JP7413286B2 - Gagとそれらのエフェクター分子との相互作用を制御するリガンドおよびその使用 - Google Patents
Gagとそれらのエフェクター分子との相互作用を制御するリガンドおよびその使用 Download PDFInfo
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Description
GAGは、長さが最大150単位であり得る、2糖(二糖)繰り返し単位の直鎖状非分枝鎖であり、当技術分野で周知であり、十分説明されている。GAGは、常にではないが多くの場合、プロテオグリカンと呼ばれる構造のタンパク質コアに共有結合した状態で見出される。プロテオグリカン構造は、細胞表面に大量に存在し、細胞周辺の細胞外マトリックスに付随する。
例えば、特異的硫酸化パターンは、所与の神経回路が非常に可塑性である臨界期のタイミングに重要であることが、生後の脳の発達中に示されている。本明細書で使用される場合、用語「臨界期」は、生物の神経系が、概して少なくとも一部は外部環境刺激に応答して、特異的な機能的能力および/または構造配置を獲得することができる、生物発生中の期間を指す。臨界期のタイミングおよび継続期間は、受ける環境刺激に依存し得る。例えば、ある特定の環境刺激の欠如は、臨界期を延長する。これらの臨界期は、ニューロン結合性を再構築し続け、環境への適応にならびに学習および行動に不可欠である。
これらの臨界期は、視覚皮質における両眼視および聴覚皮質における周波数マップ精密化など、感覚系に存在することが公知である。それらは、運動系およびさらにはヒトの言語習得などのより高度な認識の脳内領域にも存在する。
これらの臨界期は、例えば、Orthodenticleホメオボックスタンパク質2(Otx2)ホメオタンパク質転写因子によって駆動される皮質抑制性GABA作動性パルブアルブミンニューロン(PV細胞)の成熟から生じる。Otx2は、大脳皮質の外側で合成され、細胞外環境内で輸送され、PV細胞によって特異的に内在化される。この内在化特異性は、ペリニューロナルネット(PNN)と呼ばれる特殊化された細胞外マトリックスとして内部に含有される二硫酸化コンドロイチン硫酸(D型(CS-D)またはE型(CS-E))により媒介される。
所与の神経回路が高度に可塑性である臨界期は、例えば、てんかん、統合失調症、うつ病、自閉症およびアルツハイマー病を含む、いくつかの神経および精神疾患では変更されるようであることが、さらに示されている。
さらに、GAG結合モチーフ(RKQRRER)がOtx2の一次配列において発見され、これにより、Otx2と、PV細胞の周囲のPNNに含有されるグリコサミノグリカン(例えば、二硫酸化コンドロイチン硫酸)との相互作用が明らかになった。Beurdeleyら(2012, J. Neurosci., 32, 9429-37)は、この「PK」モチーフを含有するペプチドの皮質内注入がGAG結合についてOtx2と競合して、成熟PV細胞をそれらのOtx2含量について枯渇させ、成熟マウスにおける視覚皮質可塑性を回復させ、弱視マウスにおける皮質視力を救済することを、さらに示した。
Winterら(2016, Neural Plast., 3679545)は、PNNにおけるSema3Aの制御された中和が、ニューロン可塑性の増強および傷害後の機能修復の増進の重要な手法であり得ることを示した。
Miyata et al., 2012,. Nat Neurosci ., 15, 414-422およびDick et al., 2013, J Biol Chem, 288, 27384-95には、Otx2およびセマフォリン-3A(Sema-3A)が両方とも、視覚皮質可塑性の肝要なアクター(keys actors)であり、二硫酸化コンドロイチン硫酸E型(CS-E)への結合のために類似のモチーフ(それぞれ、RKQRRERおよびRKQRRQR)を共有することが示されている。
それ故、本発明者らは、臨界期および関連する可塑性のタイミングが、一部は、GAGとそのエフェクター分子、例えばOtx2またはセマフォリン、との相互作用により制御されると結論付け、研究および治療応用のために、臨界期のタイミングを改変するための手法、より詳細には、神経系の可塑性を改変するための手法を提供するために前記相互作用に干渉することを提案する。したがって、GAGとエフェクター分子との相互作用を制御することができる化合物を提供することが必要である。
同様に、修飾天然および合成ポリマー(例えば、硫酸基を有する、ポリアクリレート、ポリ2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、ポリ(4-スチレンスルホン酸ナトリウム)(PSS)、ポリ(スルホン酸ビニル)(pVS)、硫酸化リグニン誘導体、ポリフェノール、ポリグリシドールコポリマー、ポリ(エチレンオキシド)-bl-ポリ(プロピレンオキシド)-bl-ポリ(エチレンオキシド)(Pluronic F-127)など)が、GAG代替物として提案されている。これらの戦略は、ある程度の成功を示したが、配列モジュレーションを欠いており、タンパク質との非特異的静電相互作用しか示さない。代替的に、定義された小分子が、GAG模倣物として使用されている:硫酸化アミノシド、N-ヘテロ-アロイルアミノ糖類、b-シクロデキストリン硫酸、およびアプタマー。
