JPS5824861A - 生物活性物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はバイオアッセイ又はイムノアッセイ、すなわ
ち試料中の生物活性物質を測定する方法に関する。これ
らのアッセイ法は、生物科学、医学、農業及びこれに類
する分野において有用である。

一般に、パイオアッーイ又はイムノアッセイは、生物活
性物質（一般に抗原ＡＧと称する）と、これと特異的に
結合して複合体を形成する成分（一般に抗体Ａｎと称す
る）との反応に基礎をおいておシ、この反応によシ複合
分子ＡｏＡｕ　が形成され、そして、ＡＧの量（又は逆
にＡｎＯ量）が種々の技法によシ測定される。これらの
技法は、広く二種類の方法群に分類することができ、一
つは、過剰量の試薬（Ａｎ）を使用し、反応完結後に前
記の過剰量を測定する方法であり、他方は、「限定試薬
法」又は［飽和アッセイ法」と称する（例えば、”Ｒａ
ｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅ
ｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ″Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ａ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
。

ベルリン１９７７、第１巻、２４７頁以下を参照のこと
）。簡単に要約すれば、飽和アッセイ法は、試験物質す
なわち分析対象（測定すべき抗原を含有する）を限定さ
れた量の特異試薬と反応せしめて、抗原−試薬複合体と
いくらかの残余の分析対象を与える方式を使用して成る
。さうに、反応に先立って、試験すべき試料に既知量の
標識抗原を加える。そして、非標識抗原（未知ｉ′）に
対する標識いて、反応出発時における比率と同じに保持
されるであろう。使用した既知量のＡｎは既知量のＡａ
　＋　Ａｃｉ混合物と結合するであろうから、残余のＡ
８を（その標識によって）測定することによシ、試料中
にもとから存在したＡＧの量を算出することができる。

例えば、試料が、酵素（Ａｃ）をＸ当量包含しておシ、
これを、ＡＧＡＢ複合体を（例えば１：１の分子比で）
形成する、ＡＢに対する特異的酵素抗体の既知量（２）
を使用して測定するものとしよう。そして、反応に先立
って、測定すべき酵素と同種類であって標識されている
もの（ＡＧ）を見当量試料に加えるとしよう。そうすれ
ば、抗原（Ａ、＋ＡＯ）のＬ当量部分が！当量の抗体に
よって消費される。そして、混合物から複合体を除去し
た後、残余の九を常法によシ測定する。もし、残余のＡ
Ｇについての測定値を差引くことによって実際に消費さ
れた量がｂ当量であることが分かれば、Ａ、とＭは化学
的に同じであって、同じ比率で消費されるから、消費さ
れたＡ、に対する消費されたＡ力の比率、すなわちｂ／
（ｖ−ｂ）は最初の比率いと同じはずであシ、これから
ｘ−（ａ／（ｙ−ｂ））にが簡単に算出できることが明
らかになる。言うまでも々く、抗体（ＡＢ　）と抗原（
ＡＯ）は、他の結合対、例えばアビジン−ビオチン又は
ビタミンＢ１２−固有因子等によって置き替えることが
でき、これらの結合対の構成員を、前記の方法と同様に
して、測定することができよう。（この発明に関連のあ
るバイオアッセイ法の一般的な特徴は、米国特許第４，
２５６，８３４号及び第４，２３８，５６５号に完全に
記載されている。） 前記の方法は非常に魅力的であるが、しかしながらいく
つかの欠点を有する。第一に、この方法においては、測
定すべき物質を純粋で標識された形で、例えば、放射性
物質として又は他の標識基（発色基、螢光基、特異的な
化学反応性を有する基又は光散乱粒子）を有する形で、
入手しなければならない。このような標識化合物は、化
学的に不安定であシ又は短命である（例えば、■１３１
　　標識化合物の半減期はわずか３ケ月である。）第二
に、この試験方法においては、複合体ＡＧＡ、を純粋な
形で分離しなければガらず（標識部分の活性を複合体自
体について測定する場合にも、残余の混合物について測
定する場合にも同様である）、しかも、このような分離
は、退屈でもあシ又費用もかかるであろう。第三に、標
識Ｍは、標識の形式によって（例えば追加の基によって
）非標識ＡＧとわずかに異った反応性（少なくとも、測
定すべき分析複合体の形成を含む反応に関して）を有限
このことが測定誤差の原因となるであろう。

したがって、理想的には、上記の目的を達成するため、
試験は、特異的であシ、鋭敏であシ、本質的に正確な結
果を与え、一定の条件下で行うことができ、しかも安定
な試薬を使用して行いうるものでなければならない。従
って、標識法は基本的に好ましい方法ではなく、標識化
合物を使用しない試験方法を得ることが望まれる。この
種の試験方法は、ＡＩ及びＡＧがそれぞれ１以上の活性
部位を有するある場合には、これらは凝集し、ついには
光分散効果又は吸光効果を発揮する傾向があるという実
験的事実に基いて、すでに存在している。このような効
果は常用の比濁法又は比色法によって測定しうるが、一
般Ｋ、この方法は感度に欠けている。この発明は、この
ような欠点を改良するものである。この発明は、測定す
べき試料を、表面がその表面に分布するＡＢ　（又はＡ
ａ　）の膜又はこれらを含有する膜によって、少なくと
も部分的に被覆されている基材と接触せしめ、Ａａ（又
はＡｏ）と試料のＡｃ　（又はＡｎ　）との反応の結果
生ずる光学的変化の速度を測定し、次に、こうして得た
速度曲ｍを、これと同じ測定法で得た標準速度曲線と相
関させることからなる。この測定すべき光学的変化は、
支持体と膜の界面で反射が起こる場合に生ずるものであ
ることが望ましい。

