽に供給することができる。

発酵圧力が高いほど溶解酸素量が増加して細胞の生産性
が高まるので、発酵圧力は一般には肌１〜１００気圧、
より普通には約１〜３０気圧、そしてより好才しくけ約
１〜５気圧の範囲内とする。

発酵のための同化性窒素源は、微生物の代謝に利用しや
すい形の窒素が得られる任意の有機又は無機の窒素含有
化合物、例えば蛋白、アミノ酸、尿素等及びアンモニア
、水酸化アンモニウム、硝酸アンモニウム等とすること
ができる。本発明に好ましい窒素源は、便利さ及び入手
しやすさから見てアンモニア及び水酸化アンモニウムで
ある。

微生物の成長は、フエルメントの操作温度に敏感である
。微生物の各特定菌株ごとに、その成長最適温度が異な
る。例示的発酵温度は、約２０’Ｃから約６５℃までの
範囲内である。

酸性又はアルカリ性の物質を適宜加えることにより、水
性微生物フエルメントの−は、通常的３〜７、より好ま
しく、かつ、より普通には約３．５〜５．５の範囲内に
調節される。個々の微生物の種についての好ましい特定
−範囲は、用いられる媒質、ならびに個々の微生物によ
っである程度変動する。従って媒質を変えた場合には−
を若干変えなくてはならないが、当業者であればそれを
容易に決定することができる。

用いた微生物についての特定所要量をまかなうと共に、
水溶性の栄養素のキャリヤーとなるのに充分な水をフエ
ルメント内に維持する。鉱物質、発育因子、ビタミン類
等を基本媒質に添加するが、その量は培養微生物の菌株
及び選択された培養条件によって変動する。これらの量
は当業者にとって公知であるか、又は１易に決定できる
。典型的な栄養媒質は後記の実施例に示されている。

アルコールオキシダーゼ製造゛：単離 選択された微生物の細胞を含む水性懸濁液である液体を
製造する。この水性液体は発酵槽流出液そのままであっ
てもよいし、１又は後述するように一調節をす才せたも
のであってもよい。別法として、例えば遠心分離による
か、又は個々の細胞の大きさよりも小さな孔径を有する
濾過器を用いて懸濁微生物細胞を最初に発酵媒質から分
離した後、好都合な容量の水もしくは適当な水性緩衝液
、例えば０，２ＭのＫＨ２ＰＯ４／　Ｎａ２ＨＰＯ４緩
衝液中に再懸濁させてもよい。水性懸濁液中の細胞密度
が、最低晶出密度よりも濃くなくてはならないことを発
見した。１１の液に対する乾燥重量基準の細胞密度が約
７ＦＭ以上であると、良好な結果が得られる。液体とし
て発酵槽流出液を用いるとすれば、最も満足すべき結果
を得るためには、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウ
ムのような塩基を添加することによって、まず−を約７
．５に調節することが必要である。−が臨界的要素であ
るとは思われないので、均質化を行う前に水性懸濁液の
−を調節することは必要でない。大ざっばにいって、約
６〜９の範囲内の−において酵素が活性であり、かつ、
安定であるので、上記範囲内に−を調節するのが望まし
い。

当技術分野において公知の適当な方法によって細胞含有
液の均質化を行うことができる。例えば、１１につき１
００〜１２０ｇの生物量（乾燥型Ｊｉ）の細胞密度にお
いてメタノール上で成長した酵母細胞を含む発酵槽流出
液は、約７．５の−にこれを調節し、そしてベルトコン
ビネーション＃６及び２０〜３０ｄ／時の流速を用いた
５°〜６０℃の連続操作の下において、０．６１の容器
を用いたＫＤＬ型のダイノミル（商標）でこれを均質化
することができる。得られたホモジネートから固形分を
分離すると、可溶性の成分として本発明のアルコールオ
キシダーゼを含む粗溶液が得られる。例えば、ホモジネ
ートの固形分を遠Ｉ、ｃ？分離によって除去することに
より、無細胞上澄液が生成される。

別法として、適当な孔径を有する濾過器でｐ遇すること
によって固形分を除去し、その後所望によっては−を調
節して最適活性度を有するものにしてもよい０もし、結
晶性のアルコールオキシダーゼの回収のように、さらに
精製したいならば、−を５．７５〜６．７５、好ましく
は６．５に調節することができる。アルコールオキシダ
ーゼを含む上記の粗溶液は、有効な酵素活性度を有し、
その形態で有効に利用される。

