JPH11507822A - ａＰＬ免疫応答性ペプチド、その結合体およびａＰＬ抗体媒介病理のための処置方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 aPLエピトープが結合するＢ細胞に特異的に結合するaPLアナログを開示する。Ｔ細胞エピトープ（単数または複数）を欠失する最適化されたアナログは、aPL抗体媒介疾患を処置するための結合体として有用である。このアナログを調製および同定する方法、このアナログを用いる処置方法、このアナログの結合体を調製するための方法および組成物ならびにこのaPL抗体についての診断イムノアッセイを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 aPL免疫応答性ペプチド、その結合体およびaPL抗体媒介病理のための処置方法 技術分野 本発明は免疫学の分野にあり、そして抗リン脂質(aPL)抗体媒介病理を処置し そして診断するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、化 学的に定義された非免疫学的原子価プラットホーム分子（valency platform mol ecule）およびaPL結合エピトープの免疫特異的アナログならびにこれらの結合体 を生成するための方法および組成物に関する。最適化されたアナログは、Ｔ細胞 エピトープを有しない。さらに、本発明は、生物学的サンプル中の抗リン脂質抗 体の存在を検出し、そしてその量を定量化するための診断アッセイに関する。本 発明はまた、aPL結合エピトープの免疫特異的アナログを同定するためにランダ ムペプチドライブラリーを使用する方法に関する。 発明の背景 抗リン脂質抗体は、全身性エリテマトーデス(SLE)および抗リン脂質抗体症候 群(APS)のような自己免疫疾患において、ならびに感染および薬物治療に関連し て生じる。APSは、動脈性または静脈性の血栓症、血小板減少症、および胎児死 亡(fetal loss)のような１つ以上の臨床的特徴によって特徴づけられる。APSは 、原発性であり得るか、または他の状態、主にSLEに関連し得る(PHOSPHOLIPID-B INDING ANTIBODIES(Harrisら編、CRC Press，Boca Raton，FL，1991)；McNeilら 、ADVANCES IN IMMUNOLOGY，第49巻、193-281頁(Austenら編、Academic Press， San Diego，CA，1991))。SLEを有する患者の約30〜40％がaPLを有するが、aPL抗 体を有する患者の50％はSLEを有しない。この50％は他の自己免疫リウマチ的疾 患、雑多な状態を有し得、またはこれらは薬物療法、特にクロルプロマジンに供 された可能性がある。原発性のAPS(PAPS)を有するが、SLEを有する証拠のない70 人の患者（26人の男性および44人の女性）の１つの研究において、以下の特徴が 観察された：31人に深部静脈血栓(DVD)；31人に動脈閉塞、特に発作または一過 性虚 血；15人に心筋梗塞；24人に再発性の胎児死亡；32人に血小板減少症(TCP)；10 人がCoomb試験に陽性；７人にEvans症候群；32人に抗核抗体(ANA)、しかし29人 が１：160未満；および約24人に抗ミトコンドリア抗体(AMA)(McNeilら、前出)。 見積もりはばらつくが、全ての発作患者の約５％において、aPL抗体は重要な寄 与因子であると考えられる。 VDRL試験において検出される抗体のような一過性のaPL抗体は、多くの感染の 間に起こる。持続的なaPL抗体を有する患者の約30％が血栓症的事象を経験して いる。aPL抗体の存在は、血栓症、TCP、および胎児死亡の一つ以上からなる臨床 的特徴を有する症候群を呈する患者の群をSLE内に規定する。SLE全体におけるこ の症候群の危険性は、約25％である；この危険性は、aPL抗体の存在下で40％に 増加し、そしてその非存在下では15％に減少する。aPL抗体は細胞膜のリン脂質 に指向されると考えられていたため、それらは血小板または内皮のような細胞の リン脂質膜で起こる止血のプロセスを妨害することによって、インビボで直接的 な病原性の影響を及ぼし得ると推論されてきた。PAPSを有する患者において、aP L抗体が、存在する唯一の危険因子のようであるという事実は、これらの抗体が 直接的な病原的役割を有するというさらなる証拠である。