JP2512578B2 - 新規アスコルビン酸オキシダ―ゼ及びその製造方法 - Google Patents
新規アスコルビン酸オキシダ―ゼ及びその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なアスコルビン酸オキシダーゼ、及び
その製造方法に関する。
その製造方法に関する。
飲食物の劣化に酸素が関与することが知られており、
劣化防止のために飲食物中の酸素を無機鉄剤で除去する
方法が知られている。しかしながら、この方法には無機
鉄剤が非食性材料であることに基く種々の制約及び問題
点が存在する。
劣化防止のために飲食物中の酸素を無機鉄剤で除去する
方法が知られている。しかしながら、この方法には無機
鉄剤が非食性材料であることに基く種々の制約及び問題
点が存在する。
無機鉄剤に代る脱酸素剤として酸素消費性の酵素であ
るグルコースオキシダーゼ又はアルコールオキシダーゼ
を用いる方法がある。しかしながら、これらの酵素はそ
の基質と反応する際に有毒物質である過酸化水素を生成
せしめ、これが飲食物に混入するという欠点を有する。
るグルコースオキシダーゼ又はアルコールオキシダーゼ
を用いる方法がある。しかしながら、これらの酵素はそ
の基質と反応する際に有毒物質である過酸化水素を生成
せしめ、これが飲食物に混入するという欠点を有する。
本発明は、上記のような欠点を有しない酵素として、
アスコルビン酸オキシダーゼを提供するものであり、さ
らに該酵素の製造方法を提供するものである。
アスコルビン酸オキシダーゼを提供するものであり、さ
らに該酵素の製造方法を提供するものである。
ところで、アスコルビン酸を酸化する酵素の一種であ
るアスコルビン酸オキシダーゼは各種の植物に分布する
ことが知られており〔酵素ハンドブック（朝倉書店）15
8〜159頁〕、カボチャ（Men Hui Lee及びCharles R.Daw
son,J.Biol.Chem.,Vol.248,No.19,6596-6602,1973;並び
にJean Dayan及びCharles R.Dawson,Biochemical and B
iophysical Research Communication,Vol.73,No.2,451-
458,1976）、及びキュウリ（T.Nakamura,N.Makino及び
Y.Ogura,J.Biol.Chem.,Vol.64,No.2,189-195,1968）か
ら単離されている。しかしながら、これら植物由来のア
スコルビン酸オキシダーゼは酸性域では作用しにくいた
め、ジュースなど酸性飲食物の劣化防止のためには適当
でない。また、酵素を植物から大量に安価に得ることは
困難である。
るアスコルビン酸オキシダーゼは各種の植物に分布する
ことが知られており〔酵素ハンドブック（朝倉書店）15
8〜159頁〕、カボチャ（Men Hui Lee及びCharles R.Daw
son,J.Biol.Chem.,Vol.248,No.19,6596-6602,1973;並び
にJean Dayan及びCharles R.Dawson,Biochemical and B
iophysical Research Communication,Vol.73,No.2,451-
458,1976）、及びキュウリ（T.Nakamura,N.Makino及び
Y.Ogura,J.Biol.Chem.,Vol.64,No.2,189-195,1968）か
ら単離されている。しかしながら、これら植物由来のア
スコルビン酸オキシダーゼは酸性域では作用しにくいた
め、ジュースなど酸性飲食物の劣化防止のためには適当
でない。また、酵素を植物から大量に安価に得ることは
困難である。
微生物由来のアスコルビン酸オキシダーゼとしてはミ
ロセシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）の
菌糸由来のもの、及びエーロバクター・エロゲネス（Ae
robacter aerogenes）由来のものが知られている（舟木
ら、日本栄養・食糧学会誌Vol.40,No.1,47〜51,198
7）。
ロセシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）の
菌糸由来のもの、及びエーロバクター・エロゲネス（Ae
robacter aerogenes）由来のものが知られている（舟木
ら、日本栄養・食糧学会誌Vol.40,No.1,47〜51,198
7）。
本発明は、新規なアスコルビン酸オキシダーゼ及びそ
の製造方法を提供しようとするものである。
の製造方法を提供しようとするものである。
上記の課題を解決するため、本発明は、次の性質： （１）至適作用pHが3.5〜4.5である； （２）Fe++イオンにより活性化され、Cu++により阻害さ
れる； （３）分子量：ゲル濾過法により85,000±5,000の分子
量を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法において分子量23,000±2,000のサブユ
ニットを示す； （４）等電点：焦点電気泳動法により測定した場合pI4.
0を示す； （５）温度安定性:pH8.0、30分間反応で、60℃以下で安
定な活性を示す；並びに （６）pH安定性:4℃でpH4〜11の範囲で安定な活性を示
す； を有することを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼ
を提供する。
れる； （３）分子量：ゲル濾過法により85,000±5,000の分子
量を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法において分子量23,000±2,000のサブユ
ニットを示す； （４）等電点：焦点電気泳動法により測定した場合pI4.