したがって、当技術分野には、神経系臨界期のタイミングを改変することができる、より詳細には神経系の可塑性を改変することができる、化合物および方法を開発する重要な要求がある。
同様に、当技術分野では、CNSの損傷後の回復を増進するならびに/または神経精神障害および神経発達症におけるCNSおよび認知機能の改善を助ける、改善された処置が必要とされている。より詳細には、可塑性などの神経系の肝要な特性に作用する、および治療利益をもたらすようにモジュレートすることができる、新しい化合物および方法が必要とされている。
第1の実施形態によれば、本発明は、一般式(I)のポリペプチド:
(I) [X]n
(式中、
nは、3と50の間に含まれ、
Xは、4~6アミノ酸を含むペプチドであり、
Xは、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸を含み、
Xは、1つまたは2つのシステイン酸、好ましくは2つのシステイン酸を含み、
Xは、システイン以外の少なくとも1つの中性アミノ酸を含む)
を含むもしくは前記ポリペプチドからなるリガンド、またはその薬学的に許容される塩のいずれかであって、
1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合と相互作用することができるリガンド、またはその薬学的に許容される塩のいずれかを提供する。
式(I)の化合物は、その薬学的に許容される塩の形態であってもよい。特に、塩の対イオンは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムなどの金属カチオンからなる群の中から選択することができる。
システイン酸は、システインのスルホン酸類似体であるアミノスルホン酸であり、すなわち、C末端スルホン酸基を有するアミノ酸である。その合成は、当技術分野において幅広く論じられており、化合物は、市販されている。
システインは、チオールを形成するスルフヒドリル-SH基の存在を特徴とする中性α-アミノ酸である。システインは、ほとんどのタンパク質に少量で存在する。タンパク質中のその存在は、それによりジスルフィド架橋の形成が可能になるので、非常に重要である。チオール基は、容易に酸化するので、非常に脆弱である。その酸化は、ジスルフィド架橋により連結された2つのシステイン分子からなるシスチンをもたらす。より高エネルギーの酸化剤は、システイン酸を与えることによりシステインを酸化することができる。
ホモシステインは、メチオニンまたはシスタチオニンの異化の結果である非タンパク質構成アミノ酸である。ホモシステインの名称は、システインとのその類似性に由来する。実際、ホモシステインの側鎖(later chain)は2つのメチル基を含有するが、システインの側鎖は1つのメチル基しか含有しない点で、ホモシステインは、システインとは異なる。スルフヒドリルの反応性は、システインおよびホモシステインにおいて同様である。
さらなる実施形態では、リガンドは、Xが2つのシステイン酸を含むことを特徴とする。
別の実施形態では、リガンドは、Xが2つのホモシステイン酸を含むことを特徴とする。
別の実施形態では、リガンドは、「システイン以外の少なくとも1つの中性アミノ酸」が、アラニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンおよび2-アミノイソ酪酸からなる群から選択されることを特徴とする。
好ましくは、「システイン以外の少なくとも1つの中性アミノ酸」は、アラニン、セリン、トレオニンであり、より好ましくはアラニンである。
リガンドが、システイン以外の中性アミノ酸がアラニンであることを特徴とすることも、好ましい実施形態である。
別の実施形態では、本発明のリガンドは、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸が、ペプチドXのC末端から数えて1番目に位置することを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、本発明のリガンドは、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸が、グルタミン酸であることを特徴とする。
特別な実施形態によれば、本発明のリガンドのアミノ酸残基は、DもしくはL、またはDとLの混合物であることができる。
特別な実施形態によれば、本発明のリガンドは、Xが同じまたは異なることを特徴とする。これは、モチーフ「X」の「n」反復が、それらの混合物の、いくつかの同一ペプチドモチーフまたは幾つかの異なるペプチドモチーフの反復を含むことができることを意味する。異なるは、少なくとも1つのモチーフXが他のものと異なり得ることを意味する。異なるは、アミノ酸の性質および量が異なることを意味する。