マウスをヒト抗カルジ オリピン抗体で免疫化することによるPAPSの誘導は、aPL抗体が直接的に病原性 であるという、これまでで最高の証拠である(Bakimerら、1992 J.Clin.Invest.8 9:1558-1563; Blankら、1991 Proc.Natl.Acad.Sci．88:3069-3073)。 臨床的環境におけるaPL抗体の測定は、未だに不完全な技術である。標準的抗 血清の購入可能なセット(APL Diagnostics，Inc.，Louisville，KY)は、種々の 研究室において行われるアッセイの比較のための標準曲線の作成を可能にする。 しかし、正確なGPLおよびMPL（それぞれ、所与の血清を評価するIgGおよびIgM抗 リン脂質抗体の測定の単位）、ならびに高力価、中力価、または低力価と分類さ れるGPLおよびMPLのレベルに関してこれらの研究室で得られる結果の間にかなり の不一致が存在する。入手可能な市販のキットは、市販の標準物質に割り当てら れる値が大きく変化する(Reberら、(1995)Thrombosis and Haemostat．73:444-4 52)。これらの制限にもかかわらず、APS、PAPS、ならびに再発性の発作および再 発性の胎児死亡を含む他のPL抗体媒介疾患において、抗体によって認識されるエ ピトープは、β₂-GPIの第５ドメイン内に位置し、そしてβ₂-GPIのカルジオリピ ンへの結合の後に、抗体に曝されるという一般的な同意が存在する。 aPL抗体が、β₂-糖タンパク質(β₂-GPI)および負に荷電したリン脂質、例えば カルジオリピン(McNeilら、(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．87:4120-4124; Gall iら、(1990)Lancet I:1544-1547)(本明細書中以下で「aPL免疫原」))からなる抗 原複合体を認識することは、今では一般的に受け入れられている。β₂-GPIは、 遊離で見出され、そしてリポタンパク質脂質（ここでは、アポリポタンパク質Ｈ (apoＨ)としてもまた知られる）に関連して見出される微量の血漿糖タンパク質 である。これは、Sushiといわれる５つの独立した折り畳みドメイン、または他 のタンパク質における類似のドメインに類似する短いコンセンサス反復ドメイン からなる。β₂-GPIは、リン脂質に結合すると、抗原性変化および立体配座変化 を起こすことが報告されている(Wagenknecktら、(1993)Thromb．Haemostas．69: 361-365; Jonesら、(1992)Proc．5th Intl．Symp．Antiphospholipid Antibosie s(アブストラクトS5))。第５ドメインは、脂質結合およびaPL抗体結合の推定の 部位を含む(Hunt J.およびS.Krilis，(1994)J.Immunol．152:653-659; Lauerら 、(1993)Immunol.80:22-28)。aPLの病理学的メカニズムは未知である(McNeilら 、前出）。ほとんどの説明は内皮細胞機能または血小板の関与を請う(Haselaar ら、(1990)Thromb．Haemostas.63:169-173)。これらの説明は、血管内皮細胞傷 害または血小板活性化の後、陰イオンリン脂質の血漿に曝されている表面への曝 露または二重層貫通移動が、β₂-GPI結合を導き、そしてaPL抗体形成を誘因する ということを示唆する。 aPL抗体は、プロスタサイクリン形成を減少させることによって(Vermylen，J. およびJ．Arnout(1992)J.Clin.Lab.Med.120:10-12)；凝固タンパク質の作用によ る直接的妨害によって；または内因性の血液凝固経路を阻害するβ₂-GPIの能力 、血小板のプロトロンビナーゼ活性、およびADP媒介血漿板凝集をブロックする ことによって(Arvieuxら、(1993)Thromb．Haemostas．60:336-341)、直接的にプ ロトロンビン性であり得る。 リード化合物を探求する医薬品化学における主要な新たな道具は、広範な分子 の多様性を提供するコンビナトリアルライブラリーの出現であった。分子の多様 性は、化学合成または生物学的系から生じ得る(Scott.,J.K．RATIONAL DRUG DES IGN(CRC Press，Weiner，D．B.およびW.V．Williams編、Boca，Raton，FL.，199 4); Moosら、（1993）Ann.Reports Med．Chem．28:315-324)。