JPH11509097A

JPH11509097A - 神経系疾患の治療および予防のためのｍｐ５２またはｍｐ１２１の使用

Info

Publication number: JPH11509097A
Application number: JP9505511A
Authority: JP
Inventors: ホーテン，ガートルード; ポール，ジェンス; ベクトルド，ロルフ; パウリスタ，ミヒャエル; ユンシッカー，クラウス
Original assignee: バイオファームゲセルシャフトツァールバイオテクノロジーシェンエントヴィックラングフォンファルマカエムベーハー
Priority date: 1995-07-12
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 1999-08-17
Also published as: WO1997003188A3; ZA965938B; AU6615196A; EP0837938B1; WO1997003188A2; US20030220248A1; DE19525416A1; US20020045568A1; EP0837938A2; US7632808B2; US6531450B2; ES2389624T3

Abstract

(57)【要約】本発明は神経系疾患の治療および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための、生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１の使用に関する。神経系疾患の治療および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための本発明による薬剤は、有効成分として生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】神経系疾患の治療および予防のためのＭＰ５２またはＭＰ１２１の使用本発明は、神経系疾患の治療および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの２つの増殖または／および分化因子であるＭＰ５２または／およびＭＰ１２１の使用に関する。さらに、本発明はＭＰ５２または／およびＭＰ１２１を含有する、上記の徴候を治療または予防するための薬剤に関する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多数の増殖因子（Kingsley，Genes & Develo pment 8，133-146（1994）およびそこに引用されている文献参照）は、特に傷の治癒および組織の再生に関係する広範な医学的治療方法および用途に適している。これらの増殖因子は、特にＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子、例えばRobertsおよびSporn，Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990)，p ．419-472，SpornおよびRoberts編、参照）、ＢＭＰ（骨誘導因子、例えばRosen およびThies，Growth Factors in Perinatal Development(1993)，p．39-58，Ts ang，LemonsおよびBalistreri編、参照）、およびインヒビン／アクチビン（例えば、Valeら，The Physiology of Reproduction，第２版，(1994)，p．1861-18 78，KnobilおよびNeill 編、参照）ファミリーのメンバーを含む。このスーパーファミリーのメンバーの成熟部分は高いアミノ酸相同性を有するが（特に、通常は７個の保存されたシステインがある）、それらの正確な機能はかなり異なる。ＴＧＦ−β様タンパク質は、全メンバーがシスチンノット(knot)モチーフを有する構造スーパーファミリーに属する(Cell，vol．73(1993)，p．421-424)。このスーパーファミリーのさらなるメンバーは、ＮＧＦ（神経成長因子）-／ニューロトロフィンファミリーおよびＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）ファミリーのタンパク質である。個々の増殖因子はしばしば同時に幾つかの機能を示すので、種々の医学的徴候に対してそれらを使用することは興味深い。これらの多機能性タンパク質の幾つかは、例えば多くの細胞タイプにおける増殖および分化の調節という機能の他に、ニューロンに対する生存促進効果をも有する(RobertsおよびSporn，Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990) ，p．419-472，SpornおよびRoberts編；Sakuraiら，J．Biol．Chem．269(1994) ，p．14118-14122)。このように、例えば、ＴＧＦ−βについて、胚の運動および感覚ニューロンに対する栄養効果がin vitroで示された(Martinouら，Devl． Brain Res．52，p．175-181(1990)およびChalazonitisら，Dev．Biol．152，p． 121-132(1992))。さらに、ＴＧＦ−β−１、−２、−３、アクチビンＡおよびＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子）、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーと構造的類似を有するタンパク質について、中脳のドーパミン作動性ニューロンに対する生存促進効果が示されたが、これらの効果はアストロサイトによって媒介されてはいなかった(Krieglsteinら，EMBO J．14，P．736-742(1995) )。 WO 93/16099，WO 95/04819およびWO 96/01316 は、ＴＧＦ−β様タンパク質、特にＭＰ５２およびＭＰ１２１のＤＮＡおよびタンパク質配列を開示している。 WO 95/04819 には、ＭＰ５２の軟骨および骨誘導効果が開示されている。種々の組織段階および発生段階におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質の存在は、それらの正確な機能、並びに標的部位、寿命の長さ、補助因子の必要性、必要な細胞性生理環境および／または分解耐性に関する差異に対応する。本発明の目的は、神経系疾患の治療または予防を可能とするタンパク質を提供することである。興味深いのは、神経機能の障害または喪失の治療である。これらは、例えば脳血管性、炎症性、感染性、代謝性等の欠陥または／および毒性作用、傷害、腫瘍増殖若しくは手術過程によって引き起こされた欠陥、等における急性の病理学的状態によって引き起こされうる。さらに、神経機能の障害または喪失は、特に神経退行性疾患等の慢性的な病理学的状態によって引き起こされうる。神経病理学的状態は、神経系の老化によってもしばしば引き起こされる。この目的は、神経系疾患の治療または／および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための、生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１の使用によって達成される。本発明により、ＭＰ５２がドーパミン作動性ニューロンの生存に対して陽性の効果を及ぼすことが示された（図３参照）。しかし、ＴＧＦ−βおよびアクチビンＡとは対照的に、この効果は少なくとも部分的には、神経細胞に関連するアストロサイトによって媒介される（図４参照）。したがって、ＭＰ５２は神経系疾患、特に脳に影響を及ぼす疾患の治療または予防に有用である。これに関連して、パーキンソン病等の神経退行性疾患および恐らくアルツハイマー病またはハンチントン舞踏病等の疾患もまた特に興味深い。さらに、ＭＰ５２の適用はニューロンの生存を促進し、その結果神経性機能を維持する。全ての可能性のある使用は、急性および慢性の病理学的状態に適用可能であり、これは予防手段にもあてはまる。この場合、急性の病理学的状態は主として脳血管性、炎症性、感染性、代謝性等の欠陥現象または／および毒性作用、傷害、腫瘍増殖若しくは手術過程よって引き起こされた欠陥、と理解される。本発明の範囲内で治療することができる慢性の病理学的状態とは、例えば神経退行性疾患である。さらに、本発明により、ＭＰ５２はまた網膜のニューロンに対して刺激作用を及ぼすことが示された。視覚系の発生の間に、軸索は網膜の神経節細胞から脳の特別な領域へ移動する。