標準曲線と実験曲線を相関させることにより、常法に従
って、分析試料中のＡａ　（又はＡＢ）の量を簡単に測
定して望ましい結果を得ることができる。

例えば、曲線を視覚的に比較して、これによシ結果を推
定することもでき、又、標準データーを記憶させたコン
ピューターで算出することもできる。

そして、もし、速度曲線を自動測定装置と記録装置によ
シ記録すれば、この速度データーを、前記の装置と接続
したコンピューターに自動的に供給することができ、結
果を直接に標示装置（計量器、デジタル表示器又はチャ
ート記録器）に表示することができる。得られた速度デ
ーターを適切に解析することによシ、ＡＧとＡＢの間の
目的とする反応を、よシ高速で又はよ）低速で進行する
他の反応から識別することができ、そして、同じ反応を
平衡に達するまで続ける場合よ）も短時間で測定を行う
ことができる。言い替えれば、速度曲線は、同時に進行
する２種又はそれ以上の反応の結果であって、この全体
曲線を構成する種々の適箔な線分の勾配から、これら個
々の反応の速度を識別することができる。複合速度曲線
の一般的な取扱方法それ自体はすでに知られている（例
えば、ｃ、ｐ。

ＰＲＩＣＥ　ａｎｄ　Ｋ、５ＰＥＮＣＥＲ，Ｃ＠ｎｔｒ
ｉｆｕｇａｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒｓｌｎ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、Ｐｒａｓｇｅｒ　５ｅｉｅ
ｎｔｌｆｉｃ（１９８０）、１５９−１６９頁を参照の
こと）。

この発明においては、イムノアッセイ反応中に生ずる光
学的変化は、楕円偏光測定法によって検知するのが望ま
しい。他の検知方法を見ることもできようが（例えば米
国特許第４，０５０，８９５号を参照のこと）、楕円偏
光測定法は非常に鋭敏であ択そして、抗体を被覆した表
面と抗ｒＣを含有する試料との反応に基く光学的変化の
測定のための確実な手段であることが、早くから知られ
ている（例えば、フランス特許第２，３０１，８２４号
を参照されたい）。膜上でのＡＢとＡＧの複合体形成反
応の正確な性質は、この発明の方法が適用し得るすべて
の場合について特別に検討されてはいない（又、実際に
、有用な結果を得るのにそこまで必要ではない）が、膜
内での前記の変化は、厚さ及び／又は屈折率の変化に関
連していると考えられる。実際に、塗布されたＡＩと試
料のＡ、との反応によって、Ａｍ被膜のＡ、Ａ、複合体
被膜への変化が必然的に生ずることは確かのようである
。従って、この場合には、楕円偏光測定法が特に適当で
ある。

この発明を、実際にいかに実施するかの理解に供するた
め、次に、楕円偏光測定法の若干の基礎原理を、添附図
面によ）簡単に説明する。

楕円偏光測定法の原理は、簡単に次の様に要約すること
ができる。平面偏光、すなわち２方向に対して横断的、
且つ伝播面Ｐ内で振動している光（第１図を参照のこと
）のビームの振幅ベクトルＡは、実際に、前記の伝播方
向２に直交する２つの直角ベクトルのベクトル和と等価
であると考えることができる。第１図はこのことを示し
てお択ここで、Ａは、偏光の振幅ベクトルであシ、そし
て、Ｘ及びＹは、直交座標系における、Ａの直角成分で
ある。選ばれた方向角１、すなわちＡとＸのなす角は、
方位角と呼ばれ、Ｖの正確な値を選択する基準は次のよ
うに与えられる。面Ｉはビームの入射面と定義し、そし
て、Ｙはその平行（Ｐ）成分（入射面内における）であ
シＸはその垂直（パーペンディクラ−又はＳ）成分であ
る。今、２面のビームが板（又はスラブ）Ｓの表面に当
たる場合（Ｗを適ｆｉＫ選んで）２と入射点においてＳ
と直交する直線Ｎとで構成される面と一致する面Ｉを有
するよう常に幾何学的配置する。このような条件下で、
このシステムを特定するこのほかの因子は、２とＮ間で
構成される入射角Φｉである。もし、Ｓが屈折率ｎ２を
有する透明な誘電層（第２図を参照のこと）であシ、そ
れぞれｎ２よシ小さい屈折率ｎＩ及びｎ３を有する透明
な媒質で囲まれておシ（Ｓが空気中に存在するガラス板
である場合ｎ１とｎ３は実質上同じであろう）、そして
、Φｌが００からψの間で変化する場合、それぞれＲｅ
ｘ及びＲｌｎで示される外反対ビーム及び内反対ビーム
には、理論上、次の現象が生ずる（フレネルの法則）。

Φｉが小さい場合には、ＸｉとＹｌの両者は、一定の範
囲で、反射及び屈折を行う（第２図においては、面Ｉは
紙面と一致するため、Ｘ成分は点で示しである）。反射
光線Ｒ０において、ＸＲｅｘは、Ｘｌに対してπだけ位
相変化するが、ＹＲｅＸは位相変化しない。Φｌが、Ｒ
ｅＸと屈折ビームの々す角が９０°となる角であるΦの
値（Φはブリュースター角である）まで増加した場合；
　ｙＲ，Ｘ成分（平行成分）は消失する。Φｌがブリュ
ースター角を越えた場合、両性反射成分ｘＲ，工及びＹ
ＲｅＸが再び存在するが、こんどは両者とも入射成分に
対してπだけ位相変化する。