繊維状ファージの 表面にランダムペプチドを表示することによって、臨床的に重要な抗体によって プローブするための数億個のクローンを含むエピトープライブラリーが作製され た(Scott，J.K.およびG.P.Smoth(1990)Science 249:286-390; Cesareni，G.(199 2)FEBS Lett．307:66-70)。このようなファージライブラリーは、ランダム化さ れたオリゴヌクレオチド配列をファージのゲノムに取り込むことによって調製さ れる。このファージゲノムは通常pIII遺伝子であり、これは各ファージの表面の 単一のペプチド配列をコードする。アフィニティー精製および増幅の連続的なラ ウンドの後、抗体に結合するこれらのファージはE.coli中で増殖され、そして結 合ペプチドは、ウイルスDNAの対応するコード領域の配列決定を行うことにより 同定される。ほとんどの場合、引き続く研究は、抗体に結合する能力を確立した 後、対応する合成ペプチドに関する。ファージベースのライブラリーは、不連続 のエピトープを模倣するために用いられてきた(Luzzagoら、(1993)Gene 128:51- 57; BaLassら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci．90:10638-10642)。ペプチドベース の薬物の潜在的な血漿不安定性は、Ｎ末端ブロッキングにより、またはアミノ酸 アナログの思慮深い使用によって首尾良く克服されてきた(Powell，M.F.(1993)A nn.Reports Med.Chem．28:285-293)。 現在のところ、aPL抗体の高力価を示す患者のための選択的、免疫特異的療法 はない。多くの場合、アスピリン、ステロイド、およびワルファリンのような薬 物の使用は、非常に不適切であることが証明されている(PHOSPHOLIPID-BINDING ANTIBODIES(Harisら編、CRC Press，Boca Raton，FL，1991); McNeilら、前出） 。(i)Ｔ細胞を活性化し得ない一方、(ii)免疫Ｂ細胞に結合する能力を保持する ことによって特徴づけられる合成模倣ペプチドは、Ｂ細胞を抗原特異的な様式で 寛容化するために使用される。この技術は、共有に係る同時係属中の米国特許出 願番号第08/118,055号(1993年９月８日出願)および米国特許第5,268,454号に開 示され、これらは本明細書中で参考としてその全体が援用される。上記の特許出 願および特許中に開示されるように、Ｂ細胞寛容は、Ｂ細胞アネルギー、または 表 面のイムノグロブリンに架橋した後でのクローンの欠失を介して抗体産生を抑止 するために、多価の、安定な、非免疫原性の原子価プラットホームに結合したこ のようなペプチドを投与することを必要とする。 aPL抗体によって認識される標的エピトープの正確な分子的性質は未知である が、エピトープライブラリー由来のペプチドの使用は、成功した寛容原の構築を 可能にする。ヒト全身性エリテマトーデス関連腎炎の処置のためのＢ細胞寛容原 はまた、共有に係る米国特許第5,276,013号および同第5,162,515号に開示され、 これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。 発明の開示 本発明は、再発性発作および再発性胎児死亡のような、PAPS、APS、および他 のaPL抗体媒介疾患にかかっている患者においてaPL抗体によって認識される重要 なエピトープのアナログを、ランダムペプチドファージライブラリーを使用して 同定する方法の発見にある。 従って、本発明の１つの局面は、aPL抗体によって認識されるエピトープを最 もよく模倣するペプチド配列を同定するために、ランダムペプチドファージライ ブラリーをスクリーニングする改良された方法である。この方法は、以下の工程 を包含する：(a)当該分野で公知の方法から改変された方法を使用してライブラ リーを生物選抜する工程；(b)(i)プロテインＧに結合したaPL抗体で被覆された マイクロプレートウェル中でファージをインキュベートすること、(ii)結合して いないファージを取り除くためにマイクロプレートウェルを洗浄すること、(iii )結合したファージを溶出すること、および(iv)溶出したファージでE．