幾つかのグループが、脳の視覚領域から単離された可溶性因子が網膜の神経節細胞を刺激できることを示した（Nurcom be，V.およびBennett，M.R.，Exp．Brain Res．44，249-258(1981); Hyndman，A .G.，Adler，R.，Dev．Neurosci．5，40-53(1982); Turner，J.E.ら，Dev．Brai n Res．6，77-83(1983); Carri，N.G.およびEbendal，T.，Dev．Brain Res．6， 219-229(1983))。恐らく網膜の神経節細胞から生じる視覚軸索である神経繊維束の形成は、神経栄養因子に依存する。ＭＰ５２を用いた実験は、この系においてこのタンパク質が神経栄養因子としても作用しうることを示した。したがって、ニワトリ由来の胚網膜の新たに単離した組織培養物を用いて、ＭＰ５２は神経繊維の成長を大幅に促進することを示すことができた（図６および表１参照）。これらの実験の間、ＴＧＦ−βファミリーのさらなるメンバーもまた刺激効果を有することが示された。これらのメンバーには、特に、ＭＰ５２と殆ど同じ強い効果を有するＭＰ１２１(WO 93/16099およびWO 96/01316)（図６および表２参照）が含まれる。ＭＰ５２およびＭＰ１２１の活性を用いて、眼、特に網膜および視神経の疾患を癒すことが可能である。これに関連して、網膜ニューロン層および視神経の損傷の治療を強調しなければならない。このような損傷は、例えば事故、炎症または循環傷害によって引き起こされうる。網膜移植におけるこれらタンパク質の使用もまた有利である。さらに、他の脳神経への損傷の治癒または軽減もまた重要である。この場合、例えば、これもまた眼の一部に分布する三叉神経が強調される。したがって、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、特にＭＰ５２およびＭＰ１２１は角膜移植のためにも用いることができる。角膜の増殖もまた神経の供給によって影響される。眼におけるヘルペス感染の場合に起こるような、角膜への部分的損傷のみの症例における使用もまた考えられる。特に、眼表面の退行性疾患のための使用が強調されねばならない。本発明の好ましい実施態様においては、生物学的に活性なＭＰ５２として以下のものが使用される：（ａ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。別の好ましい実施態様においては、生物学的に活性なＭＰ１２１として以下のものが使用される：（ａ）配列番号３または４に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。本発明の他の特徴および利点を、好ましい実施態様の記述および図によって示す。配列プロトコールおよび図を以下に簡単に説明する。配列番号１は、配列番号２に示すヌクレオチド配列に由来するとともにすでに WO 95/04819 に開示されている、ヒトＴＧＦ−βタンパク質ＭＰ５２のプレプロタンパク質の完全なアミノ酸配列を示す。成熟タンパク質の開始点は好ましくはアミノ酸361 〜400 の領域に存在し、特に好ましくはアミノ酸382 である。配列番号２は、WO 95/04819 にすでに開示されているＴＧＦ−βタンパク質ＭＰ５２をコードするＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を示す。ＡＴＧ開始コドンはヌクレオチド640 から始まる。完全な成熟タンパク質の開始は、特に好ましくはヌクレオチド1782の後である。終止コドンはヌクレオチド2143から始まる。配列番号３は、すでにWO 96/01316 に開示されている、ヒトＴＧＦ−βタンパク質ＭＰ１２１のプレプロタンパク質の完全なアミノ酸配列を示す。成熟タンパク質の開始点は好ましくはアミノ酸217 〜240 の領域に存在し、特に好ましくはアミノ酸236 または237 であり、そして最も好ましくはアミノ酸237 である。配列番号４は、これもWO 96/01316 に開示されている、マウス由来ＴＧＦ−β タンパク質ＭＰ１２１のプレプロタンパク質の完全なアミノ酸配列を示す。成熟タンパク質の開始点はヒトタンパク質と類似するアミノ酸217 〜240 の領域に存在し、好ましい成熟タンパク質の開始点はアミノ酸236 また237 である。図１は、再生前および再生後の、原核細胞系において発現された正面にメチオニンを有する成熟ＭＰ５２、およびＮ末端に付加的ヒスチジンタグを有する成熟ＭＰ５２を含有する、銀染色したゲルを示す。図２は、修飾されたＮ末端を有する二量体および単量体成熟ＭＰ５２を再生後に分離するためのクロマトグラムを示す。図３は、真核細胞発現系由来の部分精製ＭＰ５２、および原核細胞発現系由来の精製し再生した、修飾されたＮ末端を有する成熟ＭＰ５２を用いた処理によるドーパミン作動性ニューロンの生存に対する陽性効果を示す。図４は、ドーパミン作動性ニューロンに対するＭＰ５２の生存促進効果が、少なくとも部分的にはアストロサイトの数の増加によることを示す。図５は、ワクシニアウイルス発現系の助けを介してＨｅｐＧ２細胞中で合成されたＭＰ１２１に対する、ウサギ抗体を用いたウエスタンブロットを示す。図６は、胚網膜からの神経繊維の成長に及ぼす精製ＭＰ５２およびＭＰ１２１の刺激効果を示す。本発明の範囲内では、ＭＰ５２タンパク質の成熟部分はアミノ酸382 からアミノ酸501 までを含む。ＭＰ１２１の場合は、成熟部分は好ましくは配列番号３または配列番号４のアミノ酸237 からアミノ酸352 までを含む。さらに、本質的に同一の生物活性を有し、そして特に７個の保存されたシステイン領域を少なくとも含む部分領域を有する、全タンパク質のより短いまたはより長い機能性領域もまた場合により本発明の範囲内に包含される。本発明においては、なかんずく、成熟タンパク質のＮ末端の修飾は活性に大きな影響を与えないことを示すことができた。他の脊椎動物から単離されたＭＰ５２およびＭＰ１２１タンパク質もまた包含される。なぜなら、これらは本質的に同一の活性を有するからである。他方、ＭＰ５２またはＭＰ１２１の成熟部分の他に、これらのタンパク質は機能性シグナルまたは／および他のタンパク質のプロペプチド部分、例えばシスチンノットモチーフを有するタンパク質に由来するもの(Cell，vol．73（1993）p. 421-424)、および特にＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のタンパク質に由来するもの（例：前述のＴＧＦ若しくはＢＭＰまたはアクチビン／インヒビンタンパク質、特にＭＰ１２１およびＭＰ５２）をも含むことができる。対応するヌクレオチド配列は、本明細書に開示した前述の参照文献およびそこで引用された文献、および／またはEMBLデータベースまたはGenbank から得ることができる。これに関連して、成熟タンパク質の正しい読み枠を保持することが重要である。どの宿主細胞で発現が起こるかによって、別なシグナル配列または／および別のプロペプチド部分の存在が発現に陽性の影響を及ぼし得る。プロペプチド部分を他のタンパク質の対応する部分によって置換することが、例えば Mol．Endocrinol． 5(1991)，p．149-155およびProc．Natl．Acad．Sci．USA 90(1993)，p．2905-29 09に記述されている。本発明のさらなる好ましい実施態様は、上記の定義による、そして好ましくは配列番号１または３または４に示されるＭＰ５２またはＭＰ１２１の機能性誘導体または部分、特に成熟タンパク質の機能性部分、およびさらに他のタンパク質の部分を有する融合タンパク質の使用である。この場合、他のタンパク質はここでもまたシスチンノットモチーフを有する、好ましくはＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質、例えばＭＰ５２およびＭＰ１２１の組合せでありうる。しかし、完全に異なるタンパク質の部分もまた存在しうる。例えば、元のＭＰ５２またはＭＰ１２１タンパク質に別の特異性を付与する、タンパク質の受容体結合ドメインでありうる。本発明のさらに別の好ましい実施態様は、上記の定義による生物学的に活性なＭＰ５２又はＭＰ１２１の単量体と、シスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリーに由来するタンパク質（好ましくはＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）の単量体とからなるヘテロ二量体タンパク質の使用である。類似のヘテロ二量体タンパク質が、例えばWO 93/ 09229、EP 0 626 451 A2 およびJ．Biol．Chem．