JPH1151895A

JPH1151895A - バイオセンサ

Info

Publication number: JPH1151895A
Application number: JP9220229A
Authority: JP
Inventors: Masao Goto; 正男後藤; Hiroki Mure; 博樹牟礼; Hideyuki Nagashima; 英行長嶋
Original assignee: Nok Corp
Current assignee: Nok Corp
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 1999-02-26
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: JP3528529B2

Abstract

(57)【要約】【課題】グルコースオキシダーゼによって代表される
酸化還元酵素を電極に固定化したバイオセンサであっ
て、作用極と対極とを対面構造をとるようにスペーサを
介した2枚の基板の内側に形成させたものにおいて、電
気的導通を確保するリード部との関係で、特殊な構造の
コネクタを必要とはしないバイオセンサを提供する。【解決手段】上記構造のバイオセンサにおいて、作用
極と対極とのリード部を各基板の表側に形成させ、各電
極とそれらのリードとを基板を貫通させて導通せしめ
る。基板を貫通させる導通は、一般に基板穿孔部に充填
された導電性物質によって行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素を電
極上に固定化したバイオセンサに関する。更に詳しく
は、酸化還元酵素を電極上に固定化し、作用極と対極と
を対面構造をとるように配置したバイオセンサに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】グルコースオキシダーゼを作用極上に固
定化せしめた従来のグルコースバイオセンサにあって
は、作用極以外に対極あるいは対極と参照極とが平面状
基板の同一面上に配置されている。このような電極配置
のグルコースバイオセンサにおいて、測定サンプルを作
用極に接触させるには２つの方法がとられている。

【０００３】その第１の方法は、直接測定サンプルを作
用極上に滴下する方法であるが、この方法ではサンプリ
ングから滴下迄手間と時間を要するという問題がある。
その第２の方法は、電極基板の上に溝を有するスペーサ
を配置し、その上に更に空気孔を設けたカバーを配置し
た構造のものを用いるという方法である。この方法で
は、測定サンプルが直接作用極上に導かれるため手間や
時間がとられないという利点がある反面、空気孔の設置
を必要とするなど、素子製作において煩雑な工程を必要
とするという欠点を有している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本出願人は先
に、グルコースオキシダーゼを電極上に固定化せしめた
グルコースバイオセンサであって、製作および測定が容
易であり、従って使い捨てグルコースバイオセンサとし
て好適なものとして、作用極および対極とを対面構造を
とるように配置し、より具体的には作用極を配置した基
板と対極を配置した基板との間にスペーサを介在させる
ことにより対面構造をとるように配置したものを提案し
ている(特願平8-175585号)。

【０００５】かかるグルコースオキシダーゼは、微量サ
ンプルでも測定を可能とするという所期の目的は達成さ
せるものの、電気的導通を確保するためのリード部が、
内部で向き合っている構造をとるため、電極間に特殊な
構造のコネクタを必要とするという難点がみられた。

【０００６】本発明の目的はグルコースオキシダーゼに
よって代表される酸化還元酵素を電極に固定化したバイ
オセンサであって、作用極と対極とを対面構造をとるよ
うにスペーサを介した2枚の基板の内側に形成させたも
のにおいて、電気的導通を確保するリード部との関係
で、特殊な構造のコネクタを必要とはしないバイオセン
サを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
上記構造のバイオセンサにおいて、作用極と対極とのリ
ード部を各基板の表側に形成させ、各電極とそれらのリ
ードとを基板を貫通させて導通せしめることによって達
成され、基板を貫通させる導通は、一般に基板穿孔部に
充填された導電性物質によって行われる。

【０００８】

【発明の実施の形態】かかるバイオセンサにおいて、各
基板の一端側がそれぞれテーパー部を形成しており、各
テーパー部に作用極および対極の先端部が設けられた態
様のものは、離間された電極間がとがった形状の基板テ
ーパー部に設けられることになるので、グルコース水溶
液等の測定液が微量であってもそれを直接採取すること
ができ、従って作用極との接触も速やかに行われるので
非常に好都合である。

【０００９】図示された例は、かかる好ましい態様を示
しており、図1はそれの斜視図、また図2はその長さ方向
の中心線断面図をそれぞれ示している。

【００１０】2枚の基板1,2が用意され、各基板の中心部
には穿孔部(スルーホール)3,4が設けられている。各基
板の一端側には、それぞれテーパー部5,6が形成されて
おり、各基板の内側にはスルーホール3,4からテーパー
部5,6にかけて、先端部が位置するように作用極7および
対極8がそれぞれ設けられている。また、各基板の表側
にはスルーホール3,4からテーパー部5,6の他端側9,10に
かけて、作用極リード部11および対極リード部12が設け
られている。これらの各電極およびそれらのリード部
は、布等によって研磨されていることが好ましい。