アルコールオキシダーゼ製造：結晶性アルコールオキシ
ダーゼ 可溶性のアルコールオキシダーゼの粗溶液を処理するこ
とによって、結晶性のアルコールオキシダーゼを回収す
ることができる。その方法として、硫酸アンモニウムを
用いて分別沈殿させ、いちだんと濃縮された固体の形で
回収するか、又は最も好ましい方法として、常用の透析
条件下もしくは限外濾過の適用によって回収率を高めた
透析法を用い、最高の活性度を示す高性能結晶形として
回収する。

透析を行うに当っては、アルコールオキシダーゼを透過
させないが、水、緩衝液及び無機の分子を透過させる半
透膜を横切って、可溶性のアルコールオキシダーゼ含有
粗溶液を透析媒質に対して透析する。この粗溶液は、本
発明のアルコールオキシダーゼを晶出するのに有効な細
胞密度を有する水性液を均質化して製造される。有効細
胞密度が水性液１ノ当り約７５ｇ（乾燥重量基準）のと
きに、満足すべき結晶化が認められた。結晶化は、それ
よりも低い有効細胞密度でも起きるが、結晶性アルコー
ルオキシダーゼの回収量が劣る。経験的に決定しつる最
低細胞密度（最低晶出密度）以下では、結晶性アルコー
ルオキシダーゼは実質的に回収されない。

使用される半透膜のタイプは臨界的要素であるとは考え
られず、任意の適当な半透膜を用いてよい。例えば、市
販されている酢酸セルロース透析チューブを用いて透析
袋を形成してもよいし、又は中空ファイバー透析セルを
用いてもよい。例えば水又は緩衝液のような透析媒質に
対してアルコールオキシダーゼ含有溶液や透析を行い、
０．０５Ｍないし０．０１　Ｍの回収域（ｒｅｃｏｖｅ
ｒｙ　ｒａｎｇｅ　）内のイオン強度を有する半透膜の
＃素側に回収域溶液を得ることにより、電気泳動的に均
質の結晶性オキシダーゼの沈殿を起こさせる。

透析媒質は、透析操作の間に半透膜の酵素側の溶液のモ
ルイオン強度が、回収域の少なくとも一部に合致するよ
うな任意の媒質であってよい。例えば、アルコールオキ
シダーゼを含む粗溶液のモルイオン強度が肌２Ｍである
とすれば、透析媒質は適当な容量の蒸留水であってよい
。酵素を透析すべき対象液の容量は、半透膜の酵素側の
イオン強度が回収域の少なくとも一部に合致する限り、
臨界的要素であるとは認められない。

透析の操作中、アルコールオキシダーゼ含有溶液の−は
、適当な緩衝系を用いて約５．７５ないし約６．７５の
範囲内に保つべきである。適当な緩衝系は、例えば燐酸
二水素カリウム及び燐酸水素二ナトリウムからなる。最
大量の結晶性アルコールオキシダーゼを回収するために
は、−の範囲を約６．０〜６．５とするのが望ましい。

後記実施例かられかるとおり、広い一範囲内でアルコー
ルオキシダーゼの良好な結晶化が認められたが、酵素の
溶解性を最低にするための本発明ｌこおける一範囲は狭
い範囲で占められる。

約６．０〜６．２５の−及び約０．０２　Ｍのイオン強
度の条件下の溶液中において、アルコールオキシダーゼ
の溶解度は最低になる。従って、このような条件が得ら
れるように透析を計画すれば、最適の結晶化が達成され
る。上記の条件に合致する大容量の緩衝液に対して酵素
含有溶液の完全透析（ｅｚｈａｕａｔｌｖｅ　ｄｉａｌ
ｙｓｉｓ　）を行うことにより、良好な結晶化を達成す
ることかで゛きる。また、平衡状態時点又は透析開始後
間もない時点のいずれかにおいて、最適結晶化条件が達
成されるように透析システムの設計を行ってもよい。例
えば、−６，２５において０．２Ｍのイオン強度を有す
る粗酵素溶液は、９倍過剰の蒸留水（粗酵素溶液の容量
に対し）に対して透析するこ１とができる。平衡状態時
点においては、粗酵素溶液のイオン強度は０．０２　Ｍ
であり、そして結晶化が起きる。この種の方法は、平衡
が起きるまでに要する時間が比較的長いという欠点を有
している。