好ましい実施形態では、本発明によるリガンドは、Xが4アミノ酸を含むペプチドであることを特徴とする。
特定の実施形態では、リガンドは、合成および非天然のものであることを特徴とする。
好ましい実施形態によれば、ペプチド[X]nにおけるXは、EACC、ECCAおよびECAC(式中、Cはシステイン酸であり、Aはアラニンであり、Eはグルタミン酸である)からなる群の中から選択される。
好ましい実施形態によれば、アミノ酸は、L型である。
好ましい実施形態では、本発明によるリガンドは、(EACC)n、(ECCA)n、(ECAC)nから成る群の中から選択されるポリペプチド[X]nを含んでいる、または前記ポリペプチド[X]nからなっている。
好ましい実施形態によれば、アミノ酸は、L型である。
好ましい実施形態によれば、nは、3~6であり、より好ましくは、nは、5または6であり、よりいっそう好ましくは、nは、6である。
よりいっそう好ましい実施形態では、本発明によるリガンドは、(ECCA)nまたは(ECAC)n(式中、nは、3と6の間であり、特に、nは、5または6であり、よりいっそう好ましくは、nは、6である)から成る群の中から選択されるポリペプチド[X]nを含んでいる、または前記ポリペプチド[X]nからなっている。
本発明によれば、ポリペプチド[X]nは、直鎖状または樹状であり得る。
1つの特別な実施形態によれば、本発明によるポリペプチド[X]nは、直鎖状である。直鎖状は、ポリペプチドがペプチド結合により連結されたアミノ酸の連続鎖に従って繰り返される[X]部分の連続を含むことを意味する。
別の特別な実施形態によれば、本発明によるポリペプチド[X]nは、樹状であり、[X]部分、より特に(ECCA)または(ECAC)部分は、下記で説明される通りのKpであるポリリシンコア鎖にグラフトされている。
したがって、その場合、ポリペプチドは、主分枝コアにポリペプチド[X]nがグラフトされている、くし型であり得る。好ましくは、分枝コアは、ポリリシンコア鎖(K)p(式中、Kは、Lysであり、pは、3と8の間、好ましくは3と5の間に含まれ、特に4である)であり、ポリペプチド[X]nがグラフトされている。
本明細書で使用される場合、「リガンドは、1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合と相互作用することができる」という用語は、本発明のリガンドが、少なくとも1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合を阻止するまたは低減させることができることを意味する。
1つの好ましい実施形態によれば、本発明のリガンドは、少なくとも1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合を阻止することができる。
好ましい実施形態によれば、本発明のリガンドは、少なくとも1つのエフェクター分子に結合することができる。
好ましい実施形態によれば、前記エフェクター分子は、グリコサミノグリカン結合部位を含むタンパク質である。本出願では、「グリコサミノグリカン結合部位」という表現は、グリコサミノグリカンGAG(特に、ヘパラン硫酸、ヘパリンまたはコンドロイチン硫酸からなるGAG)と強く相互作用する、前記タンパク質の領域を意味する。この結合ポケットは、一般に、タンパク質の塩基性側鎖から組み込まれ、BBXBモチーフ(式中、Xは、親水性残基であり、Bは、アルギニンおよびリシンからなる群の中から選択される)を含有する。グリコサミノグリカン結合部位の同定を、当業者は、タンパク質配列分析、X線およびNMR構造決定などの、公知の技術的手段に従って果たすことができる。特に、「グリコサミノグリカン結合部位」は、RKQRRERまたはRKQRRQRである。
1つの好ましい実施形態によれば、本発明のリガンドは、グリコサミノグリカン(GAG)結合部位と相互作用することができる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明のリガンドは、グリコサミノグリカン(GAG)結合を模倣することができる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明のリガンドは、少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)のグリコサミノグリカン結合部位への結合を低減させることができる。
好ましい実施形態によれば、前記グリコサミノグリカンGAGは、ヘパラン硫酸、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸からなる群の中から選択される。