0を示す； （５）温度安定性:pH8.0、30分間反応で、60℃以下で安
定な活性を示す；並びに （６）pH安定性:4℃でpH4〜11の範囲で安定な活性を示
す； を有することを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼ
を提供する。
本発明はさらに、アクレモニウム（Acremonium）に属
し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産することができ
る微生物を培養し、培養物からアスコルビン酸オキシダ
ーゼを採取することを特徴とするアスコルビン酸オキシ
ダーゼの製造方法を提供する。
し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産することができ
る微生物を培養し、培養物からアスコルビン酸オキシダ
ーゼを採取することを特徴とするアスコルビン酸オキシ
ダーゼの製造方法を提供する。
新規なアスコルビン酸オキシダーゼ （生産株） 低い至適pHを有するアスコルビン酸オキシダーゼを生
産する微生物を得るため保存株及び自然界から分離した
数千株について検索した結果、pH4付近に至適pHを有す
るアスコルビン酸オキシダーゼを生産する菌株が１株得
られた。
産する微生物を得るため保存株及び自然界から分離した
数千株について検索した結果、pH4付近に至適pHを有す
るアスコルビン酸オキシダーゼを生産する菌株が１株得
られた。
この菌株は、理化学研究所の微生物同定委託試験報告
書に従えば、不完全菌亜門（Deuteromycotina）、不完
全糸状菌網（Hyphomycetes）に所属するAcremonium Lin
k属菌と同定された。すなわち、本菌株の光学的顕微鏡
による観察結果は以下のとおりである。フィアライド及
びフィアロ型分生子を形成する。フィアライドはゆるや
かに先細りし、殆ど分枝せず、カラーは不明瞭である。
フィアロ型分生子は無色、平滑、１細胞、球形−亜球形
（まれに楕円形−卵型）、直径1.5〜２（〜４）μｍ、
粘塊状となる。やや遅れて形成されてくる閉子嚢殻様子
実体は、不完全糸状菌網Agyriella Sacc.属菌が形成す
る分生子座と類似したものである。この子実体（Conidi
omata）は白色、亜球形−楕円形、直径1mm以下であるが
肉眼で確認で、菌糸殻壁等により包まれていない裸生し
た分生子塊で、その内部には分枝した菌糸上に形成され
たフィアライドを有する。フィアライドはフラスコ形
で、基部は亜球形、先端は極端に先細りし、湾曲してい
るものが多い。フィアロ型分生子はAcremonium synanam
orphのものと形態学的には区別できないが、粘塊状で、
非常に多産で、分枝した菌糸間に蓄積される。よって、
本菌株をアクレモニウム・エスピーHI-25（Acremonium
sp HI-25）と呼ぶことにした。
書に従えば、不完全菌亜門（Deuteromycotina）、不完
全糸状菌網（Hyphomycetes）に所属するAcremonium Lin
k属菌と同定された。すなわち、本菌株の光学的顕微鏡
による観察結果は以下のとおりである。フィアライド及
びフィアロ型分生子を形成する。フィアライドはゆるや
かに先細りし、殆ど分枝せず、カラーは不明瞭である。
フィアロ型分生子は無色、平滑、１細胞、球形−亜球形
（まれに楕円形−卵型）、直径1.5〜２（〜４）μｍ、
粘塊状となる。やや遅れて形成されてくる閉子嚢殻様子
実体は、不完全糸状菌網Agyriella Sacc.属菌が形成す
る分生子座と類似したものである。この子実体（Conidi
omata）は白色、亜球形−楕円形、直径1mm以下であるが
肉眼で確認で、菌糸殻壁等により包まれていない裸生し
た分生子塊で、その内部には分枝した菌糸上に形成され
たフィアライドを有する。フィアライドはフラスコ形
で、基部は亜球形、先端は極端に先細りし、湾曲してい
るものが多い。フィアロ型分生子はAcremonium synanam
orphのものと形態学的には区別できないが、粘塊状で、
非常に多産で、分枝した菌糸間に蓄積される。よって、
本菌株をアクレモニウム・エスピーHI-25（Acremonium
sp HI-25）と呼ぶことにした。
なお、本アクレモニウム属菌は通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに微工研
菌寄第11236号として寄託され、そして平成２年１月29
日に微工研条寄第3124号（FERM BP-3124）としてブタペ
スト条約に基く国際寄託に移管された。
微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに微工研
菌寄第11236号として寄託され、そして平成２年１月29
日に微工研条寄第3124号（FERM BP-3124）としてブタペ
スト条約に基く国際寄託に移管された。
なお、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼの製造に
用いられる菌株としては、上記の株のみならず、その変
異株、さらには本発明の酵素を生産する他の株をも使用
することができることは言うまでもない。
用いられる菌株としては、上記の株のみならず、その変
異株、さらには本発明の酵素を生産する他の株をも使用
することができることは言うまでもない。
（培養） 次に、アクレモニウム属菌からアスコルビン酸オキシ
ダーゼを製造するための菌の培養法としては、いかなる
培養法でも良いが、例えば液体培養法について以下に述
べる。本発明に使用される培地としては、アクレモニウ
ム属に属し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産する微
生物が生育することの可能な培地であれば、如何なるも
のでも良く、例えばカビ或は放線菌の培養に用いられる
培地が使用される。例えば、グルコース、シュークロー
ス、グリセリン、デキストリン、糖密、有機酸等の炭素
源、更に例えばアミノ酸、ビタミン類、酵母エキス、肉
エキス、麹汁、ポリペプトン、タンパク質加水分解物等
より選ばれた１種以上を使用し、更に、カリウム塩、マ
グネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、
鉄塩、亜塩、銅塩等の無機塩を添加しないか或は一種以
上適宜添加したものが好適に用いられる。なお、培地の
初発pHは、例えば約3.5〜9.0、好ましくは約5.5〜6.5程
度に調整し、培養温度は通常15〜42℃、好ましくは約25
〜35℃程度で、１〜20日間、好ましくは３〜12日間程度
培養する。そして、好気的条件下、例えば振とう培養法
もしくはジャーファーメンターによる好気的深部培養法
により培養することが好ましい。
ダーゼを製造するための菌の培養法としては、いかなる
培養法でも良いが、例えば液体培養法について以下に述
べる。本発明に使用される培地としては、アクレモニウ
ム属に属し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産する微
生物が生育することの可能な培地であれば、如何なるも