しかしながら、粗酵素浴液のモルイオン強度が例えば０
．０５　Ｍであれば、９倍過剰の蒸留水（粗酵素溶液に
対し）に対して透析して平衡状態にすれば、得られる溶
液のイオン強度は０．００５　Ｍとなる。この平衡イオ
ン強度は回収域の範囲外であるため、生じた結晶は再び
精解する傾向を有する。

しかしながら、透析を開始して間もなく結晶が生成し、
系が平衡状態になって再溶解現象が起きる前に結晶の除
去及び回収を行うことができる。この最後にあげた透析
方法は、結晶性のアルコールオキシダーゼの回収時間を
短縮できるので、本発明にとって好ましい方法である。

約４℃ないし４０℃の範囲内の温度において透析を安全
に実施することができる。結晶を起こさせるには、一般
的には１時間以上、そして好ましくは１８時間又はそれ
以上の充分な時間をかける必要がある。

透析が終結した時点で、アルコールオキシダーゼは結晶
性の固体として透析袋の中に含まれる。

例えば透析袋の中の液体をデカンテーションして固形結
晶から除去することｌこより、この結晶性のアルコール
オキシダーゼを透析媒質から容易に分離することができ
る。湿潤結晶に対して保存に必要な加工をさらに施すこ
とができる。例えば、結１スラリーを凍結乾燥して乾燥
粉末となし、又は水もしくは好ましくは燐酸塩緩衝液に
溶解してもよい。アルコールオキシダーゼは、有意な酵
素活性損失なしに凍結保存することができる。変性（ｄ
ｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　）及び酵素活性損失に対して
酵素溶液を安定化するものとして公知のスクロースもし
くはグリセロール又は０．０２重量％のアシ化ナトリウ
ムのような安定剤化合物を酵素溶液に添加することがで
きる。

製造後の酵素を約４°〜４０℃、好ましくは約４゜〜２
４℃、そして最も好ましくは約４℃の温度に維持するの
が適切な保存法である。−７，５の０．１Ｍ燐酸塩緩衝
液中４℃において酵素を保存し、例えば約０．０２％の
アシ化す）　ＩＪウムを用いて微生物の成長を抑制する
ならば、保存中におこる酵素活性の損失はわずか最低量
であるにすぎない。

ピチア系の微生物からアルコールオキシダーゼを製造す
る方法においては、粗酵素溶液を透析する過程で結晶性
の固体が生成し、それ以上の精製工程の必要性は−めら
れなかった。この結晶性アルコールオキシダーゼは、製
造が容易であって比較的廉価なアルコールオキシダーゼ
であるため、本来ならば経埼的な面から利用をためらう
ような応用面にも利用することができる。

ピチア系アルコールオキシダーゼの特性について ビチア型の微生物から単離されるアルコールオキシダー
ゼを代表するものは、ピチア・パストリスから分離され
たアルコールオキシダーゼである。

ドデシルｍ［ナトリウム（８Ｄ８　）　ｒルミ気泳動で
調べると、「ビチア」から誘導されたアルコールオキシ
ダーゼは均質である。このアルコールオキシダーゼは、
５ＤＳＩｆル電気泳動法及びアルコールオキシダーゼの
分子量推定値から推測して、推定分子量が７２，０００
であるサブユニット６個又はそれ以上からなるものと推
測される。この酵素は、酵素サブユニット１個あたり約
１個のＦＡＤ　（フラビンアデニンジヌクレオチツド）
部分を含む補酵素としてのＦＡＤを有するフラピン蛋白
質である。

メタノールに対する見掛けのミノ１エリスの定数Ｋｍは
約４ｍＭである。電気泳動分析の結果は、ピチア酵素の
分子量がカンシダ・ざイゾニイから単離されたアルコー
ルオキシダーゼの分子量よりも大きいことを示唆してい
る。ビチア酵素は、アゾ化す）　ＩＪウムを結合する程
度及びｐＨ６，５の０．０２　Ｍの燐酸ナトリウム中に
おける結晶形成能力の点において、ハンセヌラ・ポリモ
ルファから単離されたアルコールオキシダーゼとは異な
っている。