好ましい実施形態では、前記エフェクター分子は、転写因子、増殖因子、シグナル伝達因子、凝固カスケードタンパク質からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、前記エフェクター分子は、セマフォリン、ホメオタンパク質ファミリーからなる群から選択され、好ましくは、Otx2またはセマフォリン-3Aである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明によるリガンドは、(ECAC)5および(ECAC)6から成る群の中から選択されるポリペプチド[X]nを含んでおり、または前記ポリペプチド[X]nからなっており、前記エフェクター分子は、セマフォリンであり、好ましくは、セマフォリン-3Aである。
含まれるポリペプチド[X]nは、通常のおよび周知の技術に従って製造され得る本発明によるリガンドである。合成経路は、当技術分野において公知のRinkアミドMBHA樹脂でのFmoc戦略を使用することができる。6-アミノヘキサン酸(Ahx)スペーサーをN末端に導入することができ、ペプチジル樹脂をアセチル化(Ac)するまたはビオチンスルホン(Biot(SO2))でアシル化することができる。
本発明の目的は、医薬として使用するための、任意の前記実施形態に従って上で説明された通りのリガンドを提供することでもある。
本発明は、さらに、上で定義された通りの少なくとも1つのリガンドと薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、必要に応じて動物またはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じさせない賦形剤を指す。本明細書で使用される、「薬学的に許容される賦形剤」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのそのような賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。
本発明は、さらに、可塑性改変剤として使用するための任意の前記実施形態によるリガンドまたは組成物に関する。
本明細書で使用される場合、用語「可塑性改変剤」は、単独でまたは1つもしくは複数の他の物質もしくは非薬理療法と組み合わせて対象に投与されると神経系の少なくとも一部分についての可塑性の検出可能な改変を生じさせることになる、物質または組成物を指す。改変は、薬剤の非存在下で観察される機能および/または構造と比較したときの神経系機能および/または構造の改変により証明することができる。
本発明は、それを必要とする対象において神経系またはその一部分における可塑性を改変する方法であって、神経系可塑性を改変するのに有効な量の可塑性改変剤を投与するステップを含み、可塑性改変剤が、本発明によるリガンドまたは組成物であり、それを必要とする前記対象の神経系またはその一部分における1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合と相互作用するものである、方法にさらに関する。
本発明は、それを必要とする対象において神経系またはその一部分における可塑性を改変する方法であって、神経系可塑性を改変するのに有効な量の可塑性改変剤を投与するステップを含み、可塑性改変剤が、本発明によるリガンドまたは組成物であり、それを必要とする前記対象の神経系またはその一部分における1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合を阻止するまたは低減させるものである、方法にさらに関する。
本発明は、対象の神経系またはその一部分における再構成または回復を促進する方法であって、それを必要とする対象に可塑性改変剤を投与するステップを含み、薬剤が、神経系再構成または回復を促進するのに有効な量で、単独でまたは1つもしくは複数の追加の薬剤と組み合わせて投与され、可塑性改変剤が、本発明によるリガンドまたは組成物であり、それを必要とする前記対象の神経系またはその一部分における1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合を阻止するまたは低減させるものである、方法をさらに提供する。
本発明は、それを必要とする対象において神経系またはその一部分における神経発生を刺激する方法であって、神経発生を刺激するのに有効な量の可塑性改変剤を投与するステップを含み、可塑性改変剤が、本発明によるリガンドまたは組成物であり、それを必要とする前記対象の神経系またはその一部分における1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合と相互作用するものである、方法にさらに関する。
本発明は、それを必要とする対象において神経系またはその一部分における神経発生を刺激する方法であって、神経発生を刺激するのに有効な量の可塑性改変剤を投与するステップを含み、可塑性改変剤が、本発明によるリガンドまたは組成物であり、それを必要とする前記対象の神経系またはその一部分における1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合を阻止するまたは低減させるものである、方法にさらに関する。