coliのよ うな微生物を感染させ、そして寒天上に播種することによって感染した微生物の 数を計数することにより、工程(a)からスクリーニングされたファージをマイク ロ選抜することによって非常に弱く結合するファージを除去する工程；(c)(i)aP L抗体でマイクロプレートのウェルを被覆すること、(ii)被覆されたウェル中で 工程(b)のマイクロ選抜によって同定された最も強く結合するクローンをインキ ュベートし、そして結合していないファージを洗い流すこと、(iii)比色ELISAア ッセイにおいて酵素結合したヤギ抗ファージ抗体を使用して抗体に結合したフ ァージの数を定量することによる、ファージ捕獲ELISAを介する評価によって、( b)で回収された最も強く結合するクローンを決定する工程、および、いくつかの 等しい強さで結合するクローンが同定される場合は、(d)最も強く結合するファ ージ捕獲ELISAクローンでのファージELISA、の追加の繰り返し。 これについては、本発明は、aPL抗体媒介疾患にかかっているヒトから単離さ れたaPL抗体を特異的に結合するエピトープのアナログを同定する方法を包含し 、この方法は以下の工程を包含する：(a)ファージランダムペプチドライブラリ ーを調製する工程；(b)aPL模倣エピトープを同定するためにaPL抗体でこのライ ブラリーをスクリーニングする工程であって、このスクリーニングが、(i)生物 選抜によってこのライブラリーをスクリーニングすること；(ii)(i)での生物選 抜により単離されたファージをマイクロ選抜によってさらにスクリーニングする こと；および(iii)(ii)で回収されたaPL抗体高親和性結合ペプチドを含むファー ジをイムノアッセイによって同定すること、を包含する工程。 本発明はまた、aPL抗体に結合するペプチドを同定および単離するためにファ ージランダムペプチドライブラリーを生物選抜する方法を包含し、この方法は以 下の工程を包含する：(a)アフィニティー精製したaPL抗体を、ランダムペプチド インサートを有するファージと反応させる工程；(b)aPL抗体に結合するランダム ペプチドインサートを有するファージを回収する工程；(c)(b)で回収されたファ ージで微生物を感染させる工程；および(d)ファージを単離するために抗生物質 含有培地中で感染微生物を培養する工程。 本発明はさらに、aPL抗体への高い結合親和性を有するペプチドを同定および 単離するためにファージランダムペプチドライブラリーをマイクロ選抜する方法 を包含し、この方法は以下の工程を包含する：(a)ランダムペプチドインサート を有するファージを生物選抜によって単離する工程；(b)プロテインＧに結合し たaPL抗体で被覆されたマイクロプレートウェル中で、工程(a)で回収されたファ ージをインキュベートする工程；(c)結合していないファージを除去するために マイクロプレートウェルを洗浄する工程；(d)結合したファージを溶出する工程 ；および(e)(d)で回収されたファージで微生物を感染させる工程；および(f)フ ァージを単離するために、抗生物質含有培地中で感染微生物を培養する工程。 本発明はまた、イムノアッセイがファージ捕獲ELISAである上記の方法を包含 し、この方法は以下の工程を包含する：(a)aPL抗体で被覆されたマイクロプレー トウェルでのマイクロ選抜によって単離されたランダムペプチドインサートを有 するファージをインキュベートする工程；(b)結合していないファージを洗い流 す工程；(c)ウェル中で酵素標識した抗ファージ抗体をインキュベートする工程 ；(d)結合していない酵素標識した抗ファージ抗体を洗い流す工程；(e)比色基質 を添加する工程；および(f)高親和性結合ファージを同定するために基質の吸光 度を測定する工程。 本発明はまた上記方法を包含し、そしてさらに高親和性結合ファージのさらな るファージ-捕獲ELISAアッセイを行う工程を包含し、この工程は以下の工程を包 含する：(a)マイクロプレートウェル上に均一量のファージを被覆する工程；(b) ウェル中でaPL抗体をインキュベートする工程；(c)結合していない抗体を洗い流 す工程；(e)酵素標識した抗aPL抗体を結合aPL抗体とインキュベートする工程；( f)結合していない酵素標識した抗aPL抗体を洗い流す工程；(g)比色基質をウェル に添加する工程；および(h)ファージの相対的結合親和性を測定するために基質 の吸光度を測定する工程。 