265(1990)，p．13198-13205に記述されている。タンパク質の特徴はホモ二量体またはヘテロ二量体の形成によって変わり、そして治療的使用に適しうる。ＭＰ５２の生産のため、配列番号２に示すＤＮＡ配列、その部分、または本発明によるキメラタンパク質をコードする配列を使用することができる。発現は真核生物および原核生物宿主細胞において起こりうる。適切な発現系は当業者に公知であり、また記述された実験において、活性を示す発現タンパク質を得るために配列番号２のどの最少部分が必要かを決定するのは容易である。発現系は、例えばバキュロウイルスまたはワクシニアウイルス系等のウイルス系をも含む。宿主細胞または／および細胞培養物上清から医学的治療に使用するのに十分な量の本発明による精製タンパク質を生産するために、大腸菌(E．coli)またはバチルス属菌(Bacillus)等の細菌、酵母等の菌類、タバコまたはシロイヌナズナ(Arabi dopsis）等の植物細胞、またはＣＨＯ、ＨｕＴＫ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＯＳまたはＭｏ細胞系等の脊椎動物細胞系、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera fr ugiperda)（ＳＦ９）またはトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)（ＴＮ３６８）等の昆虫細胞系を用いることができる。組換え昆虫ウイルス、例えばボンビックス・モリ(Bombyx mori)核多角体病ウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ボンビックス・モリまたはスポドプテラ・フルジペルダ等の昆虫の幼虫内で発現させることも可能である。このような系は、例えば Ishidaら，(J．Biochem ．115(1994)，p．279-285)に記述されている。細菌を用いて生産する場合は、本発明のタンパク質は封入体の形で存在する場合がある。活性形のタンパク質を得るため、これらの封入体は公知の方法にしたがって再生される。本発明の範囲内で、再生して二量体ＭＰ５２を形成することが活性にとって必要であることが示された。なぜなら、単量体ＭＰ５２は全く活性をもたないからである（図３参照）。同じことが、WO 96/01316 に詳述されているＭＰ１２１の生産にも当てはまる。シスチンノットファミリーの他のメンバーとのヘテロ二量体タンパク質を作製するためには、両方のタンパク質単量体を同一の細胞または別々の細胞で発現させる。ここでは、封入体が形成された場合、共同の再生が適切であると思われる。同一細胞において同時発現を行なう場合、例えばバキュロウイルス系、ワクシニアウイルス系、等のウイルス系が特に適切である。ヘテロ二量体タンパク質の作製および精製は原則として当業者に公知であり、例えばWO 93/09229およびEP 0 626 451 A2 に記述されている。各場合において片方の単量体に特異的な抗体を充填した連続アフィニティーカラムを用いて、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができる。他のタンパク質部分を有するキメラタンパク質の作製は、当業者であれば精通しており実施することができるＤＮＡレベルにおける適切な改変を必要とする(E MBO J．10(1991)，p．2105-2110; Cell 69（1992）p．329-341; J．Neurosci．3 9(1994)，p．195-210)。さらなる好ましい実施態様においては、上記の形のうち１つの形をした生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１に加えて、天然に存在するガングリオシド、その誘導体、塩、または人工的類似体が投与される。さらに、そのほかに増殖因子を投与することが好ましい。この場合、シスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来のタンパク質が好ましいとともに、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＮＧＦ／ニューロトロフィンファミリーまたはＰＤＧＦファミリー由来のタンパク質が好ましい。ＮＧＦ／ニューロトロフィンファミリーに属する増殖因子が特に好ましい。例えば、増殖因子ＮＧＦ、ＢＤＮＦ，ＮＴ−３またはＮＴ４／５である（Guidebook to Cytokines and their Rec eptors，Nicos A.，Nicola，A Sambrook and Tooze Publication，Oxford Unive rsity Press，1994，p．140-143 およびそこに引用されている文献も参照）。他の好ましい増殖因子は、ＦＧＦ，ＥＧＦおよびグリア増殖因子である。このような組合せは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーについてすでに示された相乗効果(Ogawaら，J．Biol．Chem．267（1992）14233-14237 またはUS 541398 9）のような相乗効果をもたらすことも可能である。必要であるか、または有利である場合には、常用の製剤用担体物質、補助剤、希釈剤または賦形剤をさらに添加できることは当業者には自明である。ＭＰ５２または／およびＭＰ１２１を含有する組成物の投与は、可能な最大の効果が達成されるような、そして標的領域付近への投与にとって特に好都合であり得るような方法で、適宜実施される。投与はなかんずく脳内へ、経口的に、注射により、吸入により、または局所外用塗布として実施される。さらに、本発明は神経系疾患の治療または／および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための薬剤の製造のための生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１の使用に関する。この場合、好ましい実施態様および使用方法は、本発明の先の主題に関してすでに記述した実施態様に一致する。さらに、本発明は配列番号１に示すＭＰ５２の配列の成熟領域の少なくとも部分、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別のタンパク質の少なくとも部分を含む融合タンパク質に関する。本発明のこのような融合タンパク質は、好ましくは以下のものを含む：（ａ）配列番号１由来の完全な成熟タンパク質部分および場合により配列番号１に示すタンパク質配列のさらなる機能性部分；（ｂ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分であるが、修飾されたＮ末端（好ましくはメチオニンが正面に位置する）を有するもの；または（ｃ）他の脊椎動物に由来するその起源のために相違を有するが、本質的に同一の活性を保持する、配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分またはその一部。このような融合タンパク質の作製、および非ＭＰ５２タンパク質部分に由来する適切なタンパク質の例は上にすでに記述してある。本発明のさらなる主題は、成熟ＭＰ５２タンパク質の配列番号１によって示される配列の少なくとも一部分を単量体として、そしてシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリーに由来する別のタンパク質を第２の単量体として含むヘテロ二量体タンパク質である。この場合にも、ＭＰ５２部分（ＭＰ５２単量体）が以下のものを含むことが好ましい。（ａ）配列番号１由来の完全な成熟タンパク質部分および場合により配列番号１に示すタンパク質配列のさらなる機能性部分；（ｂ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分であるが、修飾されたＮ末端（好ましくはメチオニンが正面に位置する）を有するもの；または（ｃ）他の脊椎動物に由来するその起源のために相違を有するが、本質的に同一の活性を保持する、配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分またはその一部。ヘテロ二量体タンパク質の作製、および第２の単量体として適切なタンパク質もまた、上にすでに記述してある。本発明のさらなる主題は、活性成分として生物学的有効量のＭＰ５２または／およびＭＰ１２１を含む、神経系疾患の治療および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための薬剤である。