ES2389624T3 - Uso de MP52 o MP121 para el tratamiento y prevención de enfermedades del sistema nervioso - Google Patents
Uso de MP52 o MP121 para el tratamiento y prevención de enfermedades del sistema nervioso Download PDFInfo
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Abstract
Uso de MP52 biológicamente activa para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o prevención detrastornos o pérdidas de funciones nerviosas, provocadas por estados patológicos agudos o crónicos y/o para eltratamiento de situaciones neuropatológicas que son provocadas por la alteración del sistema nervioso, utilizándoseen calidad de MP52 biológicamente activa(a) la porción madura y, eventualmente, otras porciones funcionales de la secuencia de proteínas mostrada enSEQ ID NO. 1;(b) partes de la proteína madura que presentan esencialmente la misma actividad;(c) proteínas maduras con un extremo N modificado que presentan la misma actividad;(d) una proteína madura o partes de la misma, la cual, en virtud de su procedencia de otros vertebrados,presenta una variación en la secuencia de aminoácidos, pero conserva la misma actividad.
Description
Uso de MP52 o MP121 para el tratamiento y prevención de enfermedades del sistema nervioso
La presente invención se refiere al uso de MP52 y/o MP121, dos factores de crecimiento y/o diferenciación de la superfamilia de TGF-�, para el tratamiento y la prevención de enfermedades del sistema nervioso y/o para el tratamiento de situaciones neuropatológicas que son provocadas por la alteración del sistema nervioso. Además de ello, la invención se refiere a medicamentos para el tratamiento o la prevención de las indicaciones anteriores que contienen MP52 y/o M P121.
Muchos factores de crecimiento de la superfamilia de TGF-� (Kingsley, Genes & Development 8, 133-146 (1994) y la bibliografía citada en la misma) son relevantes para una amplia gama de métodos de tratamientos médicos y aplicaciones que conciernen, en particular, a la cicatrización y a la regeneración de tejido. A estos pertenecen, en particular, miembros del TGF-� (factor de crecimiento y transformación, véase, p. ej., Roberts y Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), págs. 419-432, comps. Sporn y Roberts), de la BMP (proteína morfogenética del hueso, véase, p. ej., Rosen y Thies, Growth Factors in Perinatal Development (1993), págs. 39-58, comps. Tsang, Lemons y Balistreri) y la inhibina/activina (véase, p. ej., Vale et al., The Physiology of Reproduction, Segunda Edición, (1994), págs. 1861-1878, comps. Knobil y Neill). A pesar de que los miembros de esta familia presentan en la porción madura elevadas homologías de aminoácidos, en particular la mayoría de las veces 7 cisteínas conservadas, muestran considerables variaciones en sus funciones precisas. Las proteínas similares a TGF-� pertenecen a una superfamilia estructural, todas las cuales presentan un motivo nudo cistina (Cell, Vol. 73 (1993), págs. 421-424). Otros miembros de esta superfamilia son proteínas de la familia NGF (factor de crecimiento nervioso) – familia de neurotrofina y PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas). A menudo, factores de crecimiento individuales muestran varias funciones al mismo tiempo, de modo que su aplicación es de interés en el caso de distintas indicaciones médicas.
Algunas de estas proteínas multifuncionales muestran, junto a funciones tales como, p. ej., la regulación de la proliferación y diferenciación en el caso de muchos tipos de células (Roberts y Sporn, Handbook of Experimental, Pharmacology 95 (1990), pág. 419-472, comps. Sporn y Roberts; Sakurai et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), págs. 14118-14122) también efectos fomentadores de la supervivencia en el caso de neuronas. Así, p. ej. para TGF-� se detectaron in vitro efectos tróficos en neuronas motoras y sensoriales embrionales (Martinou et al., Devl. Brain Res. 52, págs. 175-181 (1990) y Chalazonitis et al., Dev. Biol. 152, págs. 121-132 (1992)). Además, para las proteínas TGF-�-1, -2, -3, activina A y GDNF (factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales), una proteína que presenta similitudes estructurales con miembros de la superfamilia de TGF-�, se detectaron efectos fomentadores de la supervivencia en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, no siendo inducido este efecto a través de astrocitos (Krieglstein et al., EMBO J. 14, págs. 736-742 (1995)).
Los documentos WO 93/16099, WO 95/04819 y WO 96/01316 dan a conocer las secuencias de ADN y proteínas de proteínas similares a TGF-�, en particular de MP52 y MP121. En el documento WO 95/04819 se da a conocer un potencial inductor del cartílago y los huesos para MP52.
La aparición de proteínas de la superfamilia de TGF-� en diferentes fases de tejido y fases de desarrollo está en coincidencia con diferencias en relación con funciones más precisas, así como sitios diana, duración de vida, requisitos para factores auxiliares, entornos fisiológicos celulares necesarios y/o estabilidad frente a la degradación.
La misión en la que se basa la presente invención consiste en habilitar una proteína que posibilite un tratamiento o prevención de enfermedades del sistema nervioso. De interés son el tratamiento de trastornos o pérdidas de funciones nerviosas. Estas pueden provocarse por estados patológicos agudos tales como deficiencias cerebrovasculares, inflamatorias, infecciosas, metaboloides y/o deficiencias provocadas por influencias tóxicas, lesiones, desarrollo de tumores o intervenciones quirúrgicas. Además, trastornos o pérdidas de funciones nerviosas pueden ser provocadas por estados patológicos crónicos tales como, preferiblemente, enfermedades neurodegenerativas. Situaciones neuropatológicas son provocadas a menudo también por la alteración del sistema nervioso.
Este problema se resuelve mediante el uso de MP52 y/o MP121 biológicamente activa para el tratamiento y/o prevención de enfermedades del sistema nervioso y/o para el tratamiento de situaciones neuropatológicas que son provocadas por la alteración del sistema nervioso.
Con la presente invención pudo demostrarse que MP52 presenta una influencia positiva sobre la supervivencia de neuronas dopaminérgicas (véase la Figura 3). Sin embargo, esta influencia es inducida, apartándose de TGF-�spyp activina A, al menos en parte, a través de los astrocitos asociados con células nerviosas (véase la Figura 4). Por consiguiente, MP52 es útil en el tratamiento o prevención de enfermedades del sistema nervioso, en particular enfermedades que afectan al cerebro. En tal caso son de particular interés enfermedades neurodegenerativas tales como, p. ej., la enfermedad de Parkinson, posiblemente también enfermedades tales como Alzheimer o la enfermedad de Huntington. Además de ello, utilizando MP52 se consigue fomentar la supervivencia de neuronas y, con ello, determinar una conservación de funciones nerviosas. Todas las posibilidades de aplicación se mantienen tanto en el caso de estados patológicos agudos como también crónicos, también las medidas de prevención. Como estados patológicos agudos se han de mencionar en tal caso, preferiblemente, fenómenos de deficiencia cerebrovasculares, inflamatorios, infecciosos, metaboloides y/o deficiencias provocadas por influencias tóxicas, lesiones, desarrollos de tumores u operaciones quirúrgicas.
Un estado patológico crónico que puede ser tratado en el marco de la invención es, p. ej., una enfermedad neurodegenerativa.
Con la presente invención pudo demostrarse, además, que MP52 tiene una influencia estimulante también sobre neuronas de la retina. Durante el desarrollo del sistema visual, los axones procedentes de las células ganglionares de la retina migran a regiones especiales en el cerebro. Por parte de varios grupos pudo demostrarse que fracciones solubles que se aislaron de zonas visuales del cerebro, pueden estimular a las células ganglionares en la retina (Nurcombe, V. y Bennett, M.R., Exp. Brain Res. 44, 249-258 (1981), Hyndman, A.G., Adler, R., Dev. Neurosci. 5, 4053 (1982), Turner, J. E. et al., Dev. Brain Res. 6, 77-83 (1983), Carri, N.G. y Ebendal, T., Dev. Brain. Res. 6, 219-229 (1983)). La formación de haces de fibras nerviosas, que probablemente son axones ópticos que parten de células ganglionares de la retina, depende de factores neurotróficos.