好ましい実施形態によれば、そのような方法では、前記エフェクター分子は、グリコサミノグリカン結合部位を含むタンパク質である。
好ましい実施形態によれば、そのような方法では、前記グリコサミノグリカンGAGは、ヘパラン硫酸、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸からなる群の中から選択される。
好ましい実施形態では、そのような方法では、前記エフェクター分子は、転写因子、増殖因子、シグナル伝達因子、凝固カスケードタンパク質からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、そのような方法では、前記エフェクター分子は、セマフォリン、ホメオタンパク質ファミリーからなる群から選択され、好ましくは、Otx2またはセマフォリン-3Aである。
本明細書で使用される場合、用語「回復」は、以前に実行した機能を実行する能力を少なくとも一部喪失した神経系またはその一部が、その機能を実行する能力を少なくとも一部取り戻すプロセスを指す。
別な実施形態によれば、脈絡叢内の特異的タンパク質を標的とする非侵襲的手法を開発する必要がある。CSFの分泌によって、脈絡叢は、脳の恒常性にとって重要であり、脳の発達、神経発生および可塑性に関与する、Otx2を含む、シグナルを送達する。
1つの特別な実施形態によれば、本発明は、脈絡叢機能の変更によってそれを必要とする患者を処置するための、本発明によるリガンドの使用に関する。
好ましい実施形態では、本発明のリガンドは、脈絡叢細胞の細胞内空間において活性な抗Otx2化合物である。
好ましい実施形態では、本発明のリガンドは、細胞外環境においてOtx2を捕捉することができ、したがって、眼球優位性可塑性を変更することができる。
特別な実施形態によれば、それを必要とする前記対象は、疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷、より詳細には、ニューロン可塑性の刺激を必要とする疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷に罹患している。特別な実施形態によれば、前記疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷は、Otx2またはSema 3Aによって調節される。
特別な実施形態によれば、前記疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷は、以下を含む群から選択される:
- 例えば、脳血管発作、虚血性、出血性、新生物性、変性、外傷性および/または神経発生障害の後の、神経系損傷;
- 脳卒中または傷害などの事象(例えば、事故または外科手術に起因する)の後の神経系損傷;
- 神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、亜急性硬化性全脳炎、パーキンソン病、ハンチントン病、筋ジストロフィー、アルツハイマー病、特発性ジストニア、脊髄性筋萎縮症またはウイルソン病を含むがこれらに限定されない、疾患および状態;
- 栄養枯渇または毒素(例えば、神経毒、乱用薬物)によって引き起こされる状態;
- 神経発達疾患、例えば、自閉症または失読症、すなわち、神経系の少なくとも一部分が正常な構造および/または機能を発達することができない疾患;
- 神経精神疾患、例えば、統合失調症および双極性障害、すなわち、神経系の少なくとも一部分がその典型的な認知機能レベルに達することができない疾患;
- うつ病、てんかん;
- 眼または耳(すなわち、視覚または聴覚)を冒す変性疾患、例えば、緑内障または弱視など。
本発明に従って投与されることになる可塑性改変剤の用量は、対象の状態、すなわち、疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷のステージ、疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷により引き起こされる症状の重症度、全身の健康状態、ならびに年齢、性別および体重、ならびに医療分野の当業者には明らかな他の因子によって変わり得る。可塑性改変剤は、医療分野の当業者によって決定されるような、処理されることになる疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷に適した様式で、投与することができる。加えて、可塑性改変剤の投与の好適な継続期間および頻度も、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、活性成分の特定の形態、ならびに投与方法のような因子によって、決定または調整することができる。可塑性改変剤の最適な用量は、一般に、実験モデルおよび/または臨床試験を使用して決定することができる。最適な用量は、対象のボディーマス、体重または血液量に依存し得る。有効な治療をもたらすのに十分である最小用量の使用が、通常は好ましい。本明細書に記載の可塑性改変剤についての前臨床および臨床研究の設計および遂行は、関連技術分野の当業者の技能の、十分に範囲内である。