本発明の上記薬剤は、生物学的に活性なＭＰ５２として、好ましくは以下のものを含む：（ａ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。第２の好ましい形態においては、本発明の薬剤は生物学的に活性なＭＰ１２１として以下のものを含む：（ａ）配列番号３または４に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。上記タンパク質の可能な治療上の使用は、ホモ二量体またはシスチンノットモチーフを有する他のタンパク質（特にＴＧＦ−βまたはＮＧＦタンパク質）とのヘテロ二量体の形成によって、およびキメラタンパク質の使用によって変わりうる。そのような構造もまた臨床上の使用に適切であると証明されうる。したがって、そのような構造もまた本願の主題の１つである。したがって、本発明のヘテロ二量体タンパク質および／または融合タンパク質を含む医薬組成物もまた包含される。ＭＰ５２またはＭＰ１２１とＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のタンパク質（例えばＧＤＮＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰおよびアクチビン等）、またはＮＧＦ／ニューロトロフィンファミリーのタンパク質〔例えばＮＧＦ、ＮＴ−３ＮＴ−４／５またはＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）等のニューロトロフィン、およびＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、グリア増殖因子、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）等の増殖因子〕との組合せもまた、医薬組成物においては好都合であり得る。このような組合せもまた本願の主題である。本発明の組成物は、活性成分のほかに場合により製剤上許容される担体物質、補助剤、希釈剤または／および賦形剤を含む。このような組成物は好ましくは天然に存在するガングリオシド、またはその誘導体、塩、若しくは人工的類似体をも含み得る。神経性疾患を治療または予防するために、ＭＰ５２またはＭＰ１２１を注射または経口投与、非経口投与、脳内投与、吸入投与、局所投与または他の一般的な医学的方法により投与することができる。用量は、体重１ｋｇあたり0.1 から10 00μg の範囲である。生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１、または本発明のヘテロ二量体タンパク質および／またはキメラタンパク質を、例えば、適切なＤＮＡ要素をトランスフェクトすることによりあらかじめ本発明のタンパク質（特にＭＰ５２またはＭＰ１２１）を構成的に発現するように作製しておいた、移植された胚幹細胞を介して投与することが可能である。さらに、特定のウイルス系を手段として本発明のタンパク質、特に生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１を提供することが可能である。したがって、本発明のＤＮＡ配列を含む適切なベクターをin vitroまたはin vivoで患者の細胞にトランスフェクトするか、または該ベクターをin vitroで細胞にトランスフェクトし、その後これらの細胞を患者に移植することが可能である。さらに、この医薬組成物の使用はヒトに限定されず、動物、特に家畜にも適用できる。一般に、本発明にしたがって使用されるタンパク質は、何らかの点でＭＰ５２またはＭＰ１２１の発現と関連している、あるいは存在するＭＰ５２またはＭＰ１２１の活性量を増大させるか、またはＭＰ５２若しくはＭＰ１２１の活性を抑制するかのいずれかによって何らかの方法でＭＰ５２またはＭＰ１２１に応答する、神経系疾患を治療するために使用できる。ＭＰ５２またはＭＰ１２１の活性は、例えば当業者に公知のアンチセンス核酸によって転写および／または翻訳を阻害することにより抑制することができる。別の可能性は、ＭＰ５２またはＭＰ１２１とは対照的にシグナル伝達の引き金を引かない分子をＭＰ５２またはＭＰ１２１受容体に結合させることである。したがって、本発明の範囲内で、細胞上のＭＰ５２またはＭＰ１２１受容体は興味深い。受容体を発見するためには、まず最初に種々の細胞系を、放射性同位体で標識したＭＰ５２またはＭＰ１２１（¹²⁵ Ｉ−ＭＰ５２または¹²⁵Ｉ−ＭＰ１２１）との結合性について試験し、その後架橋することができる。その後、ＭＰ５２またはＭＰ１２１に結合する細胞のｃＤＮＡライブラリーを発現ベクター（例えばInVitrogenから入手可能）中に確立することが可能である。次に、放射性標識したＭＰ５２またはＭＰ１２１と結合させることにより、受容体ｃＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞を選択することができる。アクチビン(Mathews，L.S.およびVale，W.W.，Cell 65（ 1991）p．973-982)およびＴＧＦ−β受容体II型(Linら，Cell 68（1992）p．775 -785)の単離のために使用されたようなこれらの方法は、当業者に公知である。公知のアクチビン、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ受容体に類似して、このファミリーの一部である受容体ＭＰ５２およびＭＰ１２１もまた受容体複合体であることが推定できるので、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ等の当業者に公知のさらなる方法を用いてヘテロマー性(heteromeric)複合体の部分を見つけだすことが可能である。この方法はアクチビン受容体Ｉ型、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型およびＢＭＰ受容体Ｉ型についても使用された(Tsuchidaら,（1993）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 90，11242-11246; Attisanoら,（1993）Cell 75，671-680; Franzen ら,（1993）Cell 75，681-692; ten Dijkeら,（1994）J．Biol．Chem．269，169 85-16988; Koenigら,（1994）Mol．Cell．Biol．14，5961-5974)。以下の実施例により本発明を説明することが意図される。実施例１：ＭＰ５２の真核細胞による発現および精製ＭＰ５２を発現するため、ワクシニアウイルスを選択した。このウイルスの使用は Current Protocols in Molecular Biology の第16章、ユニット16.15-16.1 8(Ausubelら，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，Wiley & Sons(1989-1995))（以下ＣＰと略す）に詳細に、かつ当業者が再現できる方法で記述されている。ＭＰ５２の完全なコード領域を含むｃＤＮＡをベクター pBP 1 中にクローン化した。得られたプラスミド(pBP1MP52s)を1994年5 月24日にＤＳＭに寄託し（寄託番号9217）、これをWO 95/04819 に開示されている組換えワクシニアウイルスの作製に使用した。組換えワクシニアウイルスを用いた感染後の１４３Ｂ細胞(HuTk，ATCC CRL 8303)におけるＭＰ５２の発現を、WO 95/04819 に開示されているように実施した。ＭＰ５２を上記の開示に記述されている通り、ヘパリンカラム(HiTrap^TM，Pharmacia #17-0407-01)により、そして次に逆相HPLC(C8カラム、Aquapore RP300，Applied Biosystems，粒子径: 7 μm，細孔径: 300 Å)により部分的に精製した。ＭＰ５２を含む画分をプールし、凍結乾燥し、-80℃で保存した。実施例２：ＭＰ５２の原核細胞による発現、精製および活性ＭＰ５２を形成するための再生大腸菌におけるＭＰ５２の可能な発現はWO 93/16099 およびWO 95/04819 にすでに開示されている。Ｎ末端にヒスチジンを結合させた成熟ＭＰ５２の発現もまた開示されている(WO 95/04819)。この付加的ヒスチジンは、金属キレートカラムに結合することによりタンパク質の精製を容易にする。精製後、大腸菌中に単量体として発現された成熟ＭＰ５２タンパク質を二量体に再生することができる。