ビチア誘導酵素の特性値の測定結果を表Ｉに示す。種々
の基質に対する反応性は、メタノールに対する反応性が
１００％であるとして標準化したものを示しである。

表　！ 特性　　　　　　　　　　　　　ビチア・パストリス分
　子　ｔ５００，０００　（推定） 補酵素　　　　　ＦＡＤ サブユニットの数　　　　　　　　６個又はそれ以上（
推定）最適活性度 温度（℃） （広義）　　　　　　　　　　６５°〜４５°士（最適
）　　　　　　　　　４５゜ （広義）　　　　　　　　　６〜９ （最適）　　　　　　　　　８・０ メタノールに対するＫｍ　（ｍＭ）　　４阻害剤　　　
　　ＨＣＨＯ ）３９ｍＭ ビチア誘導アルコールオキシダーゼは、多くの点で他の
報告されたアルコールオキシダーゼと異なっている。特
に、ビチア・パストリス力）らのアルコールオキシダー
ゼは、低級アルコール及びホルムアルデヒドに対して反
応性で厄るが、アセトアルデヒＰ又は有機酸に対して反
応性でない。

本発明に従い、任意の有効な形態においてアルコールオ
キシダーゼを利用することができる。すなわち、本アル
コールオキシダーゼは、ＡＯＰ　ｔのような全細胞懸濁
液として、あるいはＡＯＰ　Ｉのような粗ホモゾネート
として、あるいはＡＯＰ■のような無細胞上澄液として
、あるいはＡＯＰ　ＩＶのような精製結晶性酵素として
添加することができる。

大抵の用途において、水及び遊離酸素を含む液にアルコ
ールオキシダーゼを添加することができるが、例えば適
切な基体上にアルコールオキシダーゼを固定し、この固
定された＃素の上又はその中に酸素と低級アルコールと
を含む液を通すことも本発明の範囲内である。所望又は
必要に応じ、カタラーゼ又はペルオキシダーゼのような
別の酵素を上記のいずれかの方法に同時に用いることが
可倒　　Ｉ ポリアクリルアミドの増粘水溶液 未発明による接媒的脱酸素システムは、ポリアクリルア
ミドを含む増粘水性媒質の溶液粘度安定剤ならびに周囲
酸素の存在下における鉄パイプ。

遺留水（ｃｏｎｎａｔｅ　ｗａｔｅｒ　）、第一鉄、と
ドロ硫化物及びヒドロ亜硫酸塩のような還元剤の機能を
有する。例えばカタラーゼを含むメタノール／メタノー
ルオキシダーゼ系の溶液粘度安定化作用は、恐らく０２
及び副生物のＨ２Ｏ，の除去を触媒する能力が反映され
るものと思われる・ 溶解酸素の除去により、ポリアクリルアミドが低分子量
成分に酸化分解するのが防止され、それによって溶液粘
度の安定化効果が発揮される。実際の油田における作業
はなんか月も続くことがしばしばある以上、三次採油操
作に用ｉられる安定化増粘水性液は長期間に亘って比較
的一定不変の粘度を示すものでなければならない。粘度
調節剤が高率採油操作における最も高価な成分であるこ
とがしばしばであることを思うと、ポリマー性の粘度調
節剤の保護は重要である。

酵素を触媒とした脱酸素システムは、注入液９所望の粘
度特性を保つのに有効である。

以下の実験によって本発明を説明する。

水性ポリアクリルアミド（５００ｐｐｍ　）混合物の各
１００１の小試料を６個の別々の三角フラスコに入れて
ｔム栓を施した。粘゛度の１ｌｌＪ定を行う前に、次の
とおり溶液の調製を行った。

（夏）　フラスコＮｎ１：２重量％のヒドロ亜硫酸ナト
リウム原液０．５ｄを１．５−の清水（５００ｐｐｍＴ
ＤＳ　）と共に加えて１１！Ｌ２Ｂ１０４１００　ｉｌ
ｌ）ｍとしち（２）　　フラスコ−２：２重量−のヒド
ロ亜硫酸ナトリウム原液０．５ｄ及び１重量％のチオ尿
素原液１１ｍ＃を清水（５００ｐｐｍ　ＴＤ８　）　０
．５　ｄと共に加えてＮａ２８２０４１　［３０ｐＩ”
及びチオ尿素１１００ｐｐとした。