本発明はまた、イムノアッセイがコロニーブロットイムノアッセイである上記 の方法を包含し、この方法は以下の工程を包含する：(a)寒天含有培養培地の上 のニトロセルロースメンブラン上で、ランダムペプチドインサートを有するファ ージで感染した微生物を培養する工程；(b)寒天含有培養培地の上の第２のニト ロセルロースメンブラン上で微生物をブロッティングすることによって、(a)で 培養された微生物を複製転写する工程；(c)転写した微生物をインキュベートす る工程；(d)微生物を溶解する工程；(e)リゾチームで微生物を消化する工程；(f )ゼラチン溶液でメンブランをブロックする工程；(g)メンブランをaPL抗体とイ ンキュベートする工程；(h)結合していないaPL抗体を洗い流す工程；(i)酵素標 識した抗aPL抗体をニトロセルロースメンブランとインキュベートする工程；(j) 結合していない酵素標識した抗aPL抗体を洗い流す工程；(k)比色基質を添加する 工程；および(l)高親和性結合ファージを同定するために基質の吸光度を測定す る工程。 aPL抗体媒介疾患にかかっているヒトから単離されたaPL抗体を特異的に結合す るエピトープを、親和性結合特徴について、アッセイおよびランク付けする方法 も包含し、この方法は以下の工程を包含する：(a)マイクロタイトレーションプ レートのウェルをカルジオリピンで被覆する工程；(b)カルジオリピンに結合し 、そしてプレートのウェルへの非特異的結合を防ぐために、β₂-GPIの供給源と して成熟ウシまたはヒトの血清を添加する工程；(c)所定の時間、モノマーアナ ログおよび高力価のaPL抗体の溶液をインキュベートする工程；(d)aPL抗体／ア ナログ混合物をマイクロタイトレーションプレートのウェルに添加し、そして所 定の時間インキュベートする工程；(e)結合していないaPL抗体を洗い流すために ウェルを洗浄する工程；(f)標識（例えば、酵素）と結合した抗ヒトIgGをプレー トのウェルに添加し、そして所定の時間インキュベートする工程；(g)結合して いない抗ヒトIgG結合体を洗い流すためにウェルを洗浄する工程；(h)標識した結 合体に対する基質を添加し、そして所定の時間、基質／標識反応を展開させる工 程；(i)ウェルに結合したaPL抗体の量を定量するために、基質／標識反応の最終 産物を測定する工程；(j)もしあるならば、aPL抗体へのアナログの親和性を決定 するために、aPL抗体の結合の阻害の割合を算出する工程。 本発明はまた、aPL抗体媒介疾患にかかっている疑いのある被験体から得られ た体液中のaPL抗体の存在を決定するための診断イムノアッセイを包含し、これ は以下の工程を包含する：aPL抗体を特異的に結合するエピトープのアナログと 体液のサンプルを接触させる工程、およびaPL抗体が体液中に存在するかどうか を当該分野で周知の方法によって決定する工程、および、もし存在するならば、 体液中に存在するaPL抗体の量を定量する工程。１つのこのようなイムノアッセ イは以下の工程を包含する：(a)aPL抗体を特異的に結合するエピトープのアナロ グでマイクロタイトレーションプレートのウェルを被覆する工程；(b)結合して いないアナログを洗い流すためにウェルを洗浄する工程；(c)体液の試験サンプ ルをウェルに添加し、そして所定の時間インキュベートする工程；(d)結合して いない試験サンプルを除去するためにウェルを洗浄する工程；(e)標識が結合し た抗ヒトIgGをプレートのウェルに添加して、そして所定の時間インキュベート する工程；(f)結合していない抗ヒトIgG結合体を洗い流すためにウェルを洗浄す る工程；(g)標識した結合体に対する基質を添加し、そして所定の時間、基質／ 標識反応を展開させる工程；(h)試験サンプル中の抗aPL抗体の存在を決定するた めに、基質／標識反応の最終産物を測定する工程。イムノアッセイが定量的であ る上記の診断イムノアッセイもまた包含される。 ファージELISAアッセイは、以下の工程からなる：(i)マイクロタイトレーショ ンプレートのウェル上に種々のクローンの均一量を被覆する工程、次いで(ii)抗 体をウェルに添加することによって最も強くaPL抗体を結合するペプチドインサ ートを同定し、そして酵素標識した抗ヒトIgG結合体との反応を展開させる工程 。ファージELISA、コロニーブロット、またはファージ捕獲ELISAによって測定さ れるようなaPL抗体への高い結合親和性を有するファージによって示されるラン ダムペプチドは、aPL特異的エピトープのアナログを示す。次いで、これらのペ プチドを合成し、そして競合アッセイを使用して結合の強さをランク付けする。 本発明の他の局面は、aPLエピトープが結合するＢ細胞に特異的に結合するaPL 抗体結合性アナログである。最適化されたアナログは、１つまたは複数のＴ細胞 エピトープを欠失する。 