のでも良く、例えばカビ或は放線菌の培養に用いられる
培地が使用される。例えば、グルコース、シュークロー
ス、グリセリン、デキストリン、糖密、有機酸等の炭素
源、更に例えばアミノ酸、ビタミン類、酵母エキス、肉
エキス、麹汁、ポリペプトン、タンパク質加水分解物等
より選ばれた１種以上を使用し、更に、カリウム塩、マ
グネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、
鉄塩、亜塩、銅塩等の無機塩を添加しないか或は一種以
上適宜添加したものが好適に用いられる。なお、培地の
初発pHは、例えば約3.5〜9.0、好ましくは約5.5〜6.5程
度に調整し、培養温度は通常15〜42℃、好ましくは約25
〜35℃程度で、１〜20日間、好ましくは３〜12日間程度
培養する。そして、好気的条件下、例えば振とう培養法
もしくはジャーファーメンターによる好気的深部培養法
により培養することが好ましい。
（精製方法） 次いで、このようにして得た培養物より菌体を除去
し、培養濾液を得る。培養物より、菌体を除去する方法
としては、如何なる方法でもよく、例えば通常の遠心分
離法もしくは濾過法等が挙げられる。そして、このよう
にして得た培養濾液からアスコルビン酸オキシダーゼを
単離し、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼを得る。
まず、培養濾液からアスコルビン酸オキシダーゼを単離
精製するには、例えば硫安分画処理、アルコール分画処
理、DEAE−セルロース処理、セファクリル処理、セファ
デックス処理、TSKゲルDEAEカラム処理等のいずれかを
必要に応じて組合わせた処理を行い、必要ならば脱水或
いは乾燥を行ない目的とする酵素を製造する。
し、培養濾液を得る。培養物より、菌体を除去する方法
としては、如何なる方法でもよく、例えば通常の遠心分
離法もしくは濾過法等が挙げられる。そして、このよう
にして得た培養濾液からアスコルビン酸オキシダーゼを
単離し、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼを得る。
まず、培養濾液からアスコルビン酸オキシダーゼを単離
精製するには、例えば硫安分画処理、アルコール分画処
理、DEAE−セルロース処理、セファクリル処理、セファ
デックス処理、TSKゲルDEAEカラム処理等のいずれかを
必要に応じて組合わせた処理を行い、必要ならば脱水或
いは乾燥を行ない目的とする酵素を製造する。
（酵素活性測定法） 本発明によって得られた新規なアスコルビン酸オキシ
ダーゼ活性の測定方法は以下に示すとおりである。0.5m
Mアスコルビン酸と0.5mMエチレンジアミン四酢酸二ナト
リウムを含んだ0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）1ml
を30℃で５分間予備加温した後、被検体の酵素液0.1ml
を加え、30℃で５分間反応させた後、反応停止液として
0.2M塩酸を3ml加え、245nmの吸光度を測定する。この
時、未反応混合液の245nm吸光度の減少から活性を求め
る。
ダーゼ活性の測定方法は以下に示すとおりである。0.5m
Mアスコルビン酸と0.5mMエチレンジアミン四酢酸二ナト
リウムを含んだ0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）1ml
を30℃で５分間予備加温した後、被検体の酵素液0.1ml
を加え、30℃で５分間反応させた後、反応停止液として
0.2M塩酸を3ml加え、245nmの吸光度を測定する。この
時、未反応混合液の245nm吸光度の減少から活性を求め
る。
１ユニットは前述の酵素活性測定条件下で１分間に１
μmolのアスコルビン酸を酸化する酵素量とする。
μmolのアスコルビン酸を酸化する酵素量とする。
（酵素の性質） アクレモニウム・エスピーHI-25が生産するアスコル
ビン酸オキシダーゼの性質は次の通りであった。
ビン酸オキシダーゼの性質は次の通りであった。
（１）至適作用pH pH2.6〜7.0の範囲で種々の緩衝液に使用し、30℃にて
５分間反応させた場合、第１図に示す結果が得られた。
本発明の酵素はpH3.5〜4.5に至適作用pHを有する。
５分間反応させた場合、第１図に示す結果が得られた。
本発明の酵素はpH3.5〜4.5に至適作用pHを有する。
（２）pH安定性 本酵素を種々のpHにおいて30℃又は４℃にて17時間イ
ンキュベートした後の残存相対活性は第２図に示す通り
であった。本発明の酵素は４℃にてpH4〜11の範囲で安
定である。
ンキュベートした後の残存相対活性は第２図に示す通り
であった。本発明の酵素は４℃にてpH4〜11の範囲で安
定である。
（３）至適作用温度 本酵素をpH4.0の酢酸ナトリウム緩衝液（0.5mM EDT
A）中で種々の温度で５分間反応させた場合の相対活性
は第３図に示す通りであった。本酵素はpH4.0において
は40℃〜55℃にて良好に作用する。
A）中で種々の温度で５分間反応させた場合の相対活性
は第３図に示す通りであった。本酵素はpH4.0において
は40℃〜55℃にて良好に作用する。
（４）温度安定性 本酵素を種々の温度で30分間、50mMリン酸緩衝液（pH
8.0）にてインキュベートした後の残存相対活性は第４
図に示す通りであった。本酵素は上記の条件下で60℃以
下で安定である。
8.0）にてインキュベートした後の残存相対活性は第４
図に示す通りであった。本酵素は上記の条件下で60℃以
下で安定である。
（５）分子量及びサブユニット構造 TSKgel G2000 SW Glassカラムを用い、分子量標準と
してウシ血清アルブミン（分子量66,000）及びリボヌク
レアーゼＡ（ウシ膵臓由来；分子量13,700）を用いてゲ
ル濾過法により測定した場合、約85,000±5,000の分子
を示す。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により、分子量標準としてホス
ホリラーゼｂ（ラビット筋肉由来；分子量94,000）、ウ
シ血清アルブミン（分子量67,000）、オバルブミン（卵
白由来；分子量43,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（ウシ赤血球由来；分子量30,000）、トリプシンインヒ
ビター（大豆由来；分子量20,100）、及びα−ラクトア
ルブミン（牛乳由来；分子量14,400）を用いて測定した
場合、分子量23,000±2,000に相当する単一バンドが認
められる。従って、本酵素はサブユニットの４量体であ
ると推定される。
してウシ血清アルブミン（分子量66,000）及びリボヌク
レアーゼＡ（ウシ膵臓由来；分子量13,700）を用いてゲ
ル濾過法により測定した場合、約85,000±5,000の分子
を示す。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により、分子量標準としてホス
ホリラーゼｂ（ラビット筋肉由来；分子量94,000）、ウ
シ血清アルブミン（分子量67,000）、オバルブミン（卵