（３）　　フラスコ亀３：清水（５００ｐｐｍ　ＴＤ８
　）　２　ｗを加え、溶液中に１時間Ｎ、を気泡導入し
て混合物の脱酸素を行った。

（４）　　フラスコ−４：１重量％のケゾラチョ（ｑｕ
ｅｂｒａｃｈｏ　）原液を加えてケゾラチョ２００ｐｐ
ｍとした。

（５）　　フラスコＮｎ５：アルコールオキシ／−セ（
パチア・パストリスから調製したアルコールオキシダー
ゼの無細胞上澄液ムＯＦ　Ｎを本実施例で用いた）　０
．１１Ｉｊ（０，３Ｆ！ｕ／ｄ）、メタノール０．０５
ｄ及び清水（５００ｐｐｍ　ＴＤ８　）ポリツー溶液に
加えた（メタノール１００　ｐｐｍ　）。

（６）　　フラスコ−６＝対照としてのポリマー溶液を
用いた。このポリマー溶液の初期粘度は７５°Ｐで３９
．４　ｃｐであった。

脱酸素処理を施したフラスコぬ５内の試料を除く上記混
合物を周囲条件下において攪拌して空気にさらした後、
ビム栓で密封し、１２０°Ｆの水浴中に７２時間装いた
。観察された粘度を表ＩＫ示すＯ 表　　璽 １　対照Ｎ！Ｌ１ＪＯ４１−９１−８ ２対　照　チオ尿素／ｌｉｌＬｇＥ１１０４　Ｈ２３，
１２０−４（Ｑ） ６　対照　　ｘ２３０．１　２７．５ ４　対照　ケデラチ！　　　　　　９．０　　　３．８
（＆）　　粘度の測定はＵＬアダプターを６　ｒｐｍで
回転させたゾルツクフィールドＬＶＴ粘度計を用いて行
った。

（ｂ）　　ポリアクリルアミドの初期粘度は７５°Ｆで
３９．４　ｏｐであった。

（ｃ）　　Ｎａを溶液中に気泡導入した０表１を見ると
、本発明のアルコールオキシダーゼシステム（フラスコ
陰５）の溶液粘度安定化効果が窒素脱酸素システム（フ
ラスコ−３）Ｋ匹敵し、ヒドロ亜硫酸塩システム（フラ
スコ−１）、ヒト四亜硫酸塩／チオ尿素システム（フラ
スコ地２）、ケゾラチョシステム（フラスコ−４）及び
未処理のポリマーシステム（フラスコ陽６）よりも丁ぐ
れていることがわかる。

ヒドロ亜硫酸ナトリウム（フラスコ鳩１）は当技術分野
において酸素捕集剤として認められているに拘らず、上
記実験の条件下における結果は不良であった。ポリアク
リルアミＦの存在下における酸素ととドロ亜硫酸塩との
相互作用で生成した遊離ラジカル種がポリマーに作用し
た結果、低分子成分へのポリマーの連鎖分断が起こり、
溶液粘度の低下が観察されたのであろう。もし、ポリマ
ーを加える前にヒドロ亜硫酸塩によってすべての酸素が
水から除去され、その後に得られたポリマー溶液を、例
えば密封ガラス毛細管粘度計内に貯蔵することによって
酸素と接触させないようにすれば、溶液粘度は１００日
以上一定不変に保たれるであろう。フラスコ−２におい
ては、チオ尿素が多分遊離ラジカルを捕捉し、そのため
に前記のポリマーの分断が抑制されて浦波粘度が有効に
安定化されたのであろう。

アルコールオキシダーゼ／メタノールシステムによる酸
素捕集反応中にポリマーの連鎖分断が生じないこと（フ
ラスコ−５）は、１４４時間の試験期間を通して溶液粘
度が比較的一定に保たれていることによって実証されて
いる。第１図な見ると、０．６Ｅｕ／＋＋＋７のアルコ
ールオキシダーゼ及び５００　ｐｐｍのメタノールで処
理した５　００　ｐｐｍのぼりアクリルア叱ド水溶液〔
ハーキ五レス（Ｂｅｒａｕｌｅｅ　）　Ｎ）ｉ　３３５
ポリアクリルアミド〕が、２０時間後にも７５°Ｆで４
０　ｃｐの粘度であったのに対し、ヒドロ亜硫酸塩を含
ませた同じポリアクリルア建ド水溶液は、同じ反応条件
下において２０時間後に約１０ｏｐＫ粘度が低下したこ
とがわかる。

上記のとおり、とドロ亜硫酸ナトリウムはポリマーの導
入に先立って使用して水から酸素を除去し、その後で得
られた混合物を酸素と接触させないよう処して溶液粘度
の低下を防止することが必要である。