【００１１】なお、参照極を設ける場合には、参照極は
参照極リード上にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタ
リング法などによって一旦銀電極を形成させた後、定電
流電解する方法あるいは塩化第２鉄水溶液中に浸漬する
方法、更にはスクリーン印刷法によって塩化銀を塗布、
積層させる方法などによって形成される。参照極は、作
用極側の基板上あるいは対極側の基板上のいずれにも設
置することができるが、作用極側の基板上に設置するこ
とが好ましい。実際には、同一基板上に他の電極と平行
にやはりスルーホールを介して表側にリード部を引き出
すようにして形成され、ただし参照極部は混合物層によ
って覆われていなくともよい。

【００１２】各基板の穿孔部3,4には、基板を貫通させ
て作用極7およびそのリード11、対極8およびそのリード
部12を導通せしめる導電性物質13,13′が充填されてい
る。このような各部を有する各基板1,2は、作用極7と対
極8とが向い合って対面構造をとるような位置関係にな
るように、テーパー部5,6を除く部分にスペーサ14を介
在せしめる。スペーサ14の取付けは、スペーサ両面の接
着剤層15によって行われる。

【００１３】テーパー部先端に位置する作用極上には、
酸化還元酵素が固定化され、その際、酸化還元酵素は、
電子伝達体(メディエータ)との混合物層15として形成さ
せることが好ましい。また、テーパー部先端に位置する
対極上にも、やはり酸化還元酵素-電子伝達体混合物層1
6を設けることは好ましいことである。なお、これら混
合物層を設けられない作用極上および対極上には、ポリ
エチレンテレフタレート等のプラスチック製絶縁膜17,1
8が約0.1〜0.3mmの厚さで設けられる。

【００１４】基板としては、ポリエチレンテレフタレー
トによって代表されるプラスチック、生分解性プラスチ
ック、ガラス、セラミックス、紙等の絶縁性基板であっ
て、フィルム、シートまたは板状のものが用いられる。
作用極、対極およびこれらのリード部の形成は、穿孔部
を境とする表裏両面側に、カーボン、銀、金等のペース
トを用いるスクリーン印刷法あるいはパラジウム箔を用
いる箔付け法などによって行われる。孔径、位置などが
任意に設定され、必要に応じて複数個設けられるスルー
ホールには、銀ペースト、カーボンペーストあるいは半
田付けなどによって、導電性物質が充填される。また、
銀、カーボン等の導電性物質をスペーサ両面の接着剤中
に含ませておき、スペーサを貼り付ける際の圧力で、そ
の導電性物質含有接着剤をスルーホールに充填させ、そ
こでの導通を図ることもできる。

【００１５】固定化せしめる酸化還元酵素としては、グ
ルコースオキシダーゼ乳酸オキシダーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、ピルビル酸オキシダーゼ、グルコースデヒ
ドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビル
酸デヒドロゲナーゼ等があり、これらによってグルコー
ス、乳酸、アルコール、ピルビン酸、抗原等の有機物
質、塩素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、
水素イオン、溶存酸素等の電解質や無機物質の濃度測定
が可能であるが、最も一般的に用いられるグルコースオ
キシダーゼによるグルコース濃度の測定法について、以
下では説明することとする。

【００１６】グルコースオキシダーゼは、一般には作用
極上に固定化せしめるが、グルコースオキシダーゼは測
定サンプルである水溶液中に溶解され、作用極上で反応
するようになるため、作用極周辺、対極またはその周辺
などに固定化させていてもよい。

【００１７】グルコースオキシダーゼの電極への固定
化、好ましくは作用極上への固定化は、以下に列挙され
る如く、グルコースオキシダーゼ単体としてばかりでは
なく、電子伝達体(メディエータ)およびアルブミンの少
なくとも一種を添加した混合物層としても形成される。 (1)グルコースオキシダーゼ層 (2)グルコースオキシダーゼ-電子伝達体混合物層 (3)グルコースオキシダーゼ-アルブミン混合物層 (4)グルコースオキシダーゼ-電子伝達体-アルブミン混
合物層

【００１８】グルコースオキシダーゼ層(1)の形成は、
グルコースオキシダーゼ(GOD)を、例えば165800単位/g
のGODの場合その約1〜50mg、好ましくは約5〜30mgを蒸
留水またはクエン酸緩衝液(約0.05〜0.2M濃度)１mlに溶
解させ、その溶液(GOD溶液)約0.5〜10μl、好ましくは
約1〜3μlを滴下法、スピンコート法などによって滴下
し、室温で乾燥させて、膜厚約0.05〜10μm、好ましく
は約0.1〜2μmの層を形成させることにより行われる。