白由来；分子量43,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（ウシ赤血球由来；分子量30,000）、トリプシンインヒ
ビター（大豆由来；分子量20,100）、及びα−ラクトア
ルブミン（牛乳由来；分子量14,400）を用いて測定した
場合、分子量23,000±2,000に相当する単一バンドが認
められる。従って、本酵素はサブユニットの４量体であ
ると推定される。
（６）酵素阻害剤の影響 下記の1mM濃度の阻害剤と共に30℃にて10分間インキ
ュベートした後の残存相対活性は次の通りであった。
ュベートした後の残存相対活性は次の通りであった。
以上の通り、本酵素は硫化ナトリウム（Na2S）及びア
ジ化ナトリウムにより失活するが、N,N−ジエチルジチ
オカルバミン酸ナトリウム及びEDTAによっては失活しな
い。
ジ化ナトリウムにより失活するが、N,N−ジエチルジチ
オカルバミン酸ナトリウム及びEDTAによっては失活しな
い。
（７）金属イオンの影響 各種金属イオン4.5mM濃度により影響は次の通りであ
った。
った。
以上の通り、本酵素はCu++イオンにより失活し、Fe++
イオンにより活性化される。
イオンにより活性化される。
（８）等電点 焦点電気泳動法により測定した場合、4.0の等電点を
示す。
示す。
以上の結果を既知酵素と比較すれば次の通りである。
本発明においてアスコルビン酸を酸化する酵素にはア
スコルビン酸オキシダーゼ及びポリフェノールオキシダ
ーゼ（ラッカーゼ）が包含される。
スコルビン酸オキシダーゼ及びポリフェノールオキシダ
ーゼ（ラッカーゼ）が包含される。
本発明のアスコルビン酸オキシダーゼは、該酵素によ
る酸素の消費に基く飲食物の劣化の防止のために使用す
ることができる。この方法の第一の態様においては、ア
スコルビン酸を十分に含有する飲食物にアスコルビン酸
を酸化する酵素を添加するか、あるいはアスコルビン酸
を含有しないか又は十分には含有しない飲食物にアスコ
ルビン酸を酸化する酵素及びその基質、例えばアスコル
ビン酸もしくはその塩又はイソアスコルビン酸もしくは
その塩を添加する。これにより、飲食物中のアスコルビ
ン酸等の基質がアスコルビン酸を酸化する酵素により酸
化される際に飲食物中の酵素が消費され、この結果飲食
物の劣化が防止される。
る酸素の消費に基く飲食物の劣化の防止のために使用す
ることができる。この方法の第一の態様においては、ア
スコルビン酸を十分に含有する飲食物にアスコルビン酸
を酸化する酵素を添加するか、あるいはアスコルビン酸
を含有しないか又は十分には含有しない飲食物にアスコ
ルビン酸を酸化する酵素及びその基質、例えばアスコル
ビン酸もしくはその塩又はイソアスコルビン酸もしくは
その塩を添加する。これにより、飲食物中のアスコルビ
ン酸等の基質がアスコルビン酸を酸化する酵素により酸
化される際に飲食物中の酵素が消費され、この結果飲食
物の劣化が防止される。
この方法においては、本発明の酵素及び前記のごとき
すでに知られている酵素の内、任意のものを使用するこ
とができる。しかしながら、果物ジュースなど酸性の飲
食物においては、既知の酵素は十分に機能しないため、
酸性域に至適作用pHを有する本発明の酵素を用いるのが
好ましい。使用する酵素の量は、飲食物の種類等により
異るが、一般に飲食物ｇ又はml当り0.001ユニット以上
であり、そして好ましくは飲食物ｇ又はml当り0.02ユニ
ット以上である。酵素量が多くても食品の劣化等の不利
益はないが、酵素を一定以上増加しても劣化防止効果が
それに応じて増加するとは限らない。
すでに知られている酵素の内、任意のものを使用するこ
とができる。しかしながら、果物ジュースなど酸性の飲
食物においては、既知の酵素は十分に機能しないため、
酸性域に至適作用pHを有する本発明の酵素を用いるのが
好ましい。使用する酵素の量は、飲食物の種類等により
異るが、一般に飲食物ｇ又はml当り0.001ユニット以上
であり、そして好ましくは飲食物ｇ又はml当り0.02ユニ
ット以上である。酵素量が多くても食品の劣化等の不利
益はないが、酵素を一定以上増加しても劣化防止効果が
それに応じて増加するとは限らない。
飲食物に添加するアスコルビン酸又はその塩の量は飲
食物の種類、飲食物に自然に含まれているアスコルビン
酸の量等により異るが、一般に、飲食物に対して0.01〜
1.0重量％、好ましくは、0.01〜0.5重量％である。な
お、アスコルビン酸の塩としては、そのナトリウム塩、
カリウム塩等を使用することができる。さらに、アスコ
ルビン酸又はその塩に代えてイソアスコルビン酸又はそ
の塩を使用することができる。
食物の種類、飲食物に自然に含まれているアスコルビン
酸の量等により異るが、一般に、飲食物に対して0.01〜
1.0重量％、好ましくは、0.01〜0.5重量％である。な
お、アスコルビン酸の塩としては、そのナトリウム塩、
カリウム塩等を使用することができる。さらに、アスコ
ルビン酸又はその塩に代えてイソアスコルビン酸又はそ
の塩を使用することができる。
本発明の飲食物の劣化防止法の第二の態様によれば、
アスコルビン酸を酸化する酵素及びその基質、例えばア
スコルビン酸もしくはその塩又はイソアスコルビン酸も
しくはその塩を水性媒体、例えば緩衝液に溶解して酸素
消費系を調製し、これと飲食物とを相互に接触せしめる
ことなく同一容器に密封する。この方法によれば、上記
酸素消費系により容器内の酸素が消費され、その結果飲
食物中の酸素が脱酸素される。この態様において酸素消
費系を構成する水性媒体、例えば緩衝液として、使用す
る酵素の至適作用pHと同じか又はそれに近いpH値を有す
るものを使用する。例えば、キュウリ由来のアスコルビ
ン酸オキシダーゼは5.6付近に至適作用pHを有するた
め、pH5〜７のリン酸緩衝液を用いるのが好ましく、本
発明のアクレモニウム属の株が生産する酵素は酸性域に
至適作用pHを有するため、例えばpH4〜５の酢酸緩衝液
を用いるのが便利である。
アスコルビン酸を酸化する酵素及びその基質、例えばア
スコルビン酸もしくはその塩又はイソアスコルビン酸も
しくはその塩を水性媒体、例えば緩衝液に溶解して酸素
消費系を調製し、これと飲食物とを相互に接触せしめる
ことなく同一容器に密封する。この方法によれば、上記
酸素消費系により容器内の酸素が消費され、その結果飲
食物中の酸素が脱酸素される。この態様において酸素消
費系を構成する水性媒体、例えば緩衝液として、使用す
る酵素の至適作用pHと同じか又はそれに近いpH値を有す
るものを使用する。例えば、キュウリ由来のアスコルビ
ン酸オキシダーゼは5.6付近に至適作用pHを有するた
め、pH5〜７のリン酸緩衝液を用いるのが好ましく、本
発明のアクレモニウム属の株が生産する酵素は酸性域に
至適作用pHを有するため、例えばpH4〜５の酢酸緩衝液
を用いるのが便利である。
この第二の態様におけるアスコルビン酸を酸化する酵
素及びその基質と飲食物との量的関係は、前記第一の態
様の場合と類似するが、第二の態様においては、飲食物
中の酸素のほかにその環境中（すなわち容器内）の酸素
をも消費する必要があるため、酵素及びその基質の量は
第一の態様の場合のそれよりやや多くするのが好まし
い。
素及びその基質と飲食物との量的関係は、前記第一の態