第２図は、プリー−スター角近傍における状態を、ｘＲ
，Ｘを大きな点として、ＹＲｅＸを非常に短い矢印とし
て示している。ストークスの法則から、内反射光につい
ては、角ΦＣ（ブリュースター角よシ大きい）まで、正
確に逆の現象が生じ、この角を過ぎると全反射が起こる
であろう。全反射ビームＲ１ｎについて生ずる現象につ
いては後で説明しよう。具体的には、後で詳細に記載す
るごとく、この発明は、外反対、内反対又はこの組合わ
せと関連している。

第３図は、Ｓの表面が、光学的に粗である誘電体と光学
的に密である誘電体の界面である場合（第２図に示すよ
うに）には、外反対成分ＸＲｅｘ及びＹＲｏｘが理論に
従って位相変化することを示している。第３図において
は、さらに、平行成分Ｙｎ、工と垂直成分ｘＲ，：ｘと
の位相変化の差（ΔＰ−Δ８）を点線で示しである。以
下に見るごとく、この差が楕円偏光測定法における必須
因子である。

今、もし反射表面が異種物質の膜で被覆されている場合
もしくは表面が金属表面である場合又はこの両方である
場合には、位相変化の差がＯ又はπのいずれかの場合、
すガわち反射光が平面偏光となる場合、についての上記
の考察は維持できない。このような場合には、第４図に
示すごとく、ΔＰ−ΔＳ曲線は丸味を帯びる。もつとも
、これはある特定の実際の場合を引用しているのではな
く単に例として示したに過ぎない。従って、上記のよう
な場合には、反射したＸベクトル及びＹベクトルは、０
からπの間で変化するある値で位相変化し、そして、そ
のベクトル和は楕円になるであろう。むろん楕円に々る
のはいまでであシ、この角度においてはなお９０°傾斜
した直線となるであろう（これは、観察しようとする波
と同一周波数であっである角度だけ位相が異なるサイン
ベースラインのオシロスコープ上で正弦波信号を観察す
る場合と同じである）〜。このような理論は１８９０年
ごろドルード（ＤＲＵＤＥ）により展開された（例えば
、Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｅａｓ
ｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆＳｕｒｆａｅｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈ
１ｎ　Ｆｉｌｍｓ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ。

いては、反射面上での膜（又はコロジオンのごとき他の
表面改質材）の存在によシ生ずる楕円率の変化を正確に
測定できる。膜厚のわずかな変化（数＾）は楕円偏光の
楕円パラメーターに非常に重大な変化をもたらすので、
楕円偏光測定法は非常に鋭敏であり、そして、これらは
角度（位相角の変化及び方位角）として測定することが
できる。

通常、測定は、偏光ビームβ、ある既知の方位角（ト）
で、試料に当てることにより開始する。試料からの反射
楕円（一般に）偏光を、１４位相遅延素子（例えば、複
屈折物質の板）を適当に回転（楕円率角）させて補正す
ることによシ調和して再び平面偏光ビームを復元し、そ
して、復元した面偏光ビームの方位角を、検光子（例え
ばニコルプリズム）を、最大吸光角まで交叉させること
によシ測定する。

この発明は、同一の原理で機能するが、非常に興味深く
かつ予想外の利点を有するように変更を加えである。こ
の発明においては、金属性又は誘電性の通常平滑面を有
する支持基材を抗体の層で被覆する（ここで、抗体なる
語は非常に一般的な意味に使用しておシ、測定しようと
する生物活性分子、例えば酵素、ホルモン、ビールス、
一般的な生物活性ペプチド、ワクチン等と結合するよう
なある物を意味する）。一般に、ガラスのごとき誘電体
表面又はセロハンのごときある種の合成樹脂を使用する
のが望ましい。これらは生物活性物質に対して、良好な
固有の親和性を有しているからである（もちろん、基材
が親和性を有しない場合には、この分野において知られ
ている特別の処理、例えば結合部位を設ける方法、中間
活性層を適用する方法等によって表面に親和性を付与す
ることができる）。塗布は通常の方法、例えば、基材を
ＡＢの溶液中に浸漬し、そして、この基材を、Ａｎが均
一層になって板に付着するまで浸漬しておき、次に、液
切シし、純水で洗浄し、そして、貯蔵条件（乾燥条件又
は抗体の性質によっては湿潤条件）におく。そして、表
面を適当な反応媒体（例えば水性緩衝液）に浸だし、そ
して偏光の入射ビームの光路に正しい角度で定置し、被
検試料を媒体に加え、これによシ分析対象と被膜表面と
の間で目的とする反応起こさせ、そして、表面から反射
する光の楕円・（ラメ−ターを測定し、これによシ目的
とする速度曲線を得る。

この発明における利点は、外反射光から（金属表面を使
用する場合又は−面だけを被覆した誘電板を使用する場
合）、もしくは、外反射光と内反射光の組合わせから（
薄いガラス板又は他の透明体の両面を被覆し、且つ、入
射角Φｌが全白反射がとく、多段内部反射から得られる
。発明者等が知得した先行技術中には、表面で起こるＡ
Ｇ　／　Ａｎ型反応を取扱った少数の文献が存在する。