【００１９】混合物層(2)〜(4)の場合にも、この場合と
同様の形成方法が行われ、ただしGOD水溶液中に更に次
の各成分が添加された溶液が用いられる。混合物層(2)
の場合：フェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等
が電子伝達体として用いられ、フェリシアン化カリウム
にあっては約1〜100mg、好ましくは約30〜60mgを、パラ
ベンゾキノンにあっては約1〜200mg、好ましくは約50〜
150mgを更に添加した溶液を使用混合物層(3)の場合：牛血清アルブミンを約1〜100mg、
好ましくは約5〜30mgを更に添加した溶液を使用混合物層(4)の場合：混合物層(2)の形成に用いられた量
の電子伝達体および混合物層(3)の形成に用いられた量
の牛血清アルブミンを更に添加した溶液を使用

【００２０】添加された電子伝達体は下記の如く作用
し、またアルブミンやクエン酸緩衝液の添加は、測定液
(グルコース水溶液)のpH変化に対して出力誤差を抑制
し、バラツキのより少ない測定結果を与える。また、ノ
ニオン系界面活性剤を電極付近に塗布することにより、
測定液の吸収、それに引続く混合層の溶解に寄与し、測
定精度を向上させるという効果も得られる。

【００２１】グルコースがGODの作用により酵素の存在
下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき
発生するH₂O₂を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値
を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求め
る方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈
されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素
濃度に律速されるため、グルコース濃度が約100mg/dl程
度迄しか直線検量範囲を示さない。

【００２２】そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代
わりに、電子伝達体がGODと共に用いられる。メディエ
ータがフェリシアン化カリウムK₃Fe(CN)₆の場合、この
反応は次のように進行する。この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化さ
れて酸化電流を生ずる。

【００２３】また、メディエータとしてフェリシアン化
カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合に
は、GOD存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの
反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキ
ノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値
が測定される。

【００２４】一方、対極上には、特に何も固定化しなく
とも使用し得るが、アルブミンおよび電子伝達体の少な
くとも一種からなる混合物層を形成させて用いてもよ
い。この場合には、作用極上のみに混合物層を設けた場
合にみられる測定液による混合物層の溶解、拡散に生じ
勝ちな傾きがみられなくなる利点があり、測定精度も上
昇する。

【００２５】なお、固定化せしめたGODへの測定サンプ
ル液の接触を円滑に行わしめるために、作用極上、対極
上、作用極周辺、対極周辺、作用極上およびその周辺、
対極上およびその周辺などに、ノニオン系界面活性剤を
塗布したり、不織布、ロ紙等の含浸促進剤をスペーサ間
隙を利用して挾着させるなどの手段を適用することも可
能である。

【００２６】グルコース濃度の測定は、このようにして
作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグルコ
ース水溶液約0.1〜10μlを接触させ、約1〜120秒間程度
反応させた後、そこに約0.05〜1.5V、好ましくは約0.4
〜1.1Vの電圧を印加し、例えば印加10秒後の電流値を測
定することによって行われる。測定には、ポテンショガ
ルバノスタットおよびファンクションジェネレータが用
いられる。

【００２７】

【発明の効果】作用極を配置した基板と対極を配置した
基板との間にスペーサを介在させることにより対面構造
をとるようにしたバイオセンサにおいては、電極リード
部が内部で向い合う構造をとるため、特殊な構造のコネ
クタを必要としたが、基板に穿孔部を設け、そこから作
用極および対極のリード部を基板外部表面側に導くこと
により、特殊なコネクタを必要とはしないものが得られ
るようになる。

【００２８】また、かかるバイオセンサにおいて、作用
極と対極とを対面構造とすることにより、容易に製作お
よび測定が可能であり、従ってこのようなバイオセンサ
は、原液サンプルが測定液とされる使い捨てバイオセン
サとして、家庭内健康診断(セルフア)、特に血糖、尿糖
の測定による糖尿病の自己管理、糖尿病の予防および早
期発見などに効果的に用いることができ、また食品製造
工程中のグルコース管理に用いられるなど、幅広い用途
を期待することができる。

【００２９】

【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。

【００３０】実施例１図示された態様のバイオセンサが、次のようにして作成
された。スルーホールを有する2枚のポリエチレンテレ
フタレートフィルム(厚さ0.25mm)に、スルーホールを境
いとしてその表裏両面側にカーボンペーストを用いるス
クリーン印刷法により、幅1.0mm、厚さ10μmの作用極、
対極およびそれらのリード部を形成させた。更に、スル
ーホール部(直径0.8mm)には、銀ペーストを塗布するこ
とにより銀を充填し、作用極または対極とそれらのリー
ド部との導通を確保した。また、所定の絶縁膜が、作用
極上および対極上に熱硬化性ポリエステルを用いたスク
リーン印刷法によって設けられた。