特許、公表文献およびデータベースエントリーについての上記の開示の全ては、そのような個々の特許、公表文献またはエントリー各々が、参照により組み込まれると具体的にかつ個々に示された場合と同程度に、それら全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
上記構成に加えて、本発明は、以下の図を参照して、本明細書(これは、例示的実施形態を指す)から明らかになる他の構成も包含する。
化合物
配列(ECCA)nおよび(ECAC)n(n=3~6)を、RinkアミドMBHA樹脂を用いてFmoc戦略により合成した。6-アミノヘキサン酸(Ahx)スペーサーをN末端に導入し、ペプチジル樹脂をアセチル化(Ac)、またはビオチンスルホン(Biot(SO2))でアシル化した。ペプチドをTFAにより樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させて、Ac-Ahx-(ECAC)n-NH2、Ac-Ahx-(ECCA)n-NH2、Biot(SO2)-Ahx-(ECAC)n-NH2、またはBiot(SO2)-Ahx-(ECCA)n-NH2のいずれかを得た。これらの前駆体を過ギ酸で酸化してシステイン酸(C’)ペプチドを得、次いで、アンモニア水で中和して、アセチルまたはビオチンスルホンのどちらかをN末端におよびアミドをC末端に有する、GAG模倣物(EC’AC’)nおよび(EC’C’A)nを得た。粗製スルホペプチドをセファデックスG25で脱塩し、逆相HPLCで精製し、質量分析で特徴付けた。これらのGAG模倣ペプチドは、ナトリウム塩として-20℃で何カ月間も保管することができる。
ドットブロット
競合アッセイのために、400pmolのビオチン化リガンドまたはヘキサCSEを、100mM酢酸アンモニウム中、37℃で30分、1μgのOtx2タンパク質(自社のもの)とともにおよび3μgのRK-、AA-またはSC-ペプチドとともにインキュベートした。次いで、各溶液をニトロセルロース膜上にスポットし、ストレプトアビジン-HRP(ThermoFisher Scientific)との30分のインキュベーション、続いての化学発光(#34580、ThermoFisher Scientific)反応によりビオチンを検出した。LAS-4000(富士フイルム株式会社)で膜をデジタル化し、ImageJでの濃度測定により定量した。
Otx2タンパク質(0.1μg)を室温で30分間、50ng/μlのdIdC、PBS中、40fmolのビオチン化IRBP1オリゴヌクレオチドおよび4pmolの(EC’AC’)5またはヘキサCSEとともにインキュベートした。TBE中、6%の未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて100Vで試料を分離し、次いで、380mAで45分間、ナイロン膜に転写し、UV(120,000μJ/cm2、Amersham)で架橋した。LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(#89880、ThermoFisher Scientific)を検出に使用し、LAS-4000(富士フイルム株式会社)で膜をデジタル化し、ImageJでの濃度測定により定量した。
成体マウスの視覚皮質を切開し、均質化緩衝剤(0.32Mスクロース、5mM HEPES、10mM MgCl2およびプロテアーゼ阻害剤)に溶解した。試料を4℃で遠心分離し(8分、1700g)、上清を2時間、37℃で5nmolのGAG模倣物とともにインキュベートした。競合アッセイのために、リガンドを30分、50nmolのRK-、AA-またはSC-ペプチドとともに37℃でプレインキュベートし、その後、一晩、4℃でストレプトアビジン結合ダイナビース(Life technologies)とともにインキュベートした。負荷されたビーズを均質化緩衝剤で洗浄し、Laemmli緩衝剤(DTTを含有する)中で10分、95℃で加熱してウェスタンブロット分析用のタンパク質を剥離させた。
ウェスタンブロット
免疫沈降したタンパク質をNuPAGE 4~12%Bis-Trisプレキャストゲル(Invitrogen)で1時間、200Vで分離し、400mAで1時間、メタノール活性化PVDF膜に転写した。膜を5%脱脂粉乳で1時間ブロックし、その後、一次抗体抗Sema3A(ウサギ、1/1000、Millipore)とともに一晩、4℃でインキュベートした。膜を洗浄し、1時間、二次抗体抗ウサギHRP連結型(Cell Signaling)とともにインキュベートした。LAS-4000(富士フイルム株式会社)で膜をデジタル化し、ImageJでの濃度測定により定量した。