Ｎ末端に６個のヒスチジンを含む10個の付加的アミノ酸（ＭＨＨＨＨＨＨＫＬＩ）を有する、ＭＰ５２の成熟領域の最も大きい部分(配列番号２のアミノ酸383 から501)を、原核細胞ベクターpBP2中で発現させた。このベクターは、pBluesc ript II SK プラスミド(Stratagene)由来のＴ７プロモーターをさらに含む、アンピシリン耐性を有するpBR322誘導体である。該ベクターはさらに、Ｔ７プロモーターおよび開始コドンの後にNdeI制限酵素開裂部位の一部としてリボソーム結合部位を有し、その後にヒスチジンの６個のコドンが続いている。挿入断片の挿入のための数個の制限酵素開裂部位(Hind III，Eco RI，Xho I，Bam HI，Sma I およびApa I)および３個の読み枠すべてにおける終止コドンの後にターミネーター（Ｔφ）が続いている。プラスミドpBP2MP52His は1995年6 月2 日にＤＳＭに寄託された(寄託番号：ＤＳＭ 10028)。NdeI制限酵素開裂部位を用いてＮ末端に１個の付加的メチオニンのみを有する成熟ＭＰ５２(配列番号１のアミノ酸382 から501)の発現のために同じベクターを使用した。プラスミドpBP2MP52m は1995 年6 月2 日にＤＳＭに寄託された(寄託番号：ＤＳＭ 10029)。ヒスチジン延長を持つ（ＭＰ５２His）または持たない（ＭＰ５２ｍ）ＭＰ５２タンパク質の発現は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの同時調製によって達成することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む第２プラスミド、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするファージを用いた感染、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ特殊な細菌株によって、等の種々の方法により調製することができる。細菌株BL21(DE3)pLysS（Novagen ，#69451-1）を用いて、そして製造者の指示に従ってIPTGを用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを誘導して、ヒスチジンタグを持つ、および持たないＭＰ５２タンパク質を封入体中に形成する。この封入体から標準的方法によりタンパク質を単離することができる。ヒスチジンタグのゆえに、ＭＰ５２Hisタンパク質は、例えばHochuli ら(BIO/Technology Vol．6，1321-1325(1988))が記述するように金属キレーターカラムを通して精製することができる。ＭＰ５２HisおよびＭＰ５２ｍを逆相HPLCによりさらに精製した。逆相カラム(Nucleosil 300-7C4，Macher ey-Nagel製、カタログ番号 715023)を流速 2 ml/分で、そして100分間で０〜90% の0.1% TFA中のアセトニトリル勾配を用いた。単量体ＭＰ５２HisおよびＭＰ５２ｍは、これらの条件下でアセトニトリル約35% で溶出し始める。これがＭＰ５２タンパク質であるという検査を、各場合につき、ＭＰ５２特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析により実施した。ＭＰ５２ｍ（121 アミノ酸）またはＭＰ５２His（129アミノ酸）は、銀染色後に図１に見られるように、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル(15%)中でそれぞれ約14 kD（理論分子量： 13.7 kD）および15 kD(理論分子量: 14.8 kD)の見かけの分子量を示す。生物学的に活性な物質を得るため、大腸菌中で発現させて精製した単量体ＭＰ５２を再生して、二量体ＭＰ５２を形成することができる。これは、例えばJaen icke，R.およびRudolph，R．(Protein Structure、Creighton T.E.編、IRL Pres s,第９章(1989))に記述されているような当業者に公知の方法にしたがって実施することができる。各タンパク質について再生条件はそれぞれ変わるので、再生の際のタンパク質ＭＰ５２HisおよびＭＰ５２ｍのための条件を可溶化、pH値、温度およびレドックス系に関して試験した。尿素および塩化グアニジニウム等の典型的試薬が精製し凍結乾燥したＭＰ５２タンパク質の可溶化に適することが判明した。これらのタンパク質は、好ましくは、１mlあたり2.6 mgのＭＰ５２His またはＭＰ５２ｍという最終濃度で可溶化緩衝液(6 M 塩化グアニジニウム、10 mM Tris、150 mM NaCl、3 mM DTT pH 8.0)中で室温で２時間可溶化される。次に、可溶化物を好ましくは1 mlあたり150〜200 μgのＭＰ５２HisまたはＭＰ５２ｍという最終濃度で再生緩衝液に添加した。再生のためには、高いpH範囲(pH 8〜10)を用いて活性ＭＰ５２二量体タンパク質に再生するのが好都合であることが判明した。これに関連して、1〜2 MのNaCl およびEDTA(2〜10 mM)、Chaps(15〜50 mM)等の添加物を含むホスフェートまたは Tris緩衝液等の通常の緩衝液系を使用することができる。酸化および還元グルタチオン（例： 1 mM GSSG，2 mM GSH）等の一般のレドックス系を文献に記述されるように使用することができる(例：Jaenicke，R.およびRudolph，R.，Protein Structure，Creighton T.E.編、IRL Press、第９章(1989))。再生は、４℃から室温の範囲で、例えば48時間かけて、効果的に実施することができる。このような条件下で、50〜90% のＭＰ５２タンパク質を二量体形に変換することが可能である。上記条件は一例と見なされるべきであって、限定的なものではない。個々の条件を変えることにより、当業者は類似の効率でＭＰ５２を活性な二量体タンパク質に変換することができる。再生したタンパク質の分析を、逆相HPLCにより、および銀染色ゲルを用いて実施した。HPLCについては、ＭＰ５２タンパク質を 35% 緩衝液Ｂ(緩衝液Ａ：水に溶解した0.1% TFA；緩衝液Ｂ：90%アセトニトリル、0.1% TFA)で流速 0.2 ml/分でカラム(Aquapore RP-300，7 μm，Applied Bios ystems)に結合させた。単量体および二量体ＭＰ５２タンパク質を、50分間に35 〜60% 緩衝液Ｂのアセトニトリル勾配を用いて相互に分離することができる（図２参照）。再生されるＭＰ５２HisおよびＭＰ５２ｍの割合は約70〜90% と推定される。15% ポリアクリルアミドゲル中で、二量体ＭＰ５２ｍは分子量マーカーから推定される約22 kD(理論分子量：27.4 kD)に、そしてＭＰ５２Hisは約24 kD (理論分子量：29.6 kD)に移動する（図１参照）。この場合、ヒスチジンタグは再生効率に何ら重要な影響を及ぼさない。例えばWO 95/04819 に開示されているようにROB-C26 細胞を用いてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することにより両タンパク質の活性を試験する場合、Ｎ末端の修飾にもかかわらずＭＰ５２Hisは活性であるが、ＭＰ５２ｍに比べるとその活性は少し減少していることが分かる。実施例３ドーパミン作動性ニューロンに対するＭＰ５２の影響ドーパミン作動性ニューロンに対するＭＰ５２の影響を試験するため、Shimod aら(Brain Res．586，319-331 1992))が記述する方法に従って、14日齢ラット胚（Ｅ１４）の中脳の基底よりニューロンを単離した。細胞を分離し、Krieglstei nら(Neuroscience 63，1189-1196(1994))が記述するように培養した。細胞密度は、ポリオルニチン／ラミニン被覆カバーグラス上で、200,000細胞／cm²である。24時間培養した後、３日ごとに培地の２／３(500 μl)を除去し、適切な添加物を含む新鮮な培地と交換した。ヘパリン-Sepharoseおよび逆相HPLCで処理した後の、部分精製した凍結乾燥ＭＰ５２を50% アセトニトリルに溶解し、これに培地を加えた。同じことを再生し、精製したＭＰ５２Hisについても実施した。培地中のＭＰ５２およびＭＰ５２Hisの最終濃度は20 ng/mlである(アセトニトリルの最終濃度は0.3%)。50% アセトニトリルに溶解した同等量の精製単量体ＭＰ５２Hisを対照として用いた。培地対照もまた0.3%アセトニトリルを含有する。