もし、ポリマー溶液が酸素と再接触しても、アルコール
オキシダーゼシステムは有効ＶＣｍ素ｍ集な続ける。所
望によっては、好ましくはカタラーゼも含まれているア
ルコールオキシダーゼ−メタノールシステムをヒドロ亜
硫酸塩システムと組合わせて用いることにより、粘度を
安定化させた水性液を得ることができる。

第２図及び第６図は、オクラホマ州パードルスピルの酸
素飽和水道水についての結果に基づく、本発明に用いる
べきメタノール及びアルコールオキシダーゼの最適１１
度に関する指針となるものである。第２図においては、
全試料について０．１７ＩＣｕ／ｄのｉ１＃度のアルコ
ールオキシダーゼを含ませた。１酵素単位（ｍｕ）は、
１分間に１きクロモルのメタノールをホルムアルデヒド
に変換させるのに要する酵素の量である。第２図に示さ
れるとおり、存在する酸素の９０１及び５０チを除去す
るためには、メタノールのシステム内濃度が１６３ｐｐ
ｍの場合それぞれ約２２分及び９分必要であつた。第３
図においては、すべての試料ともメタノール濃度は１６
３　ｐｐｍであった。このシステムにおいては、アルコ
ールオキシダーゼの上澄液１　ｍｌ当’）　０．３４酵
素単位のアルコールオキシダーゼ濃度の場合、存在する
酸素の９０％及び５０％を除去するのに必要な時間はそ
れぞれ８．５分及び３分であった。第２図及び第３図に
木づくと、アルコールオキシダーゼの最適濃度は、水性
液１Ｒ１当り０．２〜０．４酵累単位であり、そしてメ
タノールの最適濃度は全液体容量基準で約１５０〜２０
０ｐｐｍである。溶解酸素の浸度測定は、ペックマンフ
ィールドラブ（Ｂｓｃｋｍａｎ　Ｆｉｅｌｄｌａ’ｂ　
）式酸素分析器を用いて行った。この計器は、組成及び
温度既知の酸素飽和水を用いて°較正を行ったものを用
いた。

例　　！ 少量の酸素の存在によって瓶づめビールの望ましくない
濁りが生じる。この酸素は、ビールの中に溶解し、及び
（又は）ビールの上部表面上の空間内に少量存在する酸
素である。下記の例に示すとおり１本発明によるアルコ
ールオキシダーゼ−カタラーゼ含有脱酸素システムを組
合せて用いることにより、周囲酸素をビールから除去す
ることができる。

瓶づめビールの少量の試料を開放容器内で周囲温度に温
めた。この供試ビールの小試料３ｄを貯蔵器に入れ、溶
解酸素測定ゾローブ（ペックマン）をセットした。酸素
濃度は１００％飽和とし、帯型記録計を用いて記録をと
った。ＦＪ（４，１５及び７に予備調節したビール試料
１及び２に対し、零時間の時点において、カメラーゼも
含まれているアルコールオキシダーゼの粗プレバレージ
ョンＡＯＰＩ（ぎチア酵母、２００ｇｕ／ｄ）を１Ｎｌ
添加した。

溶解酸素が初期の０ｇｍ度の５０％に低下する時間（１
，。）及び初期の０２濃度の１０％に低下する時間（ｔ
ｘ。）を表Ｉに示す： 表　　■ １　　　　　４．１５　　　　２．０　　　　　　６．
５２７０．１０．５ 表Ｉの結果かられかるとおり、アルコールオキシダー−
ｔ／′／カタラーゼを含む脱酸素システムは、比較的短
い時間内にビールからの酸素除去を触媒するのに有効で
あった。

５０〜６０％のエタノールの存在下において同様の実験
を行ったところ１本発明のアルコールオキシダーゼ／カ
タラーゼシスダムは有効に脱酸素を達成した。このこと
は、本発明の触媒系が蒸留酒にも利用で籾ることを示唆
するものである。