様の場合と類似するが、第二の態様においては、飲食物
中の酸素のほかにその環境中（すなわち容器内）の酸素
をも消費する必要があるため、酵素及びその基質の量は
第一の態様の場合のそれよりやや多くするのが好まし
い。
第二の態様の実施に当っては、酵素の溶液及び基質の
溶液を別々に調製し、これを混合した後に飲食物貯蔵容
器に入れ、この容器を密封することができる。しかしな
がら、酸素消費系による酸素の消費を飲食物の脱酸素の
ために効率よく利用するためには、酵素とその基質とを
反応しない状態で飲食物貯蔵容器に入れ、この容器を密
封した後に酵素反応を開始するのが好ましい。このため
には、例えば酵素溶液と基質溶液とを別個に収容して貯
蔵容器に入れ、この貯蔵容器を密封した後に一方の液を
他方の液に注入することができる。あるいは、酵素溶液
と基質溶液とを隔壁を隔てて収容し、貯蔵容器を密封し
た後、この隔壁を破壊して両溶液を混合することができ
る。また、酵素及び基質のいずれか一方を溶液として、
他方を粉末として貯蔵容器に導入し、貯蔵容器を密封し
た後に両者を混合することができる。他の態様において
は、酵素粉末と基質粉末との混合物と、酵素反応用媒体
例えば緩衝液とを別々に貯蔵容器に導入し、貯蔵容器を
密封した後に、前記粉混合物と反応媒体とを混合するこ
とができる。また、水と酸素を透過できる膜で酵素粉末
と基質粉末との混合物を包み込んだ状態で貯蔵容器に導
入し、使用時に飲食物と接触せしめることができる。
溶液を別々に調製し、これを混合した後に飲食物貯蔵容
器に入れ、この容器を密封することができる。しかしな
がら、酸素消費系による酸素の消費を飲食物の脱酸素の
ために効率よく利用するためには、酵素とその基質とを
反応しない状態で飲食物貯蔵容器に入れ、この容器を密
封した後に酵素反応を開始するのが好ましい。このため
には、例えば酵素溶液と基質溶液とを別個に収容して貯
蔵容器に入れ、この貯蔵容器を密封した後に一方の液を
他方の液に注入することができる。あるいは、酵素溶液
と基質溶液とを隔壁を隔てて収容し、貯蔵容器を密封し
た後、この隔壁を破壊して両溶液を混合することができ
る。また、酵素及び基質のいずれか一方を溶液として、
他方を粉末として貯蔵容器に導入し、貯蔵容器を密封し
た後に両者を混合することができる。他の態様において
は、酵素粉末と基質粉末との混合物と、酵素反応用媒体
例えば緩衝液とを別々に貯蔵容器に導入し、貯蔵容器を
密封した後に、前記粉混合物と反応媒体とを混合するこ
とができる。また、水と酸素を透過できる膜で酵素粉末
と基質粉末との混合物を包み込んだ状態で貯蔵容器に導
入し、使用時に飲食物と接触せしめることができる。
本発明のアスコルビン酸オキシダーゼはさらに、飲食
物の劣化防止方法において使用するための脱酸素剤の成
分として使用することもできる。この脱酸素剤は、開口
を有するか又は少なくとも一部分が気体透過性材料によ
り構成されている容器に、アスコルビン酸オキシダーゼ
及びその基質が、使用前にはこれらが相互に反応しない
ように収容されていることを特徴とする。この脱酸素剤
の容器は、その中でアスコルビン酸を酸化する酵素とそ
の基質とが反応する場合に該酸素剤容器の外の環境、例
えば飲食物貯蔵容器の内部、の空気を消費するように、
開口又は気体透過性部分を有する。前記酵素とその基質
とが該脱酸素剤の使用前に反応しないようにする手段と
して、種々の手段を用いることができる。
物の劣化防止方法において使用するための脱酸素剤の成
分として使用することもできる。この脱酸素剤は、開口
を有するか又は少なくとも一部分が気体透過性材料によ
り構成されている容器に、アスコルビン酸オキシダーゼ
及びその基質が、使用前にはこれらが相互に反応しない
ように収容されていることを特徴とする。この脱酸素剤
の容器は、その中でアスコルビン酸を酸化する酵素とそ
の基質とが反応する場合に該酸素剤容器の外の環境、例
えば飲食物貯蔵容器の内部、の空気を消費するように、
開口又は気体透過性部分を有する。前記酵素とその基質
とが該脱酸素剤の使用前に反応しないようにする手段と
して、種々の手段を用いることができる。
例えば、酵素溶液と基質溶液を別々の容器に入れ、こ
れらの容器を前記脱酸素剤容器に収容し、使用時にこれ
らの溶液を混合できるようにすればよい。例えば脱酸素
剤容器を逆転する。あるいは脱酸素剤容器に隔壁を隔て
酵素溶液及び基質溶液を収容しておき、使用時にその隔
壁を破壊することができる。具体例としては前記隔壁と
して容易に破ることができるフィルム又はシートからで
きた袋を用い、これを使用時に、例えば針状部材により
破ることができる。あるいは、酵素及びその基質の内一
方を溶液とし、他方を乾燥粉末として脱酸素剤容器に収
容し、使用の際これを混合することができる。別の方法
としては、酵素及びその基質を乾燥粉末状態で、反応用
緩衝液を入れた脱酸素剤容器に収容しておき、使用時に
該緩衝液と乾燥粉末とを混合することができる。上記の
種々態様において、粉末は例えばフィルム又はシートか
ら作られた袋に入れておき、使用の際にこの袋を針で破
り粉末と緩衝液とを接触せしめることができる。また、
液状飲食物に於いては酵素粉末と基質粉末との混合物を
酸素及び水を透過できるフィルム等でコーティングする
ことにより、使用時に飲食物と接触させることで目的を
達成することができる。
れらの容器を前記脱酸素剤容器に収容し、使用時にこれ
らの溶液を混合できるようにすればよい。例えば脱酸素
剤容器を逆転する。あるいは脱酸素剤容器に隔壁を隔て
酵素溶液及び基質溶液を収容しておき、使用時にその隔
壁を破壊することができる。具体例としては前記隔壁と
して容易に破ることができるフィルム又はシートからで
きた袋を用い、これを使用時に、例えば針状部材により
破ることができる。あるいは、酵素及びその基質の内一
方を溶液とし、他方を乾燥粉末として脱酸素剤容器に収
容し、使用の際これを混合することができる。別の方法
としては、酵素及びその基質を乾燥粉末状態で、反応用
緩衝液を入れた脱酸素剤容器に収容しておき、使用時に
該緩衝液と乾燥粉末とを混合することができる。上記の
種々態様において、粉末は例えばフィルム又はシートか
ら作られた袋に入れておき、使用の際にこの袋を針で破
り粉末と緩衝液とを接触せしめることができる。また、
液状飲食物に於いては酵素粉末と基質粉末との混合物を
酸素及び水を透過できるフィルム等でコーティングする
ことにより、使用時に飲食物と接触させることで目的を
達成することができる。
本発明の酵素を用いる方法によればアスコルビン酸を
酸化する酵素とその基質、すなわちアスコルビン酸もし
くはその塩又はイソアスコルビン酸もしくはその塩と反
応せしめることにより酸素を消費し、これによって飲食
物を脱酸素してその劣化を防止することができ、この場
合、上記酵素反応の結果過酸化水素が発生しないので、
グルコースオキシダーゼ等を使用するのと異り、飲食物
が有害な過酸化水素により汚染されることが無い。
酸化する酵素とその基質、すなわちアスコルビン酸もし
くはその塩又はイソアスコルビン酸もしくはその塩と反
応せしめることにより酸素を消費し、これによって飲食
物を脱酸素してその劣化を防止することができ、この場