８日後、培養物を4%パラホルムアルデヒド中に10分間室温で固定し、アセトンを用いて細胞を透過性とし(10分、-20℃)、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄した。ＰＢＳ中で1% H₂O₂を用いて処理し、洗浄し、そしてウマ血清を用いてブロックした後、細胞を免疫細胞化学的に染色した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）はドーパミンおよび他のカテコールアミン類の生合成における限界酵素 (limiting enzyme)なので、ＴＨは本培養物（ノルアドレナリンを含む細胞を単離していない）中におけるドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして用いることができる。ＴＨは、ラットＴＨに対するマウスモノクローナル抗体(1:200に希釈、Boehringer Mannheim)を用いた37℃での１時間のインキュベーション、およびその後のVectastain ABCキット(Vecto Labs)を用いた検出により検出した。ＴＨ陽性細胞を0.12 cm²の面積にわたってカウントした。ＧＦＡＰ（グリア繊維酸性タンパク質）の免疫細胞化学的染色については、固定した細胞をアセトンを用いて透過性にし（20分、20℃）、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄した。1:200に希釈したＧＦＡＰに対するマウスモノクローナル抗体(Sigma)を用いてインキュベーションした後、それらの細胞を上記マウスモノクローナル抗体に対するペルオキシダーゼ結合抗体と共にインキュベートした。標準的方法に従って酵素基質ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）の添加により可視化を実施した。実施例４脳および脊髄におけるＭＰ５２の転写の調査ＭＰ５２が脳または／および脊髄において転写されるかどうかを確定するため、ラット脊髄由来の全ＲＮＡおよびマウス全脳または脳の各領域由来の全ＲＮＡを標準的方法に従って単離し、そして当業者に公知の方法によりｃＤＮＡに逆転写した。各場合において100 ngのＲＮＡから得たｃＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）に用いた。増幅に用いたプライマー（CAACAGCAGCGTGA AGTTGGAG および ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG）は、ヒトゲノムＤＮＡの場合は異なるエキソン上に位置しているので、ゲノムＤＮＡをｃＤＮＡから区別し得る。これもまたｃＤＮＡのようにＰＣＲ断片を生じない0.5 μgのマウスゲノムＤＮＡを対照として用いた。ＰＣＲは、50μl の反応混合物〔200 μM の各NTP、30 pmolの各プライマー、16.6 mM(NH₄)₂SO₄、67 mM Tris/HCl pH 8.8、2 mM MgCl₂ 、6.7 μM EDTA、10 mM β-メルカプトエタノール、170 μg/ml BSA、5 U Ampli Taq(Perkin Elmer #N8080160)〕中でそれぞれ30サイクル(94℃、54℃、72℃)実施した。ＰＣＲ産物の１／３を4%アガロースゲルを用いて分離し、サザンブロッティングにより膜に転写し、そしてＭＰ５２プローブとのハイブリダイゼーションによりＰＣＲ断片の特異性を確認した。ＭＰ５２は脊髄および脳の各領域で転写されることが示された。実施例５ＭＰ１２１の真核細胞による発現および精製実施例１においてＭＰ５２のために用いたように、ＭＰ１２１の発現のためにワクシニアウイルスを選択した。ＭＰ１２１の完全なコード領域を含むｃＤＮＡをベクターpBP1中にクローン化し（得られたプラスミドpBP1MP121 は1995年1 月 12日に寄託番号9665のもとにＤＳＭに寄託された）、組換えワクシニアウイルスを作製するために用いた。NIH-3T3 細胞（DSM ACC 59，スイスマウス胚）等の細胞が該組換えウイルスに感染すると、ＭＰ１２１が発現される。各工程はWO 96/ 01316 に詳細に開示されている。発現実験の途中で、他の細胞系もまた試験した。この場合、驚くべきことに、幾つかの細胞系においては二量体ＭＰ１２１に加えて相当の量の単量体ＭＰ１２１が形成されることが判明した。この単量体はポリアクリルアミドゲルを用いて分析し（次にウエスタンブロット分析により検出する）と、二量体の還元によって得た単量体よりも速く移動するので、これは球状構造を有する折り畳まれた単量体ＭＰ１２１であるに違いない。図５にHepG2 細胞(肝細胞ガン、ヒト、ATCC HB8065)におけるＭＰ１２１の発現を一例として示す。他方、ノーザンブロット分析によりＭＰ１２１がHepG2（肝臓由来の肝細胞細胞系）において天然に発現されることが示されたので、ＭＰ１２１の単量体形もまた生理学的に重要であることが推定できる。単量体ＭＰ１２１は、例えば Mv1Lu(NBL-7、肺、ミンク、ATCC CCL 64)またはHeLa（上皮ガン、ヒト頸、ATCC CCL 2）においても、二量体ＭＰ１２１に加えて相当な量で現われる。昆虫幼虫(トリコプルジア・ニ、Trichoplusia ni)中におけるバキュロウイルス系を用いたＭＰ１２１の発現実験においては、二量体形が血リンパ中に見いだされた。細胞培養物上清からのＭＰ１２１の部分精製は、WO 96/01316 に記述されるようにフェニル-Sepharoseおよび逆相HPLCにより実施した。野生型ウイルス(wt)を用いて感染させた後の細胞培養物上清の対応する量を対照とし、平行して同じ工程を用いて処理した。精製の向上のための実験においては、改変された勾配スロープと組み合わせた、TFA（トリフルオロ酢酸）またはHFBA（ヘプタフルオロ酪酸）を含有する移動溶媒の交互の使用が、ＭＰ１２１の精製の度合いを有意に増大させうることが示された。このためには、例えば先ずカラム(Aquapore RP-300 、Applied Biosystems，粒子径: 7 μm)を移動溶媒中の0.1% TFA（１分あたり1. 36% アセトニトリル）を用いて流速0.2 ml/分で溶出し、次にカラムを移動溶媒中の0.2% HFBA(１分あたり0.23% アセトニトリル)を用いて溶出し、最後にカラムを移動溶媒中の0.1% TFA（１分あたり0.23% アセトニトリル）を用いて再度溶出した。各ランの後、ＭＰ１２１を含む溶出画分を混合し、凍結乾燥し、そして次に新しいカラムに適用するために0.1% TFA/H₂O中に再懸濁した。最後に、凍結乾燥したサンプルを使用時まで-70℃で保存した。ウエスタンブロット分析を用いて量を推定し、ＭＰ５２と同様に大腸菌中で、しかし菌株はHMS 174 株（ＤＥ３）(Novagen #69453)を用いて調製したＭＰ１２１ｍ（配列番号２のアミノ酸23 7 から352、Ｎ末端に１個の付加的メチオニンを有する）と比較した。標準的方法に従って封入体からの精製を実施した。封入体を20 mM Tris(pH8.0)中の2 M塩化グアニジニウム/HClを用いて洗浄し（超音波処理による）、そして20 mM Tris (pH 8.0)中の6 M 塩化グアニジニウム/HClに再懸濁し、次に標準的方法により逆相HPLCで精製した。実施例６網膜のニューロンに及ぼすＭＰ５２およびＭＰ１２１の影響異なる系におけるＭＰ５２およびＭＰ１２１の影響を調べるため、ニワトリ胚の網膜から組織培養物を単離した。ほぼ同じサイズのディスク形組織サンプルを網膜から単離する方法は、Carri，N.G.およびEbendal，T．(Dev．Brain Res.，V ol．6(1983)，219-229)、Carri，N.G.およびEbendal，T．(Anat．Rec.，Vol．21 4(1986)，p．226-229)およびCarri，N.G.ら(J．Neurosci．Res．Vol．19(1988) ，p．428-439)に詳細に記述されている。これらの実験においては、コラーゲンマトリックスを用いて胚網膜外植片からの神経繊維の成長の刺激をin vitroで測定した。すなわち、ニワトリ胚（白色レグホン、胚発生の６日目）の網膜からガラス毛細管を用いて組織の一部を採取し、網膜の色素上皮を繰り返し洗浄することにより間葉細胞を除去した。このように処理した組織粒子を、コラーゲンで被覆した培養皿に移し、一晩インキュベートした（37.5℃、5%ＣＯ₂）。次に、適切な因子または対照を加え、培養物をさらにインキュベートした。実施例２に記載の二量体ＭＰ５２ｍをＭＰ５２として種々の濃度で用いた。その時までどの実験においても全く活性を示さなかった単量体ＭＰ５２を陰性対照として適切な濃度で使用した。