これらの文献とは、Ａ、ＲＯＴ！ＨＥＮ、　Ｅ　ｌ　ｌ
　ｉ　ｐ　ｔｓ　ｏｍｅ　ｔｒｉｃ　５ｔｕｄｉｅｓｏ
ｆ　Ｔｈ１ｎ　Ｆｉｌｍｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　
５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｄＭｅｍｂｒａｎｅ　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　８　（１９７４）、５ｉ−ｉｉｓ”、”Ｒ，Ｂ、
ＤＡＶＩＳ等、ＥＩＨｐｓｏｍｅｔｒｉｃ　０ｂｓｅｒ
ｖａｔｉｏｎｓｏｆ　　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｄｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＩｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎ’ｓ　　ｏｆ　　Ｎａｔｉｖｅ　　ａｎｄ　　
ＭｏｄｉｆｉｅｄＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　　ａｎｄ　　
Ｆａｃｔｏｒ　　　■　：５ｕｒｆａｅｅＳｃｉｅｎｃ
ｅ　９６（１９８０）、５３９−５５４”、”Ｒ，Ｍ、
Ａ。

ＡＺＺＡＭ等、Ｋｌｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ａｄａｏｒｐｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ａｔ　ａ　Ｌｉｑｕｉ
ｄ／５ｏｌｉｄ　　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　　ｂｙ　Ｅｌ
ｌｉｐｇｏｍｓｔｒｙ：Ｐｈｙ、Ｍｅｄ。

Ｂｉｏｌ、２２（１９７７）４２２−４３０”、Ａ、Ｒ
ＯＴＨｇＮ等、Ｓｅｒｏｌｏｇｊｅａｌ　Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ＋ｓ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＦｉｌｒｎｓ　　ａｎ
ｄ　　Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｊ、
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　７６（
１９４２）、４３７−４５０″、Ｐ、Ａ、ＣＵＹＰＥＲ
８等、Ｅｌｌｉｐａｏｍａｔｒｙａｓ　　ａ　　Ｔｏｏ
ｌ　　　ｔｏ　　５ｔｕｄｙ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｆ
ｌａｍｅ　　ａｔらの文献の幾つかには、特定の複雑な
複合体で被覆された表面上での生物活性物質の反応が記
載され、この反応は楕円偏光測定法で研究されている。

しかしながら、この発明の場合のように、標準速度曲線
と比較することによってイムノアッセイに適用し得る方
法を示唆した文献は存在し々い。

又、今まで知られた文献の中には、誘電体表面の両側に
生じた表面変化を同時にしらべることを報告したものは
存在しない。そして、この点が、この発明における最大
の利点の１つである。この点をよく理解するために、内
反射ビームＲｉｎ　（第２図を参照のこと）の考察にも
ど゛って、Ｐ”（ＹＲｉｎ）成分と′８″（Ｘａｓｎ）
成分が、それぞれどのように変化するかを見よう。この
変化は、典型的には光学的に密な媒質から光学的に粗の
媒質への界面における反射を例として挙げることができ
、これも又フレネルの式によシ記述され（例えば、Ｍ、
　ＢＯＲＮ。

０ｐｔｉｋ、Ｊ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ベルリン、１９３
３．を参照されたい）、そして、第５図における略図に
よって説明できる。第５図Ａには、平行成分及び垂直成
分の両者が、入射角の関数として、グラフで示しである
。臨界角Φｅ（すなわち、この角を過ぎると膜中で全反
射が起こる角）までは、位相変化はπ又は０であシ、従
ってその差（第５図Ｂを参照のこと）も又π又はＯであ
り、このことは、平面偏光のＰ”成分とＳ”成分は同調
しておシ、そして和ベクトルも又直線であることを意味
する。ΦＣを過ぎて視射角（Φ−＝９０’）までは、Δ
Ｐ−ΔＳはふくらんだ曲線で示され、従って、Ｐ”成分
とＳ”成分は相互にある角度をもって位相変化し、その
結果、楕円偏光が生ずるであろう。

従って、この発明の具体例の１つは、確かに、全反射の
場合、さらに詳しくは板肉での多段反射に基礎を置いて
おシ、楕円偏光発生パラメーターは誘電体板の外部で起
こる変化、すなわち前記の板の両側でのＡＢＡ、膜の成
長と関連する変化に支配される。この発明において、上
記のよう表条件をいかにして実現するかは後はど示すが
、ここで、入射角がΦ。よシ小さい状態においてもこの
発明を実施することができることを本発明者等が発見し
たことを強調しておかなければなら々い。言いかえれば
、板の背面が膜被覆さ□れそいる場合には、二次外反射
ビーム（第２図を参照のこと）も又楕円偏光されること
が示されておシ、これにより、試料によシ反射された信
号出力は、破壊的な干渉を受けることなく増幅される（
予想通シである）。

この発明の独創性には、さらに、このような驚くべき要
素が加えられる。この発明のこの観点を具体化するため
の装置は後で説明する。

この発明のバイオアッセイ法を実施するための装置は、
反応媒体を保持し、反応、すなわち分析すべき試料と生
物活性膜で被覆した基材との反応、を行わせるためのセ
ル二偏光光源；あらかじめ定めた方位角と入射角をもっ
て、前記の偏光を、前記の基材に向けるための手段；及
び、基材の背面により、もしくは基材の背面と前面の両
面によシ、又は基材中での多反射の技に、基材から反射
される光の偏光パラメーターを測定する手段；からなる
。

ここで、この装置及びこれにいくらかの変更を加えた装
置について、添附図面と関連させて記載しよう。

第６図に示す楕円偏光測定装置は、まず、光源１を有し
ておシ、この光源は、この具体例においてはＨｅ　−Ｎ
ｅレーザー（５ｍＷ、λ二６３２．８ｎｍ）であるが、
楕円偏光測定における使用に適するものであれば任意の
光源が使用できる。この具体例において使用している光
源は可視光線を発するが、むろん、可視光線以外（すな
わち紫外線又は赤外線）のエネルギーを発生するもので
も使用し得る。