合、上記酵素反応の結果過酸化水素が発生しないので、
グルコースオキシダーゼ等を使用するのと異り、飲食物
が有害な過酸化水素により汚染されることが無い。
また、アスコルビン酸を酸化する酵素及びその基質は
水溶液に溶解するため清澄な食品や飲料に添加してもそ
の外観を害することがない。
水溶液に溶解するため清澄な食品や飲料に添加してもそ
の外観を害することがない。
さらに、アクレモニウム属微生物によって生産される
本発明の酵素は酸性域に至適作用pHを有するため、これ
を用いて果物ジュース等酸性飲食物の劣化を防止するこ
とができる。
本発明の酵素は酸性域に至適作用pHを有するため、これ
を用いて果物ジュース等酸性飲食物の劣化を防止するこ
とができる。
かくして、本発明により、味噌、醤油、アルコール飲
料等の醸造飲食物、オレンジジュース、トマトジュース
等のジュース類、お茶、コーヒー等の嗜好飲料、レトル
ト食品類、乳製品類、油脂類等広範な種類の飲食物の劣
化防止を行うことができる。
料等の醸造飲食物、オレンジジュース、トマトジュース
等のジュース類、お茶、コーヒー等の嗜好飲料、レトル
ト食品類、乳製品類、油脂類等広範な種類の飲食物の劣
化防止を行うことができる。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
例1.（実施例）アクレモニウム・エスピーHI-25の培養 グリセロール１％（W/V）、ポリペプトン１％（W/
V）、肉エキス１％（W/V）、リン酸二カリウム0.1％（W
/V）及び硫酸マグネシウム７水塩0.0001％（W/V）の組
成からなる液体培地（pH6.0）を各100ml宛、500ml容振
とう培養フラスコ180本に分注し、常法により滅菌し、
次いで、これにアクレモニウムsp.HI-25を接種した後、
30℃10日間、振幅7cm、120R.P.Mで振とう培養し、アス
コルビン酸オキシダーゼの比活性（蛋白質当りの単位、
units/A280）0.0589の培養物を得た。
V）、肉エキス１％（W/V）、リン酸二カリウム0.1％（W
/V）及び硫酸マグネシウム７水塩0.0001％（W/V）の組
成からなる液体培地（pH6.0）を各100ml宛、500ml容振
とう培養フラスコ180本に分注し、常法により滅菌し、
次いで、これにアクレモニウムsp.HI-25を接種した後、
30℃10日間、振幅7cm、120R.P.Mで振とう培養し、アス
コルビン酸オキシダーゼの比活性（蛋白質当りの単位、
units/A280）0.0589の培養物を得た。
例2.（実施例）アクレモニウム・エスピーHI-25からの
アスコルビン酸オキシダーゼの精製 実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙No.2を用いて濾
別し、培養濾液11.5lを得た。これを酵素液とし、11.5l
に対し硫安を80％飽和になるように6.45kg加え、冷蔵室
で静置沈降を行なった。上澄部分は捨てて、沈澱部分は
遠心分離にかけ沈降区分を得た。これを20mM酢酸ナトリ
ウム−塩酸緩衝液（pH5.5）（以降、酢酸ナトリウム緩
衝液という）700mlに懸濁後、一夜、水を外液として透
析した。更に透析後、酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化し
たDEAEセルロース１を加えて、濾別した。得られた沈
澱区分に0.1M食塩を加えた酢酸ナトリウム緩衝液2lで活
性区分を溶出し、溶出液に80％飽和硫安塩析を行ない、
前述と同様沈澱区分を得た。これを、酢酸ナトリウム緩
衝液270mlに懸濁後、遠心分離により、固形部分を除
き、アスコルビン酸オキシダーゼ活性区分265mlを得
た。
アスコルビン酸オキシダーゼの精製 実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙No.2を用いて濾
別し、培養濾液11.5lを得た。これを酵素液とし、11.5l
に対し硫安を80％飽和になるように6.45kg加え、冷蔵室
で静置沈降を行なった。上澄部分は捨てて、沈澱部分は
遠心分離にかけ沈降区分を得た。これを20mM酢酸ナトリ
ウム−塩酸緩衝液（pH5.5）（以降、酢酸ナトリウム緩
衝液という）700mlに懸濁後、一夜、水を外液として透
析した。更に透析後、酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化し
たDEAEセルロース１を加えて、濾別した。得られた沈
澱区分に0.1M食塩を加えた酢酸ナトリウム緩衝液2lで活
性区分を溶出し、溶出液に80％飽和硫安塩析を行ない、
前述と同様沈澱区分を得た。これを、酢酸ナトリウム緩
衝液270mlに懸濁後、遠心分離により、固形部分を除
き、アスコルビン酸オキシダーゼ活性区分265mlを得
た。
さらに、この酵素液を、0.2M食塩を加えた酢酸ナトリ
ウム緩衝液で平衡化したセファクリルS-300カラム（５
×40cm）でゲル濾過を行ない、活性区分を集めた。次に
この活性区分を20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）に
対して、一夜透析した。更に透析後、酢酸ナトリウム緩
衝液（pH5.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラム
（５×9cm）にて食塩グラジェント溶出を行ない、0.02
〜0.08M食塩濃度近辺の活性区分を得た。この活性区分
を減圧濃縮により12mlに濃縮し、0.2モル食塩を加えた
酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で平衡化したセファデ
ックスG-100カラムでゲル濾過を行ない活性区分を集め
た。次に、この活性区分を酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.
0）で平衡化したTSKgel DEAE-5PWカラム（5mm×5cm）で
食塩グラジェント溶出を行ない、0.04〜0.06M食塩濃度
近辺の活性区分に精製されたアスコルビン酸オキシダー
ゼを得た。各精製段階の総タンパク質、全活性、比活性
及び収率は以下の表の如くであった。
ウム緩衝液で平衡化したセファクリルS-300カラム（５
×40cm）でゲル濾過を行ない、活性区分を集めた。次に
この活性区分を20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）に
対して、一夜透析した。更に透析後、酢酸ナトリウム緩
衝液（pH5.0）で平衡化したDEAE−セルロースカラム
（５×9cm）にて食塩グラジェント溶出を行ない、0.02
〜0.08M食塩濃度近辺の活性区分を得た。この活性区分
を減圧濃縮により12mlに濃縮し、0.2モル食塩を加えた
酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で平衡化したセファデ
ックスG-100カラムでゲル濾過を行ない活性区分を集め
た。次に、この活性区分を酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.