本発明のさらに他の局面は、aPL免疫原に対して特定のＢ細胞寛容を誘導する ための組成物であり、これは、非免疫原性原子価プラットホーム分子と、(a)aPL 免疫原が結合するＢ細胞に特異的に結合し、そして(b)１つまたは複数のＴ細胞 エピトープを欠失するaPL抗体結合アナログ、との結合体を含む。 図面の簡単な説明 図１は、成熟ウシ血清の代わりに魚ゼラチンの使用が、市販のaPL抗体標準品 のELISA分析において全ての抗カルジオピリン(ACA)活性を完全に消失させたこと を示す。この結果は、ACAの標的エピトープを決定する際のβ₂-糖タンパク質Ｉ （β₂-GPI）の重要性に関するMcNeilら（前出）およびGalliら（前出）の発見を 支持する。 図２は、樹脂に結合したアナログ5A12が、免疫特異的に、ACA-6501と特定され るアフィニティー精製されたIgGと結合することを示す。 図３は、ACA-6626を用いてスクリーニングして得られたaPL抗体結合アナログ が、aPL抗血清には結合するが、標準血清に結合しなかったことを示す。 図４はまた、ACA6501/5A12アナログが、免疫特異的にACA-6501抗血清に結合し 、ACA-6626と交差反応することを示す。 図4および５は、本発明における方法でスクリーニングされて得られたACA6501 /5A12およびACA6626/4D3のaPL抗体結合アナログが、スクリーニング抗体に優先 的に結合する一方、かなりの程度の交差反応が検出されたことを示す。 図6は、ACA-6501 aPL抗体に対するGPL値の計算方法を示す。 図7は、アフィニティー単離されたACA-6501とGPL標準血清との活性の比較を示 す。 図８は、4回の生物選抜（biopanning）により単離されたクローンの配列の多 様性が、急激に減少していることを示す。 図9は、試験された全てのクローンが通常のIgGに対して反応を示さなかったに もかかわらず、ACA-6635を用いたファージ捕獲ELISAで、3つのクローン(3A12、3 B3、3A5)が非常に強い免疫特異的なシグナルを呈したことを示す。 図10は、ACA-6501を用いたファージELISAにおいて、7つのクローンが強いシグ ナルを呈したことを示す。 図11は、ペプチド5A12、CB2、および3B10で得られた、ACA-6501を用いた競合 結合ELISAの結果を示す。50％阻害するために、0.08μgのCB2および0.5μgの3B1 0が必要であったにもかかわらず、0.16μgのペプチド5A12は、ACA6501 aPL抗体 の、ポリスチレンマイクロプレートウェルに結合した4価のペプチドACA6501/3B1 0への結合を50％阻害した。 図12は、修飾ACA6641/3G3アナログの活性の比較を示す。 図13は、ACA-6501 aPL抗体を用いた競合結合ELISAにおけるペプチド139、142 および143の50％阻害値は、それぞれ6.9、0.7および0.9μgであったことを示す 。 図14は、ペプチド3B10の位置3、9、および3と9との両方におけるα-Me-Proの 置換効果を示す。位置9でのα-Me-Proの置換効果は“天然”ペプチドと比較し、 ペプチド活性が４倍増加した。 図15は、ペプチド6641/3G3(LJP688)が、9つのアフィニティー精製されたACA抗 体と高い交差反応があることを示す。 図16および17は、100、20、および4μMのLJP685-MTU-DABA-PEG結合体(化合物3 6)およびLJP685-ATU-MTU-AHAB-TEG結合体(化合物35)を用いて、LJP685-KLHで免 疫したマウスの脾臓細胞を各2時間インキュベートした後、LJP685-KLHで免疫し たマウスの脾臓細胞を用いる10⁸Mでの抗685抗体ABCの用量依存的減少を示す。 図18は、ペプチド925に関して解明された9つの構造のうち、最も中心に近いNM R構造を示しており、ペプチド925分子の形態の合理的説明である。 図19は、ペプチド925(図の下部に3G3と標識)の構造とペプチド5A12の構造とを 比較する。両ペプチドとも、ペプチド配列中のほぼ同じ位置にターンを持つ。 図20Aおよび20Bは、aPLアナログの薬剤伝達物が1つの小さな疎水基および正に 荷電した基として試験的に同定されたことを示す。図20Aに示すように、ペプチ ド925のgem-ジメチル基およびアミノ基は、このペプチドの薬剤伝達物と試験的 に同定される。薬剤伝達基を特定の骨格につなぐ炭化水素リンカーの長さを、こ れらのリンカーが骨格に結合する位