ＭＰ１２１としては、実施例５に記載の部分精製物を種々の濃度でフェニル-Sepharoseおよび逆相HPLC後に使用した。野生型ウイルスの感染後に単離された物質を対照として用いた。独立対照として、外植片を少量のウシ血清アルブミンを含む培養培地中に保持した。タンパク質を水性緩衝液または50% アセトニトリルに溶解し、さらに培養培地で最終濃度1.25 ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ mlに希釈した。溶解の種類は結果に何ら影響を及ぼさなかった。培養の４日後に、顕微鏡の暗野において主要な神経繊維の最大の長さを測定した。表１および２に示すように、ＭＰ５２およびＭＰ１２１は用量依存性に軸索の成長を刺激する。ＭＰ５２は25〜100 ng/mlの範囲で最大の活性を有し、ＭＰ１２１は約25 ng/mlで最大の活性を示す。これは実際の繊維長1.3〜1.7 mm、または1.7 mmに対応し、陰性対照の0.2 mmに比較される。単量体ＭＰ５２および野生型対照は、陰性対照を上回る刺激を何ら示さなかった。表１：種々の濃度のＭＰ５２の影響下で４日培養した後の網膜軸索の長さ。培養培地のみを含有する対照の軸索の長さは 5.5/8/10/11/4.8/7 単位で、平均は7.7 単位(SEM 1.0)であった。単量体ＭＰ５２ｍ（二量体ＭＰ５２ｍと等しい濃度）を含有する対照の軸索の長さは、平均で、培養培地のみを含有する対照のそれと同じ長さであった。１単位は、培養皿における実際の長さ0.03 mm に相当する。表２：種々の濃度のＭＰ１２１の影響下で４日培養した後の網膜軸索の長さ。平行して精製された、野生型感染由来の細胞培養物上清を含有する対照の軸索の長さは、平均で、培養培地のみを含有する対照のそれと同じ長さであった（表１の説明文参照）。１単位は、培養皿における実際の長さ0.03 mm に相当する。図の詳細な説明：図１：0.2 μgのＭＰ５２His（レーン２および４）または0.2 μg のＭＰ５２ｍ（レーン３および５）を含む銀染色した15% ポリアクリルアミドゲル。レーン２および３は単量体形のタンパク質を精製した後のもので、レーン４および５は活性な二量体タンパク質に再生し、HPLCにより残留単量体を分離した後のもの。レーン１の分子量マーカー(15 kD，25 kD，35 kD，50 kD，75 kD，100 kD，150 kD )はNo.vagen製(#69149-1)である。図２：このクロマトグラムは、可溶化単量体ＭＰ５２His（…）の移動特性、および再生後、逆相HPLCを用いた二量体ＭＰ５２Hisの残留単量体形からの分離（ ―）を示す。二量体ＭＰ５２Hisは選択条件下では単量体形よりも早く溶出する。アセトニトリル勾配を％緩衝液Ｂに関連して示す。図３：ラット胚（Ｅ１４）中脳から単離し、８日間培養後に生存するＴＨ免疫反応性ドーパミン作動性ニューロンの数。非処理ニューロンを有する対照（0.3% アセトニトリルを含む培地）を除いては、20 ng/mlの大腸菌発現由来の精製単量体ＭＰ５２His（ＭＰ５２His単量体）、20 ng/mlの大腸菌発現由来の二量体タンパク質へ再生後の精製ＭＰ５２His（ＭＰ５２His二量体）、および 20 ng/mlおよび2 ng/ml のワクシニアウイルスによる発現由来の部分精製ＭＰ５２（ＭＰ５２）の添加による効果を示している。３回の測定から得られた平均値 ±ＳＥＭを示す。図４：ラット胚（Ｅ１４）中脳から単離し、８日間培養し、ＧＦＡＰ（グリア繊維酸性タンパク質）を染色した後の細胞の写真。これらの写真は、20 ng/mlの大腸菌発現由来の精製単量体ＭＰ５２His（Ａ）、20 ng/mlの大腸菌発現由来の、再生後の精製二量体ＭＰ５２His（Ｂ）、非処理細胞（Ｃ、対照として0.3%アセトニトリルを含む培地）、20 ng/ml（Ｄ）および2 ng/ml（Ｅ）のワクシニアウイルスによる発現由来の部分精製ＭＰ５２、および2 ng/mlのＴＧＦ−β ３（Ｆ）の効果を示す。各場合において、代表的な部分を顕微鏡(Axiophot)を用いて干渉コントラストで400倍の拡大率で撮影した。線（―）の長さは25μm に相当する。図５：ＭＰ１２１に対するウサギ抗体を用いたウエスタンブロット１：非還元条件下における、組換えワクシニアウイルス（挿入されたＭＰ１２１ｃＤＮＡを有する）に感染後のHep-G2細胞の細胞培養物上清２：非還元条件下における、野生型ワクシニアウイルスに感染後のHep-G2 細胞の細胞培養物上清３：見かけの分子量15.5/18.2/27.8/43.8/71.5 kD を有する、あらかじめ染色した分子量マーカー（図式的に示されている）（Gibco BRL # 26041-020）４：還元条件下における、組換えワクシニアウイルス（挿入されたＭＰ１２１ｃＤＮＡを有する）に感染後のHep-G2細胞の細胞培養物上清５：還元条件下における、野生型ワクシニアウイルスに感染後のHep-G2細胞の細胞培養物上清図６：組織培養４日後のニワトリ胚網膜からの神経繊維の成長。生きている培養物の暗野における顕微鏡写真。Ａ：大腸菌の封入体より精製した単量体ＭＰ５２ｍ（5 ng/ml）Ｂ：大腸菌の封入体より精製し、天然の二量体タンパク質に再生した二量体ＭＰ５２ｍ（5 ng/ml）Ｃ：NIH3T3細胞を用いてワクシニアウイルス系を介して発現させた後の細胞培養物上清由来の精製ＭＰ１２１（5 ng/ml）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 ＡＤＤＡ６１Ｋ 37/24 ＡＢＮＡＤＵＡＢＥＡＤＺＡＤＺＣ０７Ｋ 14/495 ＡＤＤ 19/00 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＬ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベクトルド，ロルフドイツ連邦共和国ディー−69126 ヘイデルバーグ，カール−ツックメイヤー−シュトラーセ 21 (72)発明者パウリスタ，ミヒャエルドイツ連邦共和国ディー−69181 レイメン，ヴィンガーシュトラーセ 10 (72)発明者ユンシッカー，クラウスドイツ連邦共和国ディー−69118 ヘイデルバーグ，コープフェルヴェグ 54

Claims

【特許請求の範囲】１．神経系疾患の治療または／および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための、生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１の使用。２．眼疾患、特に網膜のニューロン層、角膜および視神経の疾患、または／および他の脳神経の疾患の治療または予防のための、請求項１に記載の使用。３．生物学的に活性なＭＰ５２として以下のものを用いる、請求項１または２に記載の使用：（ａ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。４．生物学的に活性なＭＰ１２１として以下のものを用いる、請求項１または２に記載の使用：（ａ）配列番号３または４に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。５．生物学的に活性なＭＰ５２若しくはＭＰ１２１またはそれらの部分、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質またはその部分からなる融合タンパク質を用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。６．生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１として、生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質の単量体からなるヘテロ二量体を用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。７．天然に存在するガングリオシド、またはその誘導体、塩若しくは人工的類似体をさらに投与する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。８．シスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来のタンパク質をさらに投与する、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。９．シスチンノットモチーフを有するスーパーファミリー由来のタンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＮＧＦ／ニューロトロフィンファミリーまたはＰＤＧＦファミリー由来のタンパク質である、請求項５、６または８のいずれか１項に記載の使用。 