0）で平衡化したTSKgel DEAE-5PWカラム（5mm×5cm）で
食塩グラジェント溶出を行ない、0.04〜0.06M食塩濃度
近辺の活性区分に精製されたアスコルビン酸オキシダー
ゼを得た。各精製段階の総タンパク質、全活性、比活性
及び収率は以下の表の如くであった。
例3.（使用例）みかん・バレンシアオレンジジュースの
劣化防止 食品の一例として、濃縮還元のみかん・バレンシアオ
レンジ混合100％果汁に実施例２に従って調製し凍結乾
燥したアスコルビン酸オキシダーゼをpH4.0、0.1モル酢
酸ナトリウム緩衝液に溶解した酵素液とし（7.0units/m
l）、この10μｌを、予じめみかん・バレンシアオレン
ジジュースが充填され25℃にされた溶存酸素測定セルに
注入し脱酸素を行った。その結果は下記のとおりであっ
た。表中にはキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ（東洋紡（株）製）23units/ml（pH6.0）の活性のも
のを10μｌ前述同様にセルに注入し、脱酸素を行った結
果も示す。溶存酸素の測定は（株）東興化学研究所製DO
-METER MODEL TD-100を用いた。
劣化防止 食品の一例として、濃縮還元のみかん・バレンシアオ
レンジ混合100％果汁に実施例２に従って調製し凍結乾
燥したアスコルビン酸オキシダーゼをpH4.0、0.1モル酢
酸ナトリウム緩衝液に溶解した酵素液とし（7.0units/m
l）、この10μｌを、予じめみかん・バレンシアオレン
ジジュースが充填され25℃にされた溶存酸素測定セルに
注入し脱酸素を行った。その結果は下記のとおりであっ
た。表中にはキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ（東洋紡（株）製）23units/ml（pH6.0）の活性のも
のを10μｌ前述同様にセルに注入し、脱酸素を行った結
果も示す。溶存酸素の測定は（株）東興化学研究所製DO
-METER MODEL TD-100を用いた。
みかん・バレンシアオレンジジュース（グリコ製）の
pHは3.52であり、かかる低pHでのキュウリ由来のアスコ
ルビン酸オキシダーゼによる脱酸素はほとんど行なわれ
なかった。しかし、アクレモニウム・エスピーHI-25由
来のアスコルビン酸オキシダーゼを用いると20分間で0.
01ppmの酸素濃度とすることができた。
pHは3.52であり、かかる低pHでのキュウリ由来のアスコ
ルビン酸オキシダーゼによる脱酸素はほとんど行なわれ
なかった。しかし、アクレモニウム・エスピーHI-25由
来のアスコルビン酸オキシダーゼを用いると20分間で0.
01ppmの酸素濃度とすることができた。
例4.（使用例）牛乳の劣化防止 食品の他の例として、牛乳にアスコルビン酸0.1％を
添加溶解したものを、溶存酸素測定セルに注入し25℃の
恒温に保った。これに実施例２に従って調製し凍結乾燥
したアスコルビン酸オキシダーゼをpH6.0、0.1モルリン
酸緩衝液に溶解した酵素液（7.0units/ml）の50μｌを
注入して脱酸素を行った。その結果は下記のとおりであ
る。表中にはキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ23.0units/ml（pH6.0）の活性のものを50μｌ、前述
同様にセルに注入し、脱酸素を行なった結果も示す。
添加溶解したものを、溶存酸素測定セルに注入し25℃の
恒温に保った。これに実施例２に従って調製し凍結乾燥
したアスコルビン酸オキシダーゼをpH6.0、0.1モルリン
酸緩衝液に溶解した酵素液（7.0units/ml）の50μｌを
注入して脱酸素を行った。その結果は下記のとおりであ
る。表中にはキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ23.0units/ml（pH6.0）の活性のものを50μｌ、前述
同様にセルに注入し、脱酸素を行なった結果も示す。
牛乳（雪印製）はpHが6.74と高いため、キュウリ由来
のアスコルビン酸オキシダーゼでもアクレモニウム・エ
スピーHI-25由来のアスコルビン酸オキシダーゼに近い
溶存酸素の除去が行われた。
のアスコルビン酸オキシダーゼでもアクレモニウム・エ
スピーHI-25由来のアスコルビン酸オキシダーゼに近い
溶存酸素の除去が行われた。
例5.（使用例）pH4.5酢酸ナトリウム緩衝液でのアスコ
ルビン酸オキシダーゼによる溶存酸素の除去 実施例２に従って調製し凍結乾燥したアスコルビン酸
オキシダーゼをpH4.5、0.1モル酢酸ナトリウム緩衝液に
溶解した酵素液（7.0units/ml）10μｌを、0.1％アスコ
ルビン酸を含む0.1モル酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）
に添加し25℃における溶存酸素を測定した結果を下表に
示す。
ルビン酸オキシダーゼによる溶存酸素の除去 実施例２に従って調製し凍結乾燥したアスコルビン酸
オキシダーゼをpH4.5、0.1モル酢酸ナトリウム緩衝液に
溶解した酵素液（7.0units/ml）10μｌを、0.1％アスコ
ルビン酸を含む0.1モル酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）
に添加し25℃における溶存酸素を測定した結果を下表に
示す。
表中、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼに
よる溶存酸素の除去についても示した。キュウリ由来の
アスコルビン酸オキシダーゼは23units/ml・pH6.0の活
性のものを10μｌ前述同様に添加し測定した。
よる溶存酸素の除去についても示した。キュウリ由来の
アスコルビン酸オキシダーゼは23units/ml・pH6.0の活
性のものを10μｌ前述同様に添加し測定した。
pH4.5でのアスコルビン酸オキシダーゼによる溶存酸
素の除去は、25℃20分間の反応でアクレモニウム・エス
ピーHI-25由来のアスコルビン酸オキシダーゼによる場
合0.02ppmまで、酸素が除去されたが、キュウリ由来の
それは4.52ppm酸素濃度までにしか除去できなかった。
素の除去は、25℃20分間の反応でアクレモニウム・エス
ピーHI-25由来のアスコルビン酸オキシダーゼによる場
合0.02ppmまで、酸素が除去されたが、キュウリ由来の
それは4.52ppm酸素濃度までにしか除去できなかった。
例6.（使用例）pH6.0リン酸ナトリウム緩衝液でのアス
コルビン酸オキシダーゼによる溶存酸素の除去 実施例２に従って調製し凍結乾燥したアスコルビン酸
オキシダーゼをpH6.0、0.1モルリン酸緩衝液に溶解した
酵素液（7.0units/ml）10μｌを、0.1％アスコルビン酸
を含む0.1モルリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に添加
し、25℃に於ける溶存酸素を測定した結果、下表のごと
くとなった。
コルビン酸オキシダーゼによる溶存酸素の除去 実施例２に従って調製し凍結乾燥したアスコルビン酸
オキシダーゼをpH6.0、0.1モルリン酸緩衝液に溶解した
酵素液（7.0units/ml）10μｌを、0.1％アスコルビン酸
を含む0.1モルリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に添加
し、25℃に於ける溶存酸素を測定した結果、下表のごと
くとなった。
表中、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼに
よる溶存酸素の除去についても示した。キュウリ由来の
アスコルビン酸オキシダーゼは23units/ml、pH6.0の活
性のものを10μｌを前述と同様添加し、溶存酸素を測定
した。
よる溶存酸素の除去についても示した。キュウリ由来の