一般に約２×１０２ないし２Ｘ１０’ｎｍ　の光線が使
用できる。この範囲の光源の例としては、Ｈｅ　−Ｎ。

（λ＝６３２．８ｎｍ）、Ａｒ（λ＝４８８　ｎｍ、５
１４．５　ｎｍ及びこれ以外の波長）、Ｋｒ（λニ６４
７．１ｎｍ　及びこれ以外の波長）のごときレーザー光
線が挙げられる。他の光源、例えば、単波長の白熱電球
及び放電スＲクトル中の幾つかの輝線に中心をおくスイ
クトル幅の狭いフィルターを伴う水銀アークも使用し得
る。さらに、この装ＭＶｉ、、光源１からの光路に、定
期的遮断信号を与えるチｇ　ｙ　ノ４−２（チョッパー
は又一定周期の基準信号を与えるっこの信号め用途は後
述す−る）、調整可能な方位角Ｆを有する平面偏光ビー
ムを得るだめの偏光子３を有する。通常、偏光子３はニ
コルグリズムであり（但し、このような場合に一般に通
常使用される他の任意の手段、例えばグランートングソ
ンプリズムをも使用し得る）、Ｖ角は通常４５°に設定
する（但し、これはまったく任意であシ、もし好都合で
あれば他のＦ値を選択することもできる）。

こうして、平面偏光ビームは、試料保持空間５に置かれ
た試料反射要素すなわち基材４に達する（これの最も簡
単な具体例の１つが第７図に示しである）。こんどは、
試料から反射された光は楕円偏光されておシ、この偏光
を再び平面偏光ビームにするための補償板６を通過する
。補償板としては、通常ψ波長板、すなわち複屈折物質
を光学軸に平行に切断した板を使用する。この場合に、
もし、楕円偏光♂−ムが正常に板を通過する場合には、
常光線及び異常光線の側屈折は起こらないが、もし板を
、その光学軸と楕円軸が平行になるように回転すれば、
垂直ＸＲ０エベクトル及び平行Ｙｈ！ベクトルは同調し
、楕円偏光は基準線に対しである角度（反射光の方位角
）を有する平面偏光になる。さらに、この装置は他の偏
光手段、検光子７を有し、この検光子は、適当に回転す
ることによシ（そして、反射光線のＷの値を与えること
により）信号を最少にする。ついでに言えば、補償板を
回転した角が楕円偏光の楕円率（従って位相遅れΔ）で
ある。この装置は、さらに、光信号を電気信号に変換す
る光感知器８を有しておシ、ここで交換された電気信号
はロックイン増幅器（ｔｏｃｋ　−ｉｎ　ａｍｐｌｉｆ
ｉｅｒ）　９に供給される。この増幅器は、チョッパー
２からの参照信号を受けて位相を鋭敏に検知するように
作動し、バックグラウンドノイズの大幅な減少を可能に
する。もちろん必要なら、チョッ・や−にかけた光信号
を発光ダイオードから発生するパルス信号又はダイオー
ドレーザ−で置き換えることもできる。次に、増幅器９
からの信号は、信号処理装置１１　に送られる。この装
置はマイクロゾロセッサーを有しておシ、速度データを
記録し、そして標準データと試験データとの関係をコン
ピューター処理する。測定値についてさらに定量的な判
断を行うために、増幅器９に連結したチャート記録計１
０を使用す簡単に要約すれば、この発明に係る楕円偏光
測定装陥は次のように作動させる。一度、種々の光学要
素を適切に調整して光強度と焦点を合わせ、Ａ、又はＡ
Ｂを含有する膜で被覆した基材を伴う試料ホルダーセル
（後で記載する）に、反応を行わせるための媒体（例え
ば緩衝液）を満たす。補償板６及び検光子７を、検知器
から得られる信号が最少になる寸で交互に調整する。そ
して、ドリフトが消失した後、被検試料を刃口え、すげ
やく反応媒体と混合する。これによシ、反応が始まシ、
この装置の楕円偏光′パラメーターに連続的に進行する
変化が生じる。これらの変化、すなわち検知器からの信
号を、任意の時間検知し、そして、応答曲線を表示装置
１０に記録し、そしてコンピューターユニ、ト１１で処
理する。

試料分析要素の具体例の一つを第７図に示す。これは、
反応媒体、及び抗体を含む膜１４で両面を被覆した誘電
体板１３（ガラスもしくはその他の透明体、例えば、ル
ーサイト（Ｌｕｃｌｔｅ）、プレキシグラス（ｐｌｅｘ
ｌｇｌａｓｓ）アクリル樹脂、ポリスルホン、ポリカー
？ネート。

ポリスチレン、月？り塩化ビニル及びこれらに類する物
、又は、方解石、ゲルマニウム、珪素、はたる石、カー
ナライト、塩化ナトリウム、ヒ酸ガリウムもしくは水晶
の結晶のごとき鉱物、全使用して作られる）を収容する
キュベツト１２（通常、複屈折を無視することができる
光学ガラスで作られる）からなる。ブリュースター角の
近傍（すなわち４０〜５５°）の入射角で、偏光を板１
３に当て、そして、反射した楕円偏光は外反射光ビーム
１５と内反射光ビーム１６の２種類として出現する。プ
レート１３が十分薄い場合、すなわち、数百ミクロンの
オーダー（例えば１００〜５００μ）である場合、ビー
ム１５及び１６は相互に非常に近く、従って、特に焦点
調整を問題にすることなく、−緒に処理することができ
る。２つのビームの出力は、相互に相殺されることなく
、ある程度加算される。これは、予想外のことである。