Ensayos con MP52 demostraron que esta proteína puede actuar también en este sistema como un factor neurotrófico.
Así, cultivos de tejidos recientemente aislados de la retina embrionaria procedente de gallinas pudo demostrarse que MP52 fomenta de manera significativa el desarrollo de fibras nerviosas (véanse para ello la Figura 6 y la Tabla 1).
Durante estos experimentos pudo demostrarse también que otros miembros de la familia de TGF-�ptcenenprscmcsmop un efecto estimulante. A ellos pertenece, en particular, también la MP121 (documentos WO93/16099 y WO96/01316) que presenta un efecto aproximadamente de la misma intensidad que MP52 (véanse para ello la Figura 6 y la Tabla 2).
Las actividades de MP52 y MP121 pueden utilizarse para la curación de enfermedades en el ojo, en particular de la retina y del nervio óptico. Se han de destacar en este caso, en particular, también el tratamiento de lesiones de la capa neuronal de la retina y del nervio óptico. Lesiones de este tipo podrían ser provocadas, p. ej., por accidentes, inflamaciones o trastornos del riego sanguíneo. Son asimismo ventajosas aplicaciones en el caso de trasplantes de retina. Pero también, además, debería ser importante una curación o alivio de lesiones en otros nervios del cerebro. Se ha de destacar en este caso, p. ej. el trigémino (nervio trigémino) el cual inerva también partes del ojo. Así, miembros de la familia de TGF-� penparttculartpde la MP52 y de la MP121, pueden encontrar también aplicación en el caso de trasplantes de córnea. El crecimiento de la córnea es influenciado también por parte del suministro nerval. También es imaginable un empleo en el caso de sólo lesiones segmentales de la córnea tal como se manifiestan, p. ej., en el caso de infecciones por herpes en el ojo.
En particular, se ha de destacar el uso en el caso de enfermedades degenerativas de la superficie del ojo.
En una forma de realización preferida de la presente invención se utiliza como MP52 biológicamente activa
- (a)
- la porción madura y, eventualmente, otras porciones funcionales de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1;
- (b)
- partes de la proteína madura que presentan esencialmente la misma actividad;
- (c)
- proteínas maduras con un extremo N modificado que presentan en esencia la misma actividad;
- (d)
- una proteína madura o partes de la misma, la cual, en virtud de su procedencia de otros vertebrados, presenta una variación en la secuencia de aminoácidos, pero conserva esencialmente la misma actividad.
- (a)
- la porción madura y, eventualmente, otras porciones funcionales de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 3 ó 4;
- (b)
- partes de la proteína madura que presentan esencialmente la misma actividad;
- (c)
- proteínas maduras con un extremo N modificado que presentan en esencia la misma actividad;
- (d)
- una proteína madura o partes de la misma, la cual, en virtud de su procedencia de otros vertebrados, presenta una variación en la secuencia de aminoácidos, pero conserva esencialmente la misma actividad.
En otra forma de realización preferida, en calidad de MP121 biológicamente activa se utiliza Otras características y ventajas de la invención se desprenden de la descripción de las formas de realización preferidas y de las figuras. El protocolo de secuencias y las figuras se describen en lo que sigue brevemente.
SEQ ID NO. 1 muestra la secuencia completa de aminoácidos de la pre-pro-proteína de la proteína de TGFhumana MP52 que se derivó de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 2 y que ya se da a conocer en el documento WO 95/04819. El comienzo de la proteína madura se encuentra preferiblemente en el intervalo de los aminoácidos 361-400, de manera particularmente preferida en el aminoácido 382.
SEQ ID NO. 2 muestra la secuencia de nucleótidos completa del ADN que codifica la proteína de TGF-MP52, tal como se da a conocer ya en el documento WO 95/04819. El codón de inicio ATG comienza con el nucleótido 640. El comienzo de la proteína madura completa comienza de manera particularmente preferida detrás del nucleótido 1782. El codón de terminación comienza con el nucleótido 2143.
SEQ ID NO. 3 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la pre-pro-proteína de la proteína de TGFhumana MP121, que ya se da a conocer en el documento WO 96/01316. El comienzo de la proteína madura se encuentra preferiblemente en el intervalo de los aminoácidos 217-240, de manera particularmente preferida en el aminoácido 236 ó 237, de la forma más preferida, en el aminoácido 237.
SEQ ID NO. 4 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la pre-pro-proteína de la proteína de TGF-MP121 de ratón, que asimismo se da a conocer en el documento WO 96/01316. El comienzo de la proteína madura se encuentra, en analogía a la proteína humana, en el intervalo de los aminoácidos 217 -240, el comienzo de la proteína madura preferida en el aminoácido 236 ó 237.
La Figura 1 muestra un gel teñido con plata con MP52 madura, expresada en el sistema procariótico, con metionina antepuesta así como MP52 madura con un colgante de histidina en el extremo N delante y detrás del replegamiento.
La Figura 2 muestra un cromatograma para la separación de MP52 madura dímera y monómera con extremo Nmodificado detrás del replegamiento.
La Figura 3 muestra una influencia positiva sobre la supervivencia de neuronas dopaminérgicas mediante tratamiento con MP52 parcialmente purificada procedente de un sistema de expresión eucariótico, así como MP52 madura replegada y purificada con extremo N-modificado procedente de un sistema de expresión procariótico.
La Figura 4 muestra que el efecto fomentador de la supervivencia de MP52 sobre neuronas dopaminérgicas se ha de atribuir, al menos en parte, a un aumento del número de astrocitos.
La Figura 5 demuestra una transferencia Western con anticuerpos de conejo contra MP121, la cual se sintetizó con ayuda del sistema de expresión de virus vacuna en células HepG2.
La Figura 6 muestra la influencia estimulante de MP52 purificada y MP121 sobre el desarrollo de fibras nerviosas procedentes de la retina embrionaria.
En el marco de la presente invención, la porción madura de la proteína MP52 abarca desde el aminoácido 382 hasta el aminoácido 501. En el caso de MP121, la porción madura abarca preferiblemente desde el aminoácido 237 hasta el aminoácido 352 de la SEQ ID NO. 3 o bien de la SEQ ID NO. 4. Además de ello, sin embargo, en el marco de la invención están también incluidas eventualmente zonas parciales funcionales de la proteína completa más cortas o más largas que, en esencia, presentan la misma actividad biológica, en particular zonas parciales que comprenden al menos la zona de las siete cisteínas conservadas. En la presente invención pudo demostrarse, entre otros, que modificaciones en el extremo N de la proteína madura no afectan esencialmente a la actividad. Están comprendidas también proteínas MP52 o bien MP121 que se aíslan de otros vertebrados, dado que éstas presentan esencialmente las mismas actividades.
Por otra parte, junto a la porción madura de MP52 o MP121, las proteínas pueden comprender también, además, porciones de señal y/o de pro-péptidos funcionales de otras proteínas, p. ej. de proteínas con el motivo nudo cistina (Cell, Vol. 73 (1993), págs.. 421-424) y, en particular, de otras proteínas de la superfamilia de TGF-, p. ej. las proteínas de TGF o BMP o activina/inhibina arriba mencionadas, en particular también MP121 o bien MP52. Las secuencias de nucleótidos correspondientes se pueden deducir de las referencias arriba mencionadas y de la bibliografía citada en ellas y/o del banco de datos EMBL o de GenBank, a cuya divulgación se hace con ello referencia. En tal caso, es importante que se conserve el marco de lectura correcto para la proteína madura. En función del tipo de células hospedantes en el que tenga lugar la expresión, la presencia de otra secuencia señal y/o de otra porción de pro-péptido podría afectar positivamente a la expresión. El intercambio de porciones de propéptido por parte de correspondientes porciones de otras proteínas se describe, p. ej., en Mol. Endocrinol. 5 (1991), págs. 149-155 y Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), págs. 2905-2909.