例　　１ 本例においては、アルコールオキシダーゼをカルボキシ
メチルセルロース、　ＫＦ！ＬＺＡＮ　（ケルコ・ケは
カル社（Ｋｅｌａｏ　Ｏｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から
市販されている粘度調節用生物多糖類〕、所望によって
＆ｉゲルタールアルデヒドを存在させた活性炭、殿粉〔
例えばマリンクセット・ケミカル社 （Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｏｈｅｍｉａａｌ　Ｏｏ
、）製のもの〕及びクレー類、例えばアタパルシアイト
及びカオリナイトのような基体上に固定化した場合を示
す。アルコールオキシダーゼは、酵母菌株ビチア・７４
！ストリスによるメタノール発酵から得たＡＯＰ　Ｎの
均質無細胞上澄液であった。

種々の支持体物質を小形蒸発皿に入れ、その上に均質無
細胞上澄液としてのアルコールオキシダーゼ（前記のム
ＯＦ　Ｉ　）の所定量をかぶせたＯこの混合物を手動攪
拌し、周囲条件下で蒸発させて各支持体上に固定された
オキシダーゼの固形残渣を得た０＠残渣の酵素活性度を
調べるため、Ｏ−アニシジン、水、アルコール及びペル
オキシダーゼからなる色素−ペルオキシダーゼ試験液に
各プレバレージョンの０．１り分を接触させた・各試験
にお′いて現われた特有の赤色は、吸着されたアルコニ
ルオキシダーゼが、アルコール及び水の存在下における
溶解酸素の除去に関して触媒的活性度を有することを示
すものであった。主な結果を表■に示す： 表　　■ アルコール及び水の存在下における酸素除、去触媒作用
のために支持体上に固定されたアルコールオキシダーゼ ナ ｘｚＩＪｚＡＮＱ（１２５（＋）　　　　　　　ＮＲな
しす 殿　粉　ＯＩ　　　　　２５　　　　　（ト）　　　　
　ＮＲなしアタノ背アイト（５）　　　　（５）　　　
　　　（♂＊但）　　　　　Ｒ，＋　　　　　２ノー）
★★　　　　　　　　　ナ カオリナイト　（５）　　　　　（５）　　　　　　（
±）　　　　　　　　ＮＲ〆（ｄ）　　ＰＨ８は、ビチ
ア均質上澄液（２５ｄ当り約２８０酵素単位）を示す。

（ｅ）　　この試験は、風乾した残渣につ−て行った。

（ｆ）８週間後に依然として活性であったことを示すＯ 低）　木炭を６．５時間ＰＢＥＩ中に浸漬し、次Ｋ　Ｏ
，２Ｍの燐酸塩緩衝液（ｐＨ８）の中で、２．５−のゲ
ルタールアルデヒド２〇−中で１時間接触させた。

次に処理のすんだ支持体を０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（Ｆ）
１７．０　）に溶解した１ＭのＮａＣｊ、０．００５　
Ｍ燐酸塩緩衝液（ＦＪ（７，０）及び水で２回連続的に
洗浄してから４℃で保存した。

（ｈ）　　＊＊は、活性度試験の結果が疑わしかったが
、「溶解酸素」プローブ試験では活性が証明されたこと
を示す。

（ｉ）　　ＮＲすはＪ流通反応器（ｆｌｏｗ　ｒｅａｏ
ｔｏｒ　）内で試験を行わなかったことを示す。

（ｊ）　　〆は、「溶解酸素」プローブ試験により、ア
ルコールオキシダーゼが活性であることが判ったことを
示す。

（ｋ）　　処理の終わった木炭支持体をガラス管の流通
システム内に置き、溶解酸素を含み、０．１重量％のメ
タノールを混入した水が、固定された処理支持体上を連
続的に通過するようにした。溶解酸素検査ゾローゾを用
いて流出物にＩまれる溶解酸素量を絶えず監視した。水
はポンプによって１０ｄ／分の速度で流通系内に流した
。流出物に含まれる溶解酸素流は、２日後に約２ｐｐｍ
の水準に安定化されたように見うけられた。