この具体例の利点は、いうまでもなく、高い信号レベル
が得られ、測定の感度が増すことであるが、しかし、１
つの欠点は、光が流動性反応媒体を通過する際の乱れに
より光信号が変化することである。

第８図に示した第２の具体例において、試料分析装置は
キュベツト１７であシ、そして、　Ａｎ　　の膜又はＡ
Ｍを含有する膜を保持した基材がキュペ。

ト自体の内壁の１つを構成している。ここでも、反射光
は、ビーム１９及びビーム２０の２種類として出現する
が、膜１８の存在によシ内反射ビーム２０のみが楕円偏
光となシ、そして、これによシ、全反射を起こす臨界角
よシ小さい入射角（背面における）を使用することが可
能になル、この点も、この発明の駕〈べき特徴の一つで
ある。この具体例においては、前記の具体例の場合に生
じた時間的損失を最少限にすることができるが、しかし
、ビーム１９０発生に基くエネルギーの損失によシ感度
は低下する。

このような欠点を、第９図に示す変更により除去するこ
とができる。第９図の装置も又キーペット２１を有する
が、このキュベツトの１つの壁自体の外側がプリズム２
２形に切断しである。プリズムの角は、入射光及び反射
光が、プリズムの側面と直角に交叉するようにしである
。従って、プリズムの前方角２３は２Φｉに等１〜く々
ろう。この装置により、前反射ビームの妨害による損失
を最小にすることができよう。

第９図の具体例の１つの変形として、別に作ったプリズ
ム’ｃ　Ａａ被被膜有するセル壁の外側に接着剤によシ
接着して使用することができ、この接着剤の屈折率はで
きるだけプリズム及びセル壁の屈折率と一致させる１、
こうすることによシ、プリズム／セル界面における反射
損失を最小にすることができる。

第１０図に概略を示した。上記以外の具体例（他の図と
同様上から見たもの）において、セル２４は、セルの底
面にまで達しない内部板２５を有する形をしている。セ
ルの角度は、光が矢印２７で示したように反射する前に
入射光ビーム２６が板２５の内部で多段反射するような
入射角となるように調整する。板２５の側壁には、（通
常の通シ）反応に先立って抗体を被覆し、そして、被検
溶液をセルに入れる。これによシ、板２５の両側で膜２
８の変化が生じ、板２５／膜／試料溶液の界面における
多段反射によシ、連続する反射部位のそれぞれにおいて
楕円偏光発生効果が増幅されよう。板２５を十分に長く
し、そして、十分に薄くした（例えば、長さ３０〜４０
　ｍｍ　、厚さ１０〜１００μ）板２５を使用すれば、
連続する反射回数が１０又はさらに大きなオーダーにな
るから、この具体例によシ、この発明の方法における最
大の感度を得ることができる。このような装置によシ、
数μａｌｔの範囲の濃度を有する抗原溶液を測定するこ
とができるっ この発明の実施に当たっては、単に速度データー（比較
測定）だけが必要であるから、ドルードの弐によるＶ及
びΔの値を特に計算する必要がないことは注目に値する
。もちろん、複雑な変化を伴う反応の前後における被膜
の正確な性質、厚さ及び屈折率を、古典的な楕円偏光の
等式を使用して、よシ深く洞察するためにも、この発明
の方法は非常に有用である。説明のために前記した楕円
偏光測定装置は、この発明の実施するだめの、適切な光
学要素の唯一の配列はないことを銘記すべきである。例
えば、少し変更を加えて、補償板６は、試料の後におく
のでは々く前に取シ付けて楕円変更ビームを生じさせ、
これを試料で反射することによって同調することもでき
る。

前記の楕円偏光測定機を改良して５分析試料中に存在す
る２種又はこれよシ多くの反応種が、明確に異なった速
度で、同時的に基材被膜と反応する場合に現われる複雑
な速度データーを解析するための、適切に設計されたサ
ーキットを、信号処理装置に含めることができる。この
ような状態を反映した速度曲線は、通常、減少勾配の、
連続する直線近似部分から成っておシ、曲線部分に分け
ることができる。前記の部分のそれぞれの展開、位置及
び勾配を信号処理装置に記録し、試料中の前記の反応種
の相対濃度として結果を得るようにコンピューター処理
する。

次に実施例により、この発明を説明する。

実施例１ ヒ）　Ｉ、Ｇ、に対する家兎抗体の濃度の測定以下の実
施例において、次の点を了解されたい。

この明細書の最初において、複合体（この形成がこの発
明に係る方法の基礎をなしている）の既知部分を抗体と
し、前記の複合体の結合部分を抗原と任意に規定した。

この定義が、この発明に関する単なる習慣であることは
自明でちる。実際に、この実施例においては、形成すべ
き複合体の既知部分は抗原であシ、そして、測定すべき
部分は抗体である。

この実施例のために、第６図に示したものと同様の装置
を、第７図との関連で具体的に説明したセル、すなわち
、正方形の面を有するガラスセル（壁の広さ約１５ｍｍ
、厚さ１５０μ、容量３ｍｔ）及びセルのおよそ対角線
上におかれた１０ｍｍの正方形のガラス板（厚さ１５０
μ）と共に使用した。

まず、セル及び板を２％洗剤水溶液（ＲＢＳ　）中で洗
浄し、次に、流水で洗浄し、この後、これらを濃硫酸中
に一装置き、そして、蒸溜水ですすぎ、乾燥した。この
後では、反射試験に使用する面を指で触れないようにし
た。