Otra forma de realización preferida de la invención es el uso de proteínas de fusión que presentan derivados funcionales o bien porciones de MP52 o bien MP121 conforme a la definición anterior y tal y como se muestra preferiblemente en SEQ ID NO. 1 o bien 3 ó 4, en particular porciones funcionales de la proteína madura y, además de ello, porciones de otra proteína. La otra proteína puede ser en tal caso de nuevo una proteína con el “motivo nudo de cistina”, la cual pertenece también preferiblemente la superfamilia de TGF-�ptrapuomo pa pej ptrmbcén combinación de MP52 con MP121. Sin embargo, también pueden estar presentes porciones de una proteína completamente distinta, p. ej. dominios de proteínas que se unen al receptor que confieren a la proteína MP52 o bien MP121 original otra especificidad. Otra forma de realización de la invención preferida de nuevo es el uso de proteínas heterodímeras a base de un monómero de una MP52 o MP121 biológicamente activa conforme a la definición anterior y un monómero de una proteína de la superfamilia de las proteínas con el “motivo nudo de cistina”, preferiblemente de un miembro de la superfamilia de TGF-� pPtoteínas heterodímeras similares se describen, p. ej., en el documento WO 93/09229, el documento EP 0 626 451 A2 y J. Biol. Chem. 265 (1990), págs. 13198-13205. Las características de la proteína pueden variar en función de la formación de homodímeros o heterodímeros y pueden ser relevantes para aplicaciones terapéuticas.
La secuencia de ADN mostrada en SEQ ID NO. 2, partes de la misma o una secuencia que codifica proteínas quiméricas de acuerdo con la invención pueden utilizarse para la producción de MP52. La expresión puede tener lugar en células hospedantes eucariotas y procariotas. Sistemas de expresión adecuados son conocidos por el experto en la materia y es fácilmente determinable qué porción mínima de SEQ ID NO. 2 es necesaria con el fin de obtener una proteína expresada que muestre actividad en los ensayos indicados. A los sistemas de expresión pertenecen también sistemas de virus tales como, p. ej., el sistema de baculovirus o el sistema de virus vacuna. Para la producción de una cantidad suficiente de las proteínas de acuerdo con la invención purificadas, procedentes de la célula hospedante y/o del sobrenadante del cultivo celular, para empleo en el tratamiento médico puede utilizarse una bacteria tal como, por ejemplo, E. coli o Bacillus, un hongo tal como, por ejemplo, levadura, una célula vegetal tal como, por ejemplo, tabaco o Arabidopsis, o una línea animal de células de vertebrados tales como, por ejemplo, CHO, líneas de células HuTK, NIH-3T3, COS o Mo, o una línea de células de insectos tales como, por ejemplo, Spodoptera frugiperda (SF9) o Trichoplusia ni (TN368). Aprovechando virus de insectos recombinantes tales como,
p. ej., el virus de la polihedrosis nuclear Bombyx mori o baculovirus es posible una expresión también en larvas de insectos tales como, por ejemplo, Bombyx mori o Spodoptera frugiperda. Un sistema de este tipo se describe, p. ej., en Ishida et al. (J. Biochem. 115 (1994), págs. 279-285). En la producción en bacterias, la proteína de acuerdo con la invención puede presentarse en forma de cuerpos de inclusión (inclusion bodies). Estos cuerpos de inclusión se renatularizan según métodos en sí conocidos con el fin de obtener la proteína en una forma activa. Dentro de la invención pudo demostrarse que para la actividad es necesaria una renaturalización para formar MP52 dímera, dado que MP52 monómera no muestra actividad alguna (véase la Figura 3). Algo similar se cumple para la producción de MP121 que se describe con detalle en el documento WO 96/01316.
Para la producción de proteínas heterodímeras con otros miembros de la “familia de nudo cistina” los dos monómeros de proteínas se expresan en la misma célula o bien por separado, pareciendo adecuada también una renaturalización común en el caso de formas resultantes de cuerpos de inclusión. En la co-expresión en la misma célula son adecuados de nuevo, en particular, también sistemas virales tales como, p. ej., el sistema de baculovirus
o el sistema de virus vacuna. La producción y purificación de proteínas heterodímeras es, en principio, conocida por el experto en la materia y está descrita, p. ej., en el documento WO 93/09229 y el documento EP 0 626 451 A2. Los heterodímeros pueden separarse de homodímeros, p. ej. empleando sucesivamente columnas de afinidad con anticuerpos específicos para en cada caso un monómero.
La producción de proteínas quiméricas con otras porciones de proteínas requiere una modificación correspondiente en el plano del ADN que es habitual para el experto en la materia y que puede ser llevada a cabo por éste (EMBO J. 10 (1991), págs. 2105-2110; Cell 69 (1992) págs. 329-341; J. Neurosci. 39 (1994), págs. 195-210).
En otra forma de realización preferida, adicionalmente a MP52 y/o MP121 biológicamente activa, se administran en una de las formas arriba mencionadas, gangliósidos que se presentan de forma natural, sus derivados, sales o análogos sintéticos. Además, se prefiere administrar adicionalmente un factor de crecimiento. En tal caso, se trata preferiblemente de una proteína de la superfamilia de las proteínas con “motivo nudo de cistina”, tratándose preferiblemente de una proteína de la superfamilia de TGF-� pdeparpfrmcacrpdepNGF/neltottofcnrpopdeparpfrmcacrpdep PDGF. Son particularmente preferidos factores de crecimiento que pertenecen a la familia de NGF/neurotrofina tales como, p. ej., los factores de crecimiento NGF, BDNF, NT-3 o NT4/5 (véase también Guidebook to Cytokines and their Receptors, Nicos A., Nicola, A Sambrook and Tooze Publication, Oxford University Press, 1994, páginas 140143 y la bibliografía citada en ella). Otros factores de crecimiento preferidos son FGF, EGF y factor de crecimiento glial. Combinaciones de este tipo pueden conducir a efectos sinérgicos tal como se muestra, p. ej., para miembros de la superfamilia de TGF-�pOgararpetpra p� pBcoa pChem p267pO1992) p14233-14237 o documento US 5413989).
En la medida en que sea necesario o ventajoso, resulta natural para el experto en la materia agregar otros materiales de soporte, coadyuvantes, diluyentes o materiales de carga habituales en farmacia.
La administración de una composición con contenido en MP52 y/o MP121 se realiza convenientemente de modo que se alcance el mayor efecto posible, pudiendo ser ventajoso, en particular, su empleo cercano al sitio diana. La administración puede tener lugar, entre otros, por vía intracerebral, oral, mediante inyección, mediante inhalación o en forma de aplicación externa local.
Otro objeto de la presente invención es el uso de MP52 y/o MP121 biológicamente activa para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades del sistema nervioso y/o para el tratamiento de situaciones neuropatológicas que son provocadas por la alteración del sistema nervioso. Formas de realización y posibilidades de aplicación preferidas corresponden en tal caso a las formas de realización que ya se describieron en detalle para el objeto antes mencionado de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención es una proteína de fusión que contiene al menos partes de la porción madura de la secuencia de MP52 mostrada en SEQ ID NO. 1 así como al menos partes de otra proteína de la superfamilia de las proteínas con “motivo de nudo cistina”.