ゲルタールアルデヒドを用いない木炭プレバレージョン
によっても、同じ結果が得られた。

上記の結果から、支持体上に固定されたアルコールオキ
シダーゼ試料が、アルコール及び水の存在下における溶
解酸素の除去な°促進する活性を有していることがわか
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルコールオキシダーゼ及びヒドロ亜硫酸ナ
トリウムをそれぞれ含むポリアクリルアミドの冷水溶液
の粘度の経時変化を比較したグラフであり、第２図は、
アルコールオキシダーゼの濃度を一定にした場合のメタ
ノール濃度と酸素除去に要する時間との関係を示すグラ
フであり、そして第３図は、メタノールの濃度を一定に
した場合のアルコールオキシダーゼの色度と酸素除去に
要する時間との関係を示すグラフである。 代理人　浅　村　　　皓 外４名 図面の浄１−（内容に亥、史なし） ♀　　　　８　　　　＆　　　　８　　　。 （４り　）　Ａど左ｕｌすｓｔ アルコ−１１−オ＋５／り：ｉ−で（Ｅリーク手続補正
書補正式） ％式％ １、事件の表示 昭和８７年特許願第　／／　２１１−ｂ３　　号３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 昭和５７年デ月２８日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄ＪＪ（内容夛こ変更なし） ８、補正の内容　　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）水性液体中に含まれる溶解した遊離酸素による、
   金属の腐食及び（又は）ポリマーの分解及び（又は）食
   品の品質低下を含む有害な影響を抑制する方法において
   、アルコールの存在下において前記液体をアルコールオ
   キシダ・−ゼで処理することにより、前記の物質を含む
   水性液体中に溶解している遊離の酸素を低減又は除去す
   ることを特徴とする方法。 （２）前記のアルコールが、１〜４個の炭素原子を含む
   直鎖のアルコールであることを特徴とする特許請求の範
   囲（１）に記載の方法。 （３）前記のアルコールオキシダーゼが、微生物ブリオ
   フラジウム・デリケセンス、ペシロミセス拳ヴアリオチ
   、トリコデルマ・リグノラム、カンシダ・ビオゾニイ、
   カンシダ・メタノリカ、カンシダ・バラゾシロシス、ハ
   ンセヌラ・カゾスラタ、ハンセヌラ・グリコチマ、ハン
   セヌラ・ヘンリシイ、ハンセヌラ・ミヌタ、ハンセヌラ
   ・ノンフェルメンタンス、ハンセヌラ・フイロデンドラ
   、ハンセヌラ・ポリモルファ、ハンセヌラ・ウイッケル
   ハミイ、タレツケラ種、ピチア・ハブロフイラ、ビチア
   ・リンドネリイ、ピチア・パストリス、ピチア・ピヌス
   、ビチア・トレハロフィラ、トルロプシス・グラゾラタ
   、トルロプシス・ビヌス、ト／Ｌ／　Ｏｆシス・メタノ
   ドメルキイ、トルロプシス・メタノロヴエッセンス、ト
   ルロプシス・メタノソルボサ又はトルロプシス・ニトラ
   トフイラによるメタノール含有水性基質の発酵によって
   誘導されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
   （２）に記載の方法。 （４）前記のアルコールオキシダーゼが、ピチア・パス
   トリス、ビチア・ビヌス、ビチア・トレハロフイラ又は
   ビチア・モリシアナを用いたメタノールの水性好気発酵
   から誘導されたものであることを特徴とする特許請求の
   範囲（３）に記載の方法。 （５）増粘されたポリアクリルアミド水溶液の粘度を安
   定化させることを特徴とする特許請求の範囲（１）〜（
   ４）のいずれか１項に記載の方法〇（６）前記の水性液
   体が冷却水であることを特徴とする特許請求の範Ｗｉ（
   １）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。 （７）前記の水性液体がビールである１ことを特徴とす
   る特許請求の範囲（１）〜（４）のいずれか１項に記載
   の方法。 （８）　　前記の水性液体が堀さく泥水であることを特
   徴とする特許請求の範囲（１）〜（４）のいずれか１項
   に記載の方法。 （９）前記の水性液体が油田液であることを特徴とする
   特許請求の範囲（１）〜（４）のいずれか１項に記載の
   方法。 翰　カタラーゼ又はペルオキシダーゼによっても液体を
   処理することを特徴とする特許請求の範囲（１）〜（９
   ）のいずれか１項に記載の方法。 αυ　アルコールオキシダーゼが、 （ｍｌ　カタラーゼをさらに含む全単細胞蛋白質懸濁液
   であるか、 （ｂ）　　カタラーゼをさらに含む崩壊細胞のホモジネ
   ートであるか、 （Ｃ）（（転）を遠心分離して誘導された上澄液である
   か、（ｄ）　　（Ｃ）の透析による高純度のアルコール
   オキシダーゼであるか、又は （ｅｌ　　支持体上の固定酵素であることを特徴とする
   特許請求の範囲（１）〜（１１のいずれか１項に記載の
   方法。