そして、この板を、０．１　ｍｏｌ／Ｊ　！Ｊン酸緩衝
液中に溶解したヒ）　Ｉ、Ｇ　２Ｑ／ｌ溶液中に、２時
間以上浸漬した。この板を蒸溜水ですすいだが、使用前
に直接乾燥しなかった。そして、この板′ｆｆ：１　ｍ
ｌの０．１　ｍｏｔ／ｅ　’Ｊン酸緩衝液を含むキーベ
ットに浸し、上記のように配置した。

光学要素は次のように調整した。まず、偏光子３を入射
面に対して４５＠になるように調整した。

次に、光源１、試料４及び検知器８を、出力が最大にな
るように配置した。検光子７及び補償板６を、出力が最
小になるように回転した。ロックイン増幅機９を最小感
度に設定した場合に出力が最小になるまで補償板６と検
光子７の調整を交互に繰シ返した。記録計１０のスイッ
チを入れ、安定性を点検するため、約５分間、ブランク
曲線を描かせた。　　　　　　　　　　、（１ そして、１００μ）の被検溶液（家兎の抗ヒトＩｇＧを
希釈したもの）をキュベツトに加え、そして、重要な光
学要素を乱さないように注意しながら、注射器から空気
泡を素早く吹き込んで溶液を混合した。前もって調整し
た設定に触れないで、ロックイン増幅器の出力を、約１
０分間、チャート表示器１０に記録した。最初の１分間
、反応溶液中の気泡によシ線が不規則になるので、最初
の１分間経過後から６分間経過後までの曲線部分を、抗
体と板に被覆した抗原との反応を示すものとして採用し
た。

これと同様の一連の測定を、種々の濃度の抗体被検溶液
について行った。ここで使用した濃度を、得られた速度
データーと共に次の表に示した。この速度データーは標
準速度データーを構成するものであシ、自動的に平均さ
れ、コンピー−ター１１の記憶装置に記録された。

以下余白 １　ａ　　　　　　　　Ｏ，８２７２，３８１ｂ　　　
　　　　　Ｏ，８２７２，３４２ａ　　　　　　　　Ｏ
，５６８１，４０２ｂ　　　　　　　　Ｏ，５６８１，
４７３ｍ　　　　　　　　Ｏ，３５００，９１３ｂ　　
　　　　　　Ｏ，３５００，７８４４ａ　　　　　　　
　Ｏ，１７８０，２４４ｂ　　　　　　　　Ｏ，１７８
０，２６８５ａ　　　　　　　　Ｏ，０９０，０８４５
ｃ　　　　　　　　Ｏ，０９０，０７４上記のデータを
比較データとして使用し、未知濃度の抗Ｉ、Ｇについて
同様の実験を行い、この速度データーから、前記の比較
データとの比較によシ、濃度を決定した。

実施例２ 実施例１に記載した方法を繰返した。但し、第７図にお
ける板１３のかわシに、同じ正方形の壁を有するセルと
前方角９０°のガラスジリズムを使用し、これを顕微鏡
技術において使用される種類の適旨な屈折率の一致した
液を使用してセルの外壁に着けて第９図に示すような配
置にして行った。

キーぺ、トの内壁を、実施例１の板について記載したの
と同様の方法で、抗原によシ活性化し、この後、キーベ
ットを光学効果が得られるような追出な位置にセットし
、光学要素を実施例１と同様に調整し、キュベツトに１
ｍｌの緩衝液を入れそして攪拌しながら被検液を加える
ことによ勺実験を行った。実験のこれ以外の点は実施例
１に記載した過多に行い、数種類の濃度の抗原について
試みた。このような配置においては実施例１で使用した
配置に比べて感度が劣ることを見出した。例えば抗体濃
度が９．９μＶ−の場合速度データは０．９第１図は、
入射角Φｌをもって反射面Ｓに当たる偏光ビームに対し
て角度Ｖを有する直角座標系において、前記の偏光ビー
ムがいかに直交する２つのベクトルに分解されるかを示
す概略図である。

第２図は、誘電反射板の場合に、ゾリー−スタ−（Ｂｒ
ｅｗｓｔｅｒ　）角Φ近傍の入射角において反射光成分
に生ずる変化を概略的に示したものであり、第１図の■
−■線での側断面を約９０″右に傾けて図示したもので
ある。

第３図は、反射における平行（ｐ）Ｙｉｅｘベクトルと
垂直（ｓ）ｘＲ，！ベクトルについて生ずる位相変化と
これらの位相変化の差とを、Φｉの関数として示したグ
ラフである。

第４図は、第３図と同様のグラフである。但し、反射表
面が膜被覆表面の場合又は金属表面の場合変化を示すグ
ラフである。

第６図は、抗原を含有する被検試料との接触によって抗
体を被覆した基材の表面で生ずる変化の測定に適用する
自動記録楕円偏光測定機の一般的な概略図であり、 第７図は、第６図の装置の細部、すなわち、検知すべき
バイオアッセイを行うキーベットの拡大概略図であシ、 第８図は、第７図のキュベツトの変形であシ、第９図は
、生物活性膜で被びした基材のその他の具体例を伴なう
キーベットであシ、そして、第１０図は、第９図と同様
であるが、基材の切断方法が異なシ、又、基材内で全反
射が可能な様に、異ガった入射角で操作するようにした
ものである。

図において、１は光源、３は偏光子、４及び１３は基材
、５，１２，１７，２１及び２４はキュベツト（セル）
、６は補償板、７は検光子、８は光感知器、９は増幅器
、１０は記録計、１１は処理装置、１４．１８及び２８
は膜を示す。