10．前記タンパク質がＴＧＦ−β、ＢＭＰ、アクチビン、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５タンパク質である、請求項９に記載の使用。 11．ＦＧＦ、ＥＧＦまたはグリア増殖因子等の増殖因子をさらに投与する、請求項１〜10のいずれか１項に記載の使用。 12．投与が脳内に、経口的に、注射により、吸入により、または局所外用塗布として実施される、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。 13．神経系疾患の治療または／および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための薬剤の製造のための、生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１の使用。 14．眼疾患、特に網膜のニューロン層、角膜および視神経の疾患、または／および他の脳神経の疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項13に記載の使用。 15．生物学的に活性なＭＰ５２として以下のものを用いる、請求項13または14に記載の使用：（ａ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。 16．生物学的に活性なＭＰ１２１として以下のものを用いる、請求項13または14 に記載の使用：（ａ）配列番号３または４に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。 17．生物学的に活性なＭＰ５２若しくはＭＰ１２１またはそれらの部分、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質またはその部分からなる融合タンパク質を用いる、請求項13〜16のいずれか１項に記載の使用。 18．生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１として、生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質の単量体からなるヘテロ二量体を用いる、請求項13〜16のいずれか１項に記載の使用。 19．天然に存在するガングリオシド、またはその誘導体、塩若しくは人工的類似体をさらに添加する、請求項13〜18のいずれか１項に記載の使用。 20．シスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来のタンパク質をさらに添加する、請求項13〜19のいずれか１項に記載の使用。 21．シスチンノットモチーフを有するスーパーファミリー由来のタンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＮＧＦ／ニューロトロフィンファミリーまたはＰＤＧＦファミリー由来のタンパク質である、請求項17、18または20のいずれか１項に記載の使用。 22．前記タンパク質がＴＧＦ−β、ＢＭＰ、アクチビン、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５タンパク質である、請求項21に記載の使用。 23．ＦＧＦ、ＥＧＦまたはグリア増殖因子等の増殖因子をさらに投与する、請求項13〜22のいずれか１項に記載の使用。 24．投与が脳内に、経口的に、注射により、吸入により、または局所外用塗布として実施される、請求項13〜23のいずれか１項に記載の使用。 25．配列番号１に示すＭＰ５２の配列の成熟部分の少なくとも一部、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質。 26．以下のものを含む、請求項25に記載の融合タンパク質：（ａ）配列番号１由来の完全な成熟タンパク質部分および場合により配列番号１に示すタンパク質配列のさらなる機能性部分；（ｂ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分であるが、好ましくはメチオニンが正面に位置する修飾されたＮ末端を有するもの；または（ｃ）他の脊椎動物に由来するその起源のために相違を有するが、本質的に同一の活性を保持する、配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分またはその一部。 27．単量体として配列番号１に示す成熟ＭＰ５２タンパク質の配列の少なくとも一部、および第２の単量体としてシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質。 28．以下のものを含む、請求項27に記載のヘテロ二量体タンパク質：（ａ）配列番号１由来の完全な成熟タンパク質部分および場合により配列番号１に示すタンパク質配列のさらなる機能性部分；（ｂ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分であるが、好ましくはメチオニンが正面に位置する修飾されたＮ末端を有するもの；または（ｃ）他の脊椎動物に由来するその起源のために相違を有するが、本質的に同一の活性を保持する、配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分またはその一部。 29．有効成分として生物学的に活性なＭＰ５２または／およびＭＰ１２１を含有する、神経系疾患の治療または／および予防のための、または／および神経系の老化によって引き起こされる神経病理学的状態の治療のための薬剤。 30．眼疾患、特に網膜のニューロン層、角膜および視神経の疾患、または／および他の脳神経の疾患の治療または予防のための、請求項29に記載の薬剤。 31．生物学的に活性なＭＰ５２として以下のものを含む、請求項29または30に記載の薬剤：（ａ）配列番号１に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。 32．生物学的に活性なＭＰ１２１として以下のものを含む、請求項29または30に記載の薬剤：（ａ）配列番号３または４に示すタンパク質配列の成熟部分および場合によりさらなる機能性部分；（ｂ）本質的に同一の活性を有する、上記成熟タンパク質の部分；（ｃ）本質的に同一の活性を有する、修飾されたＮ末端を有する成熟タンパク質；（ｄ）他の脊椎動物に由来するその起源のために異なるアミノ酸配列を有するが、本質的に同一の活性を保持する成熟タンパク質またはその部分。 33．生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１またはそれらの部分、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質またはその部分からなる融合タンパク質を含む、請求項29〜32のいずれか１項に記載の薬剤。 34．生物学的に活性なＭＰ５２またはＭＰ１２１、およびシスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来の別なタンパク質の単量体からなるヘテロ二量体を含む、請求項29〜32のいずれか１項に記載の薬剤。 35．天然に存在するガングリオシド、またはその誘導体、塩若しくは人工的類似体をさらに含む、請求項29〜34のいずれか１項に記載の薬剤。 36．場合により適切な担体物質、補助剤、希釈剤または賦形剤が添加されている、請求項29〜35のいずれか１項に記載の薬剤。 37．シスチンノットモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリー由来のタンパク質をさらに含む、請求項29〜36のいずれか１項に記載の薬剤。 38．シスチンノットモチーフを有するスーパーファミリー由来のタンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＮＧＦ／ニューロトロフィンファミリーまたはＰＤＧＦファミリー由来のタンパク質である、請求項33、34または37のいずれか１項に記載の薬剤。 39．前記タンパク質がＴＧＦ−β、ＢＭＰ、アクチビン、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５タンパク質である、請求項38に記載の薬剤。 40．ＦＧＦ、ＥＧＦまたはグリア増殖因子等の増殖因子をさらに含む、請求項29 〜39のいずれか１項に記載の薬剤。 41．脳内投与、経口投与、局所外用塗布、または注射若しくは吸入による投与のために製剤される、請求項29〜39のいずれか１項に記載の薬剤。