3月齢C57BL/6Jマウス(Janvier)のV1(ラムダ:x=1.7mm、y=0mm、z=0.5mm)に7日間、Alzetマイクロ浸透圧ポンプを使用して様々な濃度(4pM、400pMまたは4μM)のリガンドを注入した(0.5μL/時)。次いで、動物をPBSおよび4%パラホルムアルデヒドで灌流した。クリオスタット切片(20μm)を一晩、一次抗体抗パルブアルブミン(ウサギ、1/500、Swant)およびWFA-FITC(1/100、Vector)とともにインキュベートし、その後、1時間、二次抗体抗ウサギAlexa Fluor-546(1/2000、Molecular Probes)とともにインキュベートした。Leica SP5共焦点顕微鏡で画像を取得し、ImageJでの解析により定量した。
統計解析
Prism 6(GraphPad)で解析を行った。単一比較はt検定で行ったが、複数の群の解析は、ANOVA、続いてのボンフェローニ事後検定により行った。
Otx2タンパク質へのビオチン化(EC’C’A)nおよび(EC’AC’)nライブラリーの親和性を評価するために、本発明者らは、スルホペプチド保持にタンパク質との相互作用が必要とされるニトロセルロース膜を用いてドットブロットを行った(図1a)。Otx2結合は、1つのモチーフを他のものより優先しなかったが、nリピートの関数としての親和性の明確な増加があった(図1b)。比較のために、マウスの脳においてOtx2に結合し、そのin vivo活性に緩衝することが以前に示されているヘキサCSEを用いて、ドットブロットを行った。n=4または5リピートである配列は、Otx2に結合し、ヘキサCSEにも同等に結合することが判明したが、n=6であるものは、2倍~3倍よく結合することが判明した。
Claims (11)
- 一般式(I)のポリペプチド:
(I) [X]n
(式中、
nは、3~6であり、
Xは、ECCAおよびECAC(式中、Cはシステイン酸であり、Aはアラニンであり、Eはグルタミン酸である)からなる群の中から選択される)
を含むもしくは前記ポリペプチドからなるリガンド、またはその薬学的に許容される塩のいずれかであって、
1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合と相互作用することができるリガンド、またはその薬学的に許容される塩のいずれか。 - グリコサミノグリカン(GAG)結合部位と相互作用することができることを特徴とする、請求項1に記載のリガンド。
- 前記グリコサミノグリカンGAGが、ヘパラン硫酸、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸からなる群の中から選択されることを特徴とする、請求項2に記載のリガンド。
- 前記リガンドが、少なくとも1つのエフェクター分子と少なくとも1つのグリコサミノグリカン(GAG)の結合を阻止することができることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載のリガンド。
- 前記エフェクター分子が、転写因子、増殖因子、シグナル伝達因子、凝固カスケードタンパク質からなる群から選択される、請求項4に記載のリガンド。
- 前記エフェクター分子が、セマフォリン、ホメオタンパク質ファミリーからなる群から選択される、請求項5に記載のリガンド。
- 前記エフェクター分子が、Otx2またはセマフォリン-3Aである、請求項6に記載のリガンド。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のリガンドを含む医薬組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項8に記載の医薬組成物。
- 脳血管発作、虚血性、出血性、新生物性、変性、外傷性および/または神経発生障害の後の、神経系損傷;
脳卒中または傷害の後の神経系損傷;
神経変性疾患;
栄養枯渇または毒素によって引き起こされる状態;
神経発達疾患;
神経精神疾患;
うつ病、てんかん;
眼または耳を冒す変性疾患、
を含む群から選択される疾患および/または神経学的状態および/または神経系損傷の処置に使用するための、請求項8または9に記載の医薬組成物。 - 前記神経変性疾患が、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、亜急性硬化性全脳炎、パーキンソン病、ハンチントン病、筋ジストロフィー、アルツハイマー病、特発性ジストニア、脊髄性筋萎縮症およびウイルソン病からなる群より選択され、
前記神経発達疾患が、自閉症または失読症であり、
前記神経精神疾患が、統合失調症または双極性障害であり、および
眼を冒す前記変性疾患が、緑内障または弱視である、
請求項10記載の医薬組成物。
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