パ１（弘・ ず 容− ゛〇−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、測定すべき試料を、表面 がその表面に分布している抗体ＡＢもしくは抗原Ａ（１
   の膜又は抗体Ａｓもしくは抗原Ａｄを含有する膜によシ
   少なくとも部分的に被覆されている基材と接触せしめ、
   前記の膜中の抗体Ａｍ又は抗原ＡＧと試料中の抗原ＡＧ
   又は抗体ＡＢとの反応によって生ずる光学的変化の速度
   を測定し、そして、こうして得た速度データを、抗原Ａ
   Ｇ又は抗体ＡＢの既知標準試料について同じ速度測定法
   で得た標準速度データと相関させることから成る、生物
   活性物質（抗原Ａ、又は抗体Ａｓ　）とこれらと特異的
   に結合して複合体を形成する成分（抗体Ａｎ又は抗原Ａ
   ｏ）との反応によ多試料中の生物活性物質を測定するバ
   イオアッセイ法。 ２、基材と膜との界面における反射の際に生ずる光学的
   変化を測定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記の光学的変化を楕円偏光測定法によシ測定する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、基材が薄い誘電体板であシ、楕円偏光測定法で測定
   する変化が、腰板の前側及び／又は後側から反射された
   楕円偏光と連累する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、基材が薄い誘電体板であシ、測定する変化が、該膜
   中での多段反射の後板から出現する楕円偏光と連累する
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、光学的変化が膜の厚さの変化及び／又は屈折率の変
   化と関連する特許請求の範囲第４項又は第５項記載の方
   法。 ７、次の段階、すなわち、 （、）　　平らな誘電体基材の表面の少なくとも１部を
   、測定すべき物質と結合して複合体を形成する成分の膜
   又は該成分を含有する膜にょ膜被覆し、 （ｂ）　　光と膜被覆基材との相互作用にょシ楕円偏光
   が出現するような方向と角度で、平面偏元ビームを前記
   の膜被覆基材に向け、 （ｃ）　　出現したビームの光路に適当な光学手段を配
   列し、調整して、楕円偏光の直交する光ベクトル成分の
   位相を再び同調し、信号値が最小になるようにそのベク
   トル和を消滅せしめ、 （ｄ）　　前記の膜被覆基材と測定すべき物質の溶液と
   を接触せしめ、 （、）　　前記の信号の変化を経時的に測定及び記録し
   、そして、 （ｆ）　　上記のようにして得た速度データを、既知濃
   度の標準試料について同じ反応を行って得た速度データ
   と関連すけ、そして、この比較によって必要とする測定
   を行うこと、からなる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ８、基材によシ外反射及び内反対された楕円偏光ビーム
   を同時に収集できるように、入射ビームに対して基材を
   方向ずける特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記の基材から光が出現する前に、基材中で前記の
   ビームが多段反射するように、入射ビームに対して前記
   の基材を方向ずける特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、　　次の要素、すなわち、 （、）　　平面偏光光源、及びその光ビームと被覆基材
   との相互作用を生じさせ、かつ、楕円偏光を出現させる
   ために、被覆誘電体基材に向けて、あらかじめ定めた方
   位角と入射角で前記の光ビームを方向ずける手段、 （ｂ）　　前記の偏光ビームに対して前記のあらかじめ
   定めた方向に前記の誘電体基材を保持し、そしてこれと
   同時に、一定時間前記の被覆基材上で表面反応を生じさ
   せるために、反応媒体液を被覆基材と接触させるだめの
   手段、（Ｃ）前記の被覆基材から出現した楕円偏光を集
   め、そして、楕円偏光パラメータを確認するだめの手段
   、 （ｄ）　　前記の反応の過程で生ずる楕円偏光パラメー
   タの変化を検知し、これを電気的に処理し得る信号に変
   換し、そして、この信号を時間の関数、すなわち速度デ
   ータとして記録する手段、及び （、）　　前記の速度データを対応する標準データと比
   較する手段、 からなる試料中の生物活性物質を測定する装置。 １１、ヘリウム−ネオンレーデ−のごとき単色光源；平
   面偏光ビームを、約４５″の方位角と入射角で、膜の物
   質のための液体試薬を加えることができる透明なキーベ
   ット中に保持した、活性物質の膜で被覆したガラス又は
   透明な樹脂の試験板に向け、これによって、前記板から
   楕円偏光を出現させるための方向調節可能な偏光子；前
   記の反射偏光の楕円偏光性を除去するだめの１７４波板
   ；１／４波板からの平面偏光と交叉させることによシ光
   信号を最小値にするための検光プリズム：前記の光信号
   を電気的に処理できる信号に交換する光検知器；表示器
   、増幅器、記憶装置、及び、前記の信号を表示し、それ
   を記録し、それを記憶し、そして、それを、前記の記憶
   装置に記憶させである他の信号と比較するためのコンピ
   ューターを含む電気的処理ユニット；からなる特許請求
   の範囲第１０項記載の装置。 １２、未変調の光ビームを回転チョッパーで処理し、又
   は、発光ダイオードもしくはダイオードレーザ−のごと
   きノぐルス光源を使用し、パックグラウンドノイズを減
   少させるために、電気的処理ユニットにおいて、この点
   滅周波数を基準として使用する特許請求の範囲第１１項
   記載の装置。 １３、電気的処理ユニットが、分析すべき試料が被覆基
   材と反応しうる１種よシ多くの成分を含んでいる場合に
   得られたデータを解析するためのサーキットを含み、前
   記の試料中の反応種の相対濃度として結果を得るように
   前記のデータを処理する特許請求の範囲第１１項記載の
   装置。