【００３１】このようにして作用極を形成させた1枚の
ポリエチレンテレフタレートフィルム(上記2枚の内の任
意の1枚)の作用極上に、水1mlにグルコースオキシダー
ゼ(165800単位/g)10mgおよびフェリシアン化カリウム48
mgよりなる混合液(ドープ液)を1.5μl滴下して、室温条
件下で乾燥させ、混合物層を形成させた。

【００３２】この混合物層形成電極基板に、両面接着剤
付きスペーサ(材質:ポリエチレンテレフタレート、厚
さ:0.25mm)を用いて、他の電極基板を貼り合せ、対面構
造を有するグルコースバイオセンサを作製した。

【００３３】上記グルコースバイオセンサに1μlのpH5.
0のグルコース水溶液試料(濃度250mg/dl)を吸引させ、8
0秒間静置した後、作用極-対極間に0.9Vの電圧を印加
し、印加10秒後の電流値(単位:μA)を測定した。測定は
9回行ない、平均値およびCV値(平均値に対する標準偏差
の割合)を算出した。測定には、ポテンショガルバノス
タット(北斗電工製HA-501)およびファンクションジェネ
レータ(同社製HB-104)が用いられ、この装置に上記グル
コースバイオセンサが取り付けられ、測定が行われた。
なお、センサは1試料測定毎に使い捨てとした。 24.0 22.0 25.5 24.5 27.0 23.0 26.0 25.0 24.5 平均値:24.6 CV値:6.2%

【００３４】実施例２実施例1において、各電極部は布によって研磨して用い
られ、混合物層が作用極上または両極上に形成された。

【００３５】実施例３実施例2において、グルコース水溶液試料のpHを水酸化
ナトリウム水溶液によって7.0とすると共に、アルブミ
ン10mgが更に添加されたドープ液が用いられ、混合物層
が両極上に形成された。

【００３６】実施例４実施例2において、グルコース水溶液試料のpHを7.0にす
ると共に、ドープ液がpH5.0の0.1Mクエン酸緩衝液より
調整され、混合物層が両極上に形成された。

【００３７】実施例５実施例3において、アルブミン添加ドープ液がpH5.0の0.
1Mクエン酸緩衝液より調整された。

【００３８】実施例６実施例2において、作用極または両極の周辺に、ノニオ
ン系界面活性剤トリトンX-100(UCC社製品）の0.5重量%
水溶液を塗布、乾燥させた後、混合物層の形成が行われ
た。

【００３９】実施例2〜6で得られた結果(n=5)は、次の
表に示される。実施例混合層測定値(μA) 平均(μA) CV(%) 2 作用極 24.0 22.0 25.5 24.5 27.0 24.6 6.2 両極 24.0 22.5 24.5 24.0 26.0 24.2 5.2 3 両極 24.0 23.0 24.0 24.0 25.0 24.2 3.2 4 両極 24.0 23.5 24.0 24.0 25.0 24.1 2.9 5 両極 24.0 24.0 24.0 24.0 24.5 24.1 2.4 6 作用極 24.2 22.5 25.0 24.0 26.0 24.2 3.4 両極 24.0 23.5 24.5 24.0 25.0 24.2 3.3

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るバイオセンサの一態様の斜視図で
ある。

【図２】本発明に係るバイオセンサの一態様の長手方向
の中心線断面図である。

【符号の説明】

1,2 基板 3,4 スルーホール 5,6 テーパー部 7 作用極 8 対極 9,10 基板他端部 11 作用極リード部 12 対極リード部 13,13′ 導電性物質 14 スペーサ 15 接着剤層 16 混合物層 17,18 絶縁膜

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸化還元酵素を電極上に固定化したバイ
オセンサにおいて、作用極と対極とを対面構造をとるよ
うにスペーサを介した2枚の基板の内側に、またこれら
各電極のリード部を各基板の表側にそれぞれ形成させ、
各電極とそれらのリード部とを基板を貫通させて導通せ
しめてなるバイオセンサ。
【請求項２】基板を貫通させる導通が基板穿孔部に充
填された導電性物質によって行われた請求項1記載のバ
イオセンサ。
【請求項３】各基板の一端側がそれぞれテーパー部を
形成しており、各テーパー部に作用極および対極の先端
部が設けられている請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項４】作用極上に酸化還元酵素-電子伝達体混
合物層が形成された請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項５】作用極および対極上に酸化還元酵素-電
子伝達体混合物層が形成された請求項1記載のバイオセ
ンサ。
【請求項６】混合物層中に更にアルブミンが添加され
た請求項4または5記載のバイオセンサ。
【請求項７】混合物層の形成がクエン酸緩衝液を用い
て行われた請求項4、5または6記載のバイオセンサ。
【請求項８】作用極および対極の周辺にノニオン系界
面活性剤が塗布された請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項９】更に参照極が設けられた請求項１記載の
バイオセンサ。