アスコルビン酸オキシダーゼは23units/ml、pH6.0の活
性のものを10μｌを前述と同様添加し、溶存酸素を測定
した。
pHが高くなると、キュウリ由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼでも、アクレモニウム・エスピーHI-25由来の
アスコルビン酸オキシダーゼと比較して大差ない溶存酸
素の除去が行なわれた。
シダーゼでも、アクレモニウム・エスピーHI-25由来の
アスコルビン酸オキシダーゼと比較して大差ない溶存酸
素の除去が行なわれた。
例7.（使用例）アスコルビン酸オキシダーゼによる容器
内酸素の除去 20ml容ガラス容器に、Beckman OXYGEN ANALYZERの395
50 OXYGEN ELECTRODEを差し込み、容器内にアスコルビ
ン酸133mgと実施例２で調製したアスコルビン酸オキシ
ダーゼ8.0unitsとを、pH6.0で0.1モルリン酸ナトリウム
緩衝液で溶かして5mlとしたものを加え、小撹拌子で常
時撹拌しながら、密閉されたガラス容器中の酸素量（O2
％）を測定した。なお、ガラス容器は25±0.1℃に制御
された恒温中に保持した。この結果を下表に示す。
内酸素の除去 20ml容ガラス容器に、Beckman OXYGEN ANALYZERの395
50 OXYGEN ELECTRODEを差し込み、容器内にアスコルビ
ン酸133mgと実施例２で調製したアスコルビン酸オキシ
ダーゼ8.0unitsとを、pH6.0で0.1モルリン酸ナトリウム
緩衝液で溶かして5mlとしたものを加え、小撹拌子で常
時撹拌しながら、密閉されたガラス容器中の酸素量（O2
％）を測定した。なお、ガラス容器は25±0.1℃に制御
された恒温中に保持した。この結果を下表に示す。
表中、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼに
よる容器内酸素の除去についても示した。キュウリ由来
のアスコルビン酸オキシダーゼの場合は4.7unitsを用い
た。これ以外の条件はアクレモニウム・エスピーHI-25
の場合に準じた。
よる容器内酸素の除去についても示した。キュウリ由来
のアスコルビン酸オキシダーゼの場合は4.7unitsを用い
た。これ以外の条件はアクレモニウム・エスピーHI-25
の場合に準じた。
pH6.0の緩衝液を用いた場合、容器内の酸素量はキュ
ウリ由来であろうがアクレモニウム由来であろうが、い
ずれとも脱酸素されていることが明らかである。
ウリ由来であろうがアクレモニウム由来であろうが、い
ずれとも脱酸素されていることが明らかである。
第１図はアクレモニウムsp.HI-25が生産するアスコルビ
ン酸オキシダーゼの至適作用pHを示すグラフである。 第２図は同酵素のpH安定性を示すグラフである。 第３図は同酵素の至適作用温度を示すグラフである。 第４図は同酵素の温度安定性を示すグラフである。
ン酸オキシダーゼの至適作用pHを示すグラフである。 第２図は同酵素のpH安定性を示すグラフである。 第３図は同酵素の至適作用温度を示すグラフである。 第４図は同酵素の温度安定性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福安 繁機 愛知県豊川市御油町五反34番地の３
Claims (2)
- 【請求項１】次の性質 （１）至適作用pHが3.5〜4.5である； （２）Fe++イオンにより活性化され、Cu++により阻害さ
れる； （３）分子量：ゲル濾過法により85,000±5,000の分子
量を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法において分子量23,000±2,000のサブユ
ニットを示す； （４）等電点：焦点電気泳動法により測定した場合pI4.
0を示す； （５）温度安定性:pH8.0、30分間の反応で60℃以下で安
定な活性を示す；並びに （６）pH安定性:4℃でpH4〜11の範囲で安定な活性を示
す； を有することを特徴とするアスコルビン酸オキシダー
ゼ。 - 【請求項２】アクレモニウム（Acremonium）に属し、ア
スコルビン酸オキシダーゼを生産することができる微生
物を培養し、培養物からアスコルビン酸オキシダーゼを
採取することを特徴とする、請求項１に記載のアスコル
ビン酸オキシダーゼの製造方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP2032175A JP2512578B2 (ja) | 1990-02-13 | 1990-02-13 | 新規アスコルビン酸オキシダ―ゼ及びその製造方法 |
| US07/653,709 US5180672A (en) | 1990-02-13 | 1991-02-06 | Ascorbate oxidase isolated from acremonium sp. hi-25 ferm bp-3124 |
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Related Child Applications (1)
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| JPH03236766A JPH03236766A (ja) | 1991-10-22 |
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Family
ID=12351602
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2032175A Expired - Lifetime JP2512578B2 (ja) | 1990-02-13 | 1990-02-13 | 新規アスコルビン酸オキシダ―ゼ及びその製造方法 |
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| EP (1) | EP0442781B1 (ja) |
| JP (1) | JP2512578B2 (ja) |
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| JPS5688793A (en) * | 1979-12-21 | 1981-07-18 | Toyo Jozo Co Ltd | Preparation of novel ascobate oxidase |
| JPH03108485A (ja) * | 1989-09-19 | 1991-05-08 | Toyobo Co Ltd | キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
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-
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- 1990-02-13 JP JP2032175A patent/JP2512578B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-06 US US07/653,709 patent/US5180672A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 DE DE69123162T patent/DE69123162T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 EP EP91400291A patent/EP0442781B1/en not_active Expired - Lifetime
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