Una proteína de fusión de acuerdo con la invención de este tipo contiene preferiblemente
- (a)
- toda la porción de proteína madura de SEQ ID NO. 1 así como, eventualmente, otras porciones funcionales de las secuencias de proteínas mostradas en SEQ ID NO. 1;
- (b)
- la porción madura de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1, pero con extremo N modificado, preferiblemente una metionina antepuesta; o
- (c)
- la porción madura de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1 o partes de la misma que, en virtud de su procedencia de otros vertebrados, presenta variaciones, pero conserva esencialmente la misma actividad.
La producción de proteínas de fusión de este tipo ya se ha descrito arriba, igualmente proteínas adecuadas a modo de ejemplo a partir de las cuales puede derivarse la porción de proteína no MP52.
De nuevo, otro objeto de la presente invención es una proteína heterodímera que contiene al menos una parte de la secuencia de la proteína MP52 madura mostrada en SEQ ID NO. 1 en forma de un monómero, así como un segundo monómero de otra proteína procedente de la superfamilia de las proteínas con “motivo de nudo cistina”. También aquí se prefiere de nuevo que la porción de MP52 (el monómero de MP52) contenga
- (a)
- toda la porción de proteína madura de SEQ ID NO. 1 así como, eventualmente, otras porciones funcionales de las secuencias de proteínas mostradas en SEQ ID NO. 1;
- (b)
- la porción madura de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1, pero con extremo N modificado, preferiblemente una metionina antepuesta; o
- (c)
- la porción madura de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1 o parte de la misma que, en virtud de su procedencia de otros vertebrados, presenta variaciones, pero conserva esencialmente la misma actividad.
La producción de proteínas heterodímeras así como proteínas que se adecuan como segundo monómero ya se ha mencionado de nuevo arriba en la descripción.
Todavía otro objeto de la presente invención son medicamentos para el tratamiento y la prevención de enfermedades del sistema nervioso y/o para el tratamiento de situaciones neuropatológicas que son provocadas por la alteración del sistema nervioso y que contienen una cantidad biológicamente eficaz de MP52 y/o MP121 en calidad de principio activo. El medicamento de acuerdo con la invención contiene como MP52 biológicamente activo, preferiblemente
- (a)
- la porción madura y, eventualmente, otras porciones funcionales de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1;
- (b)
- partes de la proteína madura que presentan esencialmente la misma actividad;
- (c)
- proteínas maduras con un extremo N modificado que, en esencia, presentan la misma actividad;
- (d)
- una proteína madura o partes de la misma, la cual, en virtud de su origen de otros vertebrados, presenta una variación en la secuencia de aminoácidos, pero conserva esencialmente la misma actividad.
En una segunda forma preferida, el medicamento de acuerdo con la invención contiene en calidad de MP121 biológicamente activo
- (a)
- la porción madura y, eventualmente, otras porciones funcionales de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 3 ó 4;
- (b)
- partes de la proteína madura que presentan esencialmente la misma actividad;
- (c)
- proteínas maduras con un extremo N modificado que, en esencia, presentan la misma actividad;
- (d)
- una proteína madura o partes de la misma, la cual, en virtud de su origen de otros vertebrados, presenta una variación en la secuencia de aminoácidos, pero conserva esencialmente la misma actividad.
Las posibilidades de terapia de la proteína pueden variar en función de la formación de homodímeros o heterodímeros con otras proteínas con “motivo de nudo cistina” y, en particular, proteínas de TGF-�popNGF prsí como mediante el uso de proteínas quiméricas. Estructuras de este tipo pueden manifestarse asimismo adecuadas para aplicaciones clínicas y, por lo tanto, forman asimismo otro objeto de la presente invención.
Por consiguiente, también quedan incluidas composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas heterodímeras y/o proteínas de fusión de acuerdo con la invención. Puede ser ventajosa, en el caso de una composición farmacéutica, también la combinación de MP52 o MP121 con otras proteínas de la superfamilia de TGF-�ptraespuomop
p. ej., GDNF, las TGF-�s parspBMPspyparsprutcvcnrs, o con proteínas de la familia NGF/neurotrofina tales como, p. ej., la NGF, las neurotrofinas tales como, p. ej., NT-3, -4/5 o BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro) o también factores de crecimiento tales como FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), EGF (factor de crecimiento epidermal), factor de crecimiento glial, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas). Combinaciones de este tipo son asimismo objeto de la solicitud.
Eventualmente, una composición de acuerdo con la invención comprende, junto a los principios activos, sustancias de soporte, coadyuvantes, agentes diluyentes y/o materiales de carga farmacéuticamente aceptables.
Preferiblemente, una composición de este tipo puede comprender también gangliósidos que se presentan de forma natural, sus derivados, sales o análogos sintéticos.
Para el tratamiento o la prevención de enfermedades nerviosas pueden administrarse MP52 o MP121 mediante inyección, por vía oral, no oral, intracerebral, por inhalación, en forma de aplicación local externa o mediante cualesquiera otros métodos farmacéuticamente habituales. La dosis se encuentra en el intervalo de 0,1 a 1000 µg/kg de peso corporal.
Es imaginable una aplicación de MP52 y/o MP121 biológicamente activa o bien de proteínas heterodímeras y/o proteínas quiméricas de acuerdo con la invención p. ej., pero también a través de células madre embrionarias no humanas implantadas que previamente, mediante transfección de elementos de ADN adecuados, se llevaron a una expresión constitutiva de las proteínas de acuerdo con la invención, en particular de MP52 o MP121. Además, es posible una habilitación de las proteínas de acuerdo con la invención, en particular de MP52 o MP121 biológicamente activo por parte de determinados sistemas virales. Por consiguiente, es posible transfectar vectores adecuados con la secuencia de ADN de acuerdo con la invención in vitro o in vivo en células de pacientes o transfectar los vectores in vitro en células e implantar luego éstas a un paciente.
Además, la aplicación de esta composición farmacéutica no está limitada al hombre, sino que puede también comprender animales, en particular animales domésticos.
En general, con las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención pueden tratarse enfermedades del sistema nervioso que en una forma cualquiera están relacionadas con la expresión de MP52 o bien MP121 o que responden de alguna forma a MP52 o MP121, por una parte mediante el aumento de la cantidad o bien de la actividad de MP52
o MP121 existente, por otra parte, también mediante la supresión de la actividad de MP52 o bien MP121. Una supresión de la actividad de MP52 o bien MP121 puede tener lugar mediante la inhibición de la transcripción y/o de la traducción, p. ej. mediante ácidos nucleicos antisentidos conocidos por el experto en la materia. Otra posibilidad es la unión de moléculas a receptores de MP52 o MP121 que, en contraposición a MP52 o bien MP121, no desencadenan transmisión de señales alguna. Por lo tanto, en el marco de la invención son también de interés los receptores para MP52 o MP121 en células. Para la búsqueda de receptores pueden someterse a ensayo, en principio, diferentes líneas de células en cuanto a su comportamiento en la unión de MP52 o bien MP121 radiactivamente marcada (125I-MP52 o 125I-MP121) con subsiguiente reticulación. De células que unen MP52 o bien MP121 puede establecerse seguidamente una genoteca de ADNc en un vector de expresión (p. ej. adquirible de InVitrogen). Células que fueron transfectadas con ADNc receptor pueden entonces seleccionarse a través de la unión de MP52 o bien MP121 radiactivamente marcada. Estos son métodos conocidos por el experto en la materia tal como se utilizaron, p. ej., para el aislamiento de receptores de activina (Mathews, L.S. y Vale, W.W. Cell 65 (1991), págs. 973-982) y receptores de TGF-�pdeaptcaopIIpOLcnpetpra pCeaap68pO1992)paágs. 775 -785). Por analogía a los receptores de activina, TGF-�pypBMPpuonoucdospsephrpdepslaonetpenpeapursopdeapteueptor para MP52 y MP121 se trata asimismo de un complejo receptor perteneciente a esta familia, de modo que para el hallazgo de partes del complejo heterómero se pueden utilizar otros métodos conocidos por el experto en la materia tales como, p. ej., PCR con oligonucleótidos degenerados. Este método se ha aplicado, p. ej., también en el caso del receptor de activina de tipo I, receptores de TGF-�pdeptcaopI y receptores de BMP de tipo I (Tsuchida et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11242-11246; Attisano et al. (1993) Cell 75, 671-680; Franzén et al. (1993) Cell 75, 681-692; ten Dijke et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16985-16988; Koenig et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 5961-5974).
La invención se ha de explicar mediante los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1
Para la expresión de MP52 se eligieron virus vacuna, cuyo uso está ampliamente descrito y resulta repasable para el experto en la materia en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Wiley & Sons (1989-1995)), en lo que sigue abreviado CP, bajo el Capítulo 16, Unidad 16.15
16.18. El ADNc con toda la zona codificadora para MP52 fue clonado en el vector pBP1. El plásmido resultante (pBP1MP52s) se depositó en la DSM (número de depósito 9217) el 24 de mayo de 1994 y se empleó para la producción de virus vacuna recombinantes tal como se da a conocer en el documento WO 95/04819. La expresión de MP52 en células 143B (HuTk-, ATCC CRL 8303) después de la infección con virus vacuna recombinantes tuvo lugar tal como se describe en el documento WO 95/04819. La purificación parcial de MP52 tuvo lugar tal como se describe en la misma divulgación, a través de una columna de heparina (HiTrap™, Pharmacia nº 17-0407-01) y una subsiguiente HPLC de fase inversa (columna C8, Aquapore RP300, Applied Biosystems, tamaño de partículas: 7 µm, tamaño de poros: 300 Å). Las fracciones con MP52 se agruparon, liofilizaron y se almacenaron a -80ºC.
Ejemplo 2:
La posible expresión de MP52 en E. coli ya se ha dado a conocer en los documentos WO 93/16099 y WO 95/04819, la expresión de MP52 maduro, también con histidinas colgadas en el extremo N, se ha dado asimismo a conocer (documento WO 95/04819). Las histidinas adicionales facilitan la purificación de la proteína mediante unión a columnas de quelatos de metales. Después de la purificación, la proteína MP52 madura expresada en E. coli en forma de monómero puede ser replegada para formar un dímero. La mayor parte de la porción madura de MP52 (aminoácidos 383 a 501 en SEQ ID NO. 2) con 10 aminoácidos adicionales, incluidas 6 histidinas en el extremo N (MHHHHHHKLI) se expresó en el vector pBP2 procariótico. Este vector es un derivado de pBR322 con resistencia a ampicilina, el cual contiene adicionalmente al promotor T7 procedente del plásmido pBluescript II SK (Stratagene). Además, el vector contiene, detrás del promotor T7, un lugar de unión ribosomal y un codón de iniciación como parte de un lugar de corte por restricción Nde I, seguido de 6 codones para histidina. Detrás de varios sitios de corte por restricción (Hind III, Eco RI, Xho I, Bam HI, Sma I y Apa I) para la inserción de insertos así como codones de terminación en todos los tres marcos de lectura, sigue un terminador (Tø). El plásmido pBP2MP52His se depositó el 2 de junio de 1995 en la DSM (número de depósito: DSM 10028). El mismo vector se utilizó, aprovechando el lugar de corte por restricción Nde I para la expresión de la MP52 madura (aminoácidos 382 a 501 en SEQ ID NO. 1) con sólo una metionina adicional en el extremo N. El plásmido pBP2MP52m se depositó el 2 de junio de 1995 en la DSM (número de depósito: DSM 10029). La expresión de la proteína MP52 con (MP52His) o sin (MP52m) colgante de histidina puede tener lugar mediante habilitación simultánea de T7-ARN polimerasa. La T7-ARN polimerasa puede habilitarse a través de diferentes métodos tales como, p. ej., un segundo plásmido con un gen para T7-ARN polimerasa o mediante infección con fagos que codifican la T7-ARN polimerasa o bien mediante cepas bacterianas especiales que tienen integrado al gen para T7-ARN polimerasa. Utilizando la cepa bacteriana BL21(DE3)pLysS (Novagen, nº 69451-1) y la inducción de la T7-ARN polimerasa según los datos del fabricante con IPTG, se forma la proteína MP52 con y sin His-Tag en cuerpos de inclusión, a partir de los cuales pueden aislarse las proteínas según métodos convencionales. En virtud de His-Tag, la proteína MP52His puede purificarse a través de columnas formadoras de quelatos de metales tal como se describen, p. ej., en Hochuli et al. (BIO/Technology Vol. 6, 13211325 (1988)). MP52His y MP52m se purificaron adicionalmente a través de una HPLC de fase inversa. Se utilizó una columna de fase inversa (Nucleosil 300-7C4 de Macherey-Nagel, Art. 715023) con un caudal de 2 ml/min y un gradiente de acetonitrilo en TFA al 0,1% de 0 a 90% en 100 min. Bajo estas condiciones, comienza la elución de MP52His monómera y MP52m en acetonitrilo aproximadamente al 35%. La determinación de que se trata de la proteína MP52 se realizó en cada caso a través de análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para MP52. MP52m (121 aminoácidos) o bien MP52His (129 aminoácidos) muestran en geles de SDS-poliacrilamida (15%) un peso molecular aparente de aprox. 14 kD (peso molecular teórico: 13,7 kD) o bien de 15 kD (peso molecular teórico: 14,8 kD) tal como se muestra en la Figura 1 después de tinción con plata.
Con el fin de obtener material biológicamente activo, la MP52 monómera expresada en E. coli y purificada puede replegarse para formar una MP52 dímera. Esto puede tener lugar según métodos conocidos por el experto en la materia tal como se describen, p. ej., por Jaenicke, R. y Rudolph, R. (Protein structure, comp. Creighton, T.E., IRL Press, Capítulo 9 (1989)). Dado que para cada proteína varían particularmente las condiciones para el replegamiento, se sometieron a ensayo las condiciones para las proteínas MP52His y MP52m en relación con la solubilización así como valores del pH, temperatura y sistemas redox durante la renaturalización. Para la solubilización de las proteínas MP52 purificadas y liofilizadas se manifestaron adecuados reactivos típicos tales como urea y cloruro de guanidinio. Preferiblemente, la solubilización tuvo lugar a lo largo de 2 horas a la temperatura ambiente en tampón de solubilización (cloruro de guanidinio 6 M, Tris 10 mM, NaCl 150 mM, DTT 3 mM, pH 8,0) a una concentración final de 2,6 mg de MP52His o MP52m por ml. El producto solubilizado se añadió luego a tampón de renaturalización, preferiblemente en una concentración final de 150 -200 µg de MP52His o MP52m por ml.
Para la renaturalización se demostró que el uso de intervalos de pH elevados (pH 8-10) repercutía favorablemente sobre el replegamiento para formar proteínas MP52 dímeras activas. En tal caso, pueden utilizarse sistemas tampón habituales tales como tampón fosfato o Tris con NaCl 1-2 M y otros aditivos tales como, p. ej., EDTA (2-10 mM) y Chaps (15-40 mM). Pueden emplearse sistemas redox habituales, descritos en la bibliografía (p. ej. Jaenicke R. y Rudolph, R., Protein structure, comp. Creighton, T.E., IRL Press, Capítulo 9, (1989)) tales como, p. ej., glutatión oxidado y reducido (p. ej.: GSSG 1 mM, GSH 2 mM). El replegamiento puede llevarse a cabo de manera efectiva en el intervalo de 4ºC hasta la temperatura ambiente a lo largo de, p. ej., 48 horas. Las proteínas MP52 se pueden transformar bajo tales condiciones en un 50-90% en la forma dímera. Las condiciones mencionadas se han de considerar a modo de ejemplo y no son limitantes. Para el experto en la materia resulta posible, mediante la variación de condiciones individuales, transformar MP52 con eficacias similares en una proteína dímera activa. El análisis de las proteínas replegadas tuvo lugar a través de HPLC de fase inversa así como en geles teñidos con plata. Para la HPLC, las proteínas se ligaron a una columna (Aquapore RP-300, 7 µm, Applied Biosystems) a tampón B al 35% (tampón A: TFA al 0,1% en agua; tampón B: acetonitrilo al 90%, TFA al 0,1%) con un caudal de 0,2 ml/min. En un gradiente de acetonitrilo de tampón B al 35 hasta 60% a lo largo de 50 min, las proteínas MP52 monómeras y dímeras se pueden separar una de otra (véase la Figura 2). La proporción de MP52His o bien MP52m replegada se estima en aprox. 70-90%. En geles de poliacrilamida al 15%, la MP52m dímera discurre a aproximadamente 22 kD (peso molecular teórico: 27,4 kD), y MP52His a aproximadamente 24 kD (peso molecular teórico: 29,6 kD), estimado según un marcador de peso molecular (véase la Figura 1). El colgante de histidina no muestra en tal caso influencia significativa alguna de la eficacia de replegamiento. Si se somete a ensayo la actividad de las dos proteínas a través de la determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP – siglas en alemán) en células ROB-C26, tal como se da a conocer, p. ej., en el documento WO 95/04819, entonces se demuestra que MP52His es activa a pesar del extremo N modificado, pero la actividad está ligeramente reducida con respecto a MP52m.
Ejemplo 3:
Para investigar la influencia de MP52 sobre neuronas dopaminérgicas se aislaron neuronas del fondo del mesencéfalo de embriones de rata de 14 días de edad (E14) según un método descrito en Shimoda et al. (Brain Res. 586, 319-331 (1992)). La individualización y el cultivo de las células tuvo lugar tal como se describe por Krieglstein et al. (Neuroscience 63, 1189-1196 (1994)). La densidad de células asciende a 200.000 células/cm2 en cubreobjetos revestidos con poliornitina/laminina. Al cabo de 24 horas de cultivo y seguidamente cada tres días se retiraron dos tercios del medio (500 µl) y se reemplazaron por medio de reciente aportación con los correspondientes aditivos. La MP52 parcialmente purificada y liofilizada tras heparina-Sepharose y HPLC de fase inversa se disolvió en acetonitrilo al 50% y se añadió al medio. Esto mismo tuvo lugar con MP52His replegada y purificada. La concentración final de MP52 o bien MP52His en el medio asciende a 20 ng/ml (la concentración final de acetonitrilo es 0,3%). Como control se disolvió y empleó una cantidad equiparable de MP52His monómera purificada en acetonitrilo al 50%. El control del medio contiene asimismo acetonitrilo al 0,3%. Al cabo de ocho días, los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min a la temperatura ambiente, las células se permeabilizaron con acetona (10 min, -20ºC) y se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfatos). Después del tratamiento con H2O2 al 1% en PBS, lavado y bloqueo con suero de caballo, tuvo lugar una tinción inmunocitoquímica. La tirosinahidroxilasa (TH) es una enzima limitante en la biosíntesis de dopamina y otras catecolaminas, de modo que TH puede ser utilizada como marcador para zonas dopaminérgicas en los presentes cultivos (no se aíslan células con contenido en noradrenalina). TH se detectó a lo largo de incubación durante una hora a 37ºC con un anticuerpo monoclonal de ratón contra TH de rata (dilución 1:200, Boehringer Mannheim) y subsiguiente detección con el kit Vectastain ABC (Vecto Labs). Las células TH-positivas se recontaron en una superficie de 0,12 cm2. Para la tinción inmunocitoquímica de GFAP (proteína de carácter ácido fibrilar glial), las células fijadas se permeabilizaron con acetona (20 min, 20ºC) y se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfatos). Después de la incubación con un anticuerpo monoclonal de ratón contra GFAP (Sigma), diluido a razón de 1:200, le siguió una incubación con un anticuerpo acoplado a peroxidasa contra el anticuerpo monoclonal de ratón. La visualización tuvo lugar según métodos convencionales mediante la adición del sustrato enzimático DAB (diaminobenzidina).
Ejemplo 4:
Para comprobar si MP52 se transcribe en el cerebro y/o la médula dorsal, se aisló el ARN total de la médula dorsal de ratas y de todo el cerebro o bien regiones individuales del cerebro de ratones según métodos convencionales y se transcribió en ADNc según métodos conocidos por el experto en la materia. El ADNc, el cual se obtuvo en cada caso a partir de 100 ng de ARN, se empleó en una PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores empleados para la amplificación (CAACAGCAGCGTGAAGTTGGAG y ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) se encuentran el caso de ADN genómico humano en diferentes exones, de modo que el ADN genómico puede ser diferenciado de ADNc. Como control se emplearon 0,5 µg de ADN genómico de ratón, que, asimismo, no proporciona ningún fragmento de PCR al igual que el ADNc. La PCR se llevó a cabo a lo largo de 30 ciclos (94ºC, 54ºC, 72ºC) en sendos 50 µl de tanda de reacción (en cada caso NTPs 200 µM, 30 pmol de cada uno de los cebadores, (NH4)2SO4 16,6 mM, Tris/HCl 67 mM pH 8,8, MgCl2 2pmM pEDTAp6 7p!M p -mercaptoetanol 10 mM, 170 µg/ml de BSA, 5 U de AmpliTaq (Perkin Elmer nº N8080160). Un tercio de los productos de la PCR se separaron en gel de agarosa al 4%, se transfirieron a membranas en la transferencia Southern y, mediante hibridación con una sonda de MP52, se detectó la especificidad de los fragmentos de la PCR. Se pudo demostrar que MP52 es transcrito tanto en la médula espinal como también en regiones individuales del cerebro.
Ejemplo 5:
Para la expresión de MP121 se eligieron los virus vacuna al igual que para MP52 en el Ejemplo 1. El ADNc se clonó con toda la zona codificadora para MP121 en el vector pBP1 (el plásmido pBP1MP121 resultante se depositó el
12.01.95 en la DSM bajo el número 9665) y se empleó para la producción de virus vacuna recombinantes. En el caso de la infección de células tales como, p. ej., células NIH-3T 3 (DSM ACC 59, embrión de ratón suizo), con los virus recombinantes, se produce la expresión de MP121. Las etapas individuales se divulgan de manera detallada en el documento WO 96/01316. En el transcurso de los ensayos de expresión se sometió a ensayo también a otras líneas de células. En tal caso, se demostró, sorprendentemente, que en el caso de algunas líneas de células, junto a la MP121 dímera se forman también claras cantidades de una MP121 monómera. Dado que este monómero, en el análisis en gel de poliacrilamida (con subsiguiente detección mediante análisis de transferencia Western) eluye más rápidamente que el monómero obtenido mediante reducción del dímero, se ha de tratar de una MP121 monómera plegada que presenta una estructura globular. Como ejemplo, en la Figura 5 se muestra la expresión de MP121 en células HepG2 (carcinoma hepatocelular, hombre, ATCC HB8065). Dado que entretanto se pudo demostrar mediante análisis de transferencia Northern que MP121 es expresada naturalmente en HepG2 (línea de células de hepatocitos procedente del hígado), se ha de partir del hecho de que también a la forma monómera de MP121 se le asigna una importancia fisiológica. La MP121 monómera aparece junto a la MP121 dímera en cantidades significativas, p. ej. también en Mv1Lu (NBL-7, pulmón, nutria, ATCC CCL 64) o Hela (carcinoma epitelial, cuello uterino, hombre, ATCC CCL 2).
En ensayos de expresión de MP121 aprovechando el sistema de baculovirus en larvas de insectos (Trichoplusia ni) se encontró la forma dímera en la hemolinfa.
La purificación parcial de MP121 a partir del sobrenadante del cultivo celular tuvo lugar tal como se describe en el documento WO 96/01316 a través de fenil-Sepharose y HPLC de fase inversa. Paralelamente, según la misma metodología, se elaboró la cantidad correspondiente de sobrenadante del cultivo celular después de la infección con virus de tipo salvaje (wt) como testigo. En el caso de ensayos para mejorar la purificación se pudo demostrar que el uso alternante de agentes eluyentes que contienen TFA (ácido trifluoroacético) o HFBA (ácido heptafluorobutírico), combinado con transcursos modificados de gradientes, se podía aumentar esencialmente el grado de pureza de MP121. Para ello, p. ej., primeramente se eluye una columna (Aquapore RP-300, Applied Biosystems, tamaño de partículas: 7 µm) a un caudal de 0,2 ml/min con TFA al 0,1% (acetonitrilo al 1,36% por min), luego una columna con HFBA al 0,2% (acetonitrilo al 0,23% por min) y, finalmente, una columna de nuevo con TFA al 0,1% (acetonitrilo al 0,23% por min) en el agente eluyente. Las fracciones eluidas que contiene MP121 pueden purificarse después de cada elución, liofilizarse y luego resuspenderse para la aplicación sobre la nueva columna en TFA al 0,1%/H2O. Finalmente, las muestras liofilizadas se almacenaron a -70ºC hasta su uso. La estimación cuantitativa tuvo lugar en análisis de transferencia Western en comparación con MP121m (aminoácidos 237 a 352 en SEQ ID NO. 2 con una metionina adicional en el extremo N) la cual, de manera similar a MP52, se produjo en E. coli, no obstante utilizando la cepa HMS 174 (DE3) (Novagen nº 69453). La purificación tuvo lugar según métodos convencionales a partir de cuerpos de inclusión con subsiguiente lavado de los cuerpos de inclusión con cloruro de guanidinio 2 M/HCl en Tris 20 mM pH 8,0 (bajo ultrasonidos) y resuspensión en cloruro de guanidinio 6 M/HCl en Tris 20 mM pH 8,0 con subsiguiente purificación a través de la fase inversa según métodos convencionales.
Ejemplo 6:
Con el fin de investigar la influencia de MP52 y MP121 en otro sistema, se aislaron cultivos de tejidos de la retina procedentes de embriones de gallina. El método para el aislamiento de trocitos de tejido en forma de un pequeño disco de un tamaño aproximadamente igual procedentes de la retina se describe en detalle en Carri, N.G. y Ebendal,
T. (Dev. Brain Res., Vol. 6 (1983), 219-229), Carri, N.G. y Ebendal, T. (Anat. Rec., Vol. 214 (1986), págs.. 226-229) y Carri, N. G. et al. (J. Neurosci. Res. Vol. 19 (1988) págs. 428-439).
En estos ensayos se mide la estimulación in vitro del desarrollo de fibras nerviosas a partir de explantes de la retina embrionarios en una matriz de colágeno. En síntesis, las partes de tejido se retiran con un capilar de vidrio de la retina de embriones de gallina (Leghorn blanca, 6º día del desarrollo embrionario) y mediante lavado repetido se separa el epitelio pigmentario de la retina y células mesenquimales. Las partículas de tejido, así tratadas, se transfirieron a placas de cultivo revestidas sobre colágeno y se incubaron durante una noche (37,5ºC, 5% de CO2). A continuación, se añadieron los correspondientes factores o controles y los cultivos se continuaron incubando. Para MP52 se empleó la MP52m dímera, tal como se describe en el Ejemplo 2, en diferentes concentraciones. La MP52 monómera que, hasta ahora, no había mostrado actividad alguna en ningún ensayo, se empleó como control negativo en las concentraciones correspondientes. Para MP121 se empleó en diferentes concentraciones el material parcialmente purificado descrito en el Ejemplo 5 después de fenil-Sepharose y HPLC de fase inversa. El material obtenido de manera correspondiente después de la infección con tipo salvaje se empleó como control. Como control independiente, los explantes se mantuvieron en medio de cultivo con algo de albúmina de suero bovino.
Las proteínas se disolvieron en un tampón acuoso o acetonitrilo al 50% y se continuaron diluyendo en el medio de cultivo hasta concentraciones finales de 1,25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml. El tipo de disolución no tenía influencia alguna sobre el resultado.
Al cabo de cuatro días en cultivo, se midió la longitud máxima de los haces de nervios conductores bajo el microscopio en el campo oscuro. Tal como se muestra en las Tablas 1 y 2, tanto MP52 como también MP121 estimulan, en función de la dosis, el desarrollo de las neuritas. MP52 tiene la actividad máxima en el intervalo de 25 100 ng/ml y MP121 muestra una actividad máxima en el intervalo de aprox. 25 ng/ml, lo cual corresponde a una longitud real de las fibras 1,3 -1,7 mm o bien de 1,7 mm frente a 0,2 mm para el control negativo. MP52 monómera y el control de tipo salvaje no mostraron estimulación alguna que sobrepasara al control negativo.
Tabla 1
1,25 15/9/4/13 10,2 + 2,4 12,5 25/18/10/21 18,5 + 3,1 25 74/38/48/47/27/30 44,0 + 6,9 50 62/65/52/51/50/62 57,0 + 2,4 100 26/33/61/70/57/61 51,5 + 7,3 200 10/13/11/9 10,7 + 0,8
Tabla 1:Longitud de las neuritas retinales después de 4 días de cultivo bajo la acción de diferentes concentraciones de MP52. Las longitudes de las neuritas de los controles que contenían solamente medio de cultivo ascendieron a 5,5/8/10/11/4,8/7 unidades con un valor medio de 7,7 unidades (EMT 1,0). Las longitudes de las neuritas de los controles con MP52m monómera (mismas concentraciones que para MP52m dímera) proporcionaron, por término medio, las mismas longitudes que el control que solamente contenía medio de cultivo. Una unidad corresponde a una medida real de 0,03 mm en la placa de cultivo.
Tabla 2
1,25 7/12/5/6 7,5 + 1,5 12,5 19/20/13/26 19,5 + 2,6 25 50/52/60/71/65/53 58,5 + 3,4 50 37/32/48/41/36/20 35,6 + 3,8 100 21/8/19/18 16,5 + 2,9 200 11/8/12/10 10,2 + 0,8
Tabla 2: Longitud de las neuritas retinales después de 4 días de cultivo bajo la acción de diferentes concentraciones de MP121. Las longitudes de las neuritas del control con el sobrenadante del cultivo celular purificado en paralelo de la infección de tipo salvaje proporcionaron, por término medio, las mismas longitudes que el control que sólo contenía medio de cultivo (véase el texto con respecto a la Tabla 1). Una unidad corresponde a una medida real de 0,03 mm en la placa de cultivo.
Descripción detallada de las figuras:
Figura 1:Gel de poliacrilamida al 15% teñido con plata, en cada caso con 0,2 µg de MP52His (pistas 2 y 4) o 0,2 µg de MP52m (pistas 3 y 5) después de purificación de la forma monómera (pistas 2 y 3) o bien después del replegamiento para formar la proteína dímera activa y separación de monómeros restantes a través de la HPLC (pistas 4 y 5). El marcador del peso molecular (15 kD, 25 kD, 35 kD, 50 kD, 75 kD, 100 kD, 150 kD) en la pista 1 es de Novagen (nº 69149-1).
Figura 2:El cromatograma muestra el comportamiento de elución de MP52His monómera solubilizada (. . .) así como la separación de MP52His dímera de formas monómeras restantes después de la renaturalización (------) en una HPLC de fase inversa. MP52His dímera eluye bajo las condiciones elegidas antes que la forma monómera. Asimismo está dibujado el gradiente de acetonitrilo referido a % de tampón B.
Figura 3:Número de las neuronas dopaminérgicas TH-inmunorreactivas supervivientes después de aislamiento a partir del mesencéfalo de embriones de rata (E14) y cultivo durante 8 días. Junto al control con neuronas no tratadas (medio con acetonitrilo al 0,3%) se representa el efecto en el caso de la adición de 20 ng/ml de MP52His monómera purificada de la expresión en E. coli (monómero MP52His), 20 ng/ml de Mp52His purificada de la expresión en E. coli después de la renaturalización para dar la proteína dímera (dímero MP52His), así como 20 ng/ml o bien 2 ng/ml de MP52 parcialmente purificada de la expresión en virus vacuna (MP52). Se muestra el valor medio + EMT de una determinación triple.
Figura 4:Fotografía de células después del aislamiento a partir del mesencéfalo de embriones de rata (E14) después de cultivo durante 8 días y tinción de GFAPs (proteínas de carácter ácido fibrilares gliales). Se muestra el efecto de 20 ng/ml de MP52His monómera purificada (A) a partir de la expresión en E. coli, 20 ng/ml de MP52His dímera purificada (B) procedente de la expresión en E. coli después de la renaturalización, células no tratadas (C, medio con acetonitrilo al 0,3% como control), 20 ng/ml
(D) o bien 2 ng/ml (E) de MP52 parcialmente purificada a partir de la expresión en virus vacuna y 2 ng/ml de TGF-3 (F).
Se fotografió en cada caso una sección representativa con un aumento de 400 veces en el microscopio (Axiophot) con contraste de interferencia. La longitud de las barras (-----) corresponde a 25 µm.
Figura 5:Transferencia Western con anticuerpos de conejo contra MP121
1: sobrenadante del cultivo celular de células Hep-G2 después de infección con virus vacuna recombinantes (con ADNc de MP121 insertado) bajo condiciones no reductoras
2: sobrenadante del cultivo de células Hep-G2 después de infección con virus vacuna de tipo salvaje bajo condiciones no reductoras
3: marcador del peso molecular de proteínas pre-teñido (dibujado de manera esquemática) con los pesos moleculares aparentes de 15,5/18,2/27,8/43,8/71,5 kD (Gibco BRL nº 26041-020)
4: sobrenadante del cultivo celular de células Hep-G2 después de infección con virus vacuna recombinantes (con ADNc de MP121 insertado) bajo condiciones reductoras
5: sobrenadante del cultivo celular de células Hep-G2 después de infección con virus vacuna de tipo salvaje bajo condiciones reductoras
Figura 6:Desarrollo de las fibras nerviosas procedentes de la retina de gallinas embrionarias después de 4 días en cultivo de tejidos. Toma microcóspica de cultivos vivos en campo oscuro.
A: MP52m monómera (5 ng/ml) purificada a partir de cuerpos de inclusión de E. coli.
B: MP52m dímera (5 ng/ml) purificada a partir de cuerpos de inclusión de E. coli y replegada para formar la proteína dímera nativa.
C: MP121 (5 ng/ml) purificada a partir de material sobrenadante de cultivo celular después de la expresión con ayuda del sistema de vacunas en células NIH3T3.
PROTOCOLO DE SECUENCIAS
- (1)
- INFORMACIÓN GENERAL
- (i)
- SOLICITANTE:
- (A)
- NOMBRE: Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
- (B)
- CALLE: Czernyring 22
- (C)
- LOCALIDAD: Heidelberg
- (E)
- PAÍS: DE
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 69115
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Uso de MP52 y/o MP121 para el tratamiento y la prevención de enfermedades del sistema nervioso
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disco blando
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión Nº 1.25 (OEP)
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 1:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 501 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 2:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 3:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 4:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 2703 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C) (D)
- FORMA DE LA CADENA: ambas TOPOLOGÍA: lineal
- 10
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
- 15
- (A) (B) NOMBRE/CLAVE: CDSPOSICIÓN: 640 ….2142
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 352 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C) (D)
- FORMA DE LA CADENA: TOPOLOGÍA: lineal
- 10
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
- 15
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 3:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 352 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- 5
- (C) (D) FORMA DE LA CADENA: TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
- 10
- (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL:
- (B)
- ORGANISMO: Ratón
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 4
- 15
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1.-Uso de MP52 biológicamente activa para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trastornos o pérdidas de funciones nerviosas, provocadas por estados patológicos agudos o crónicos y/o para el tratamiento de situaciones neuropatológicas que son provocadas por la alteración del sistema nervioso, utilizándose en calidad de MP52 biológicamente activa
- (a)
- la porción madura y, eventualmente, otras porciones funcionales de la secuencia de proteínas mostrada en SEQ ID NO. 1;
- (b)
- partes de la proteína madura que presentan esencialmente la misma actividad;
- (c)
- proteínas maduras con un extremo N modificado que presentan la misma actividad;
- (d)
- una proteína madura o partes de la misma, la cual, en virtud de su procedencia de otros vertebrados, presenta una variación en la secuencia de aminoácidos, pero conserva la misma actividad.
- 2.-Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades en el ojo, en particular de la capa neuronal de la retina, de la córnea, del nervio óptico y/o de otros nervios del cerebro, y para uso en trasplantes de retina o de córnea.
- 3.-Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para el tratamiento de estados patológicos agudos que fueron provocados por lesiones.
- 4.-Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para el tratamiento de estados patológicos agudos, provocados por deficiencias cerebrovasculares, inflamatorias, infecciosas, metaboloides y/o influencias tóxicas, desarrollo de tumores y operaciones quirúrgicas.
- 5.-Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
- 6.-Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, Alzheimer o enfermedad de Huntington.
- 7.-Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se utiliza una proteína de fusión a base de MP52 biológicamente activa o partes de la misma y otra proteína de la superfamilia de las proteínas con “motivo de nudo cistina” o partes de la misma.
- 8.-Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque se utiliza una proteína de fusión a base de MP52 y MP121 biológicamente activas o partes de las mismas.
- 9.-Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque en calidad de MP52 biológicamente activa se utiliza un heterodímero de una MP52 biológicamente activa y un monómero de otra proteína de la superfamilia de las proteínas con “motivo de nudo cistina”.
- 10.-Uso según la reivindicación 9, caracterizado porque en calidad de MP52 biológicamente activa se utiliza un heterodímero de una MP52 y MP121 biológicamente activas.
- 11.-Uso según una de las reivindicaciones 7 a 10, para la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades en el ojo, en particular de la capa neuronal de la retina, de la córnea, del nervio óptico y/o de otros nervios del cerebro y para uso en trasplantes de retina o córnea.
- 12.-Uso según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se añaden adicionalmente gangliósidos que aparecen de forma natural, sus derivados, sales o análogos sintéticos.
- 13.-Uso según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se añade adicionalmente una proteína de la superfamilia de las proteínas con “motivo de nudo cistina”.
- 14.-Uso según una de las reivindicaciones 7, 9 ó 13, caracterizado porque en el caso de la proteína de la superfamilia con “motivo de nudo cistina” se trata de una proteína de la superfamilia de TGF-, familia de NGF/neurotrofina o familia de PDGF.
- 15.-Uso según la reivindicación 14, caracterizado porque se trata de proteínas de TGF-, BMP, activina, GDNF, NGF, BDNF, NT3 o NT4/5.
- 16.-Uso según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque se administra adicionalmente un factor de crecimiento tal como FGF, EGF o factor de crecimiento glial.
- 17.-Uso según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se administra por vía intracerebral, oral, mediante inyección, mediante inhalación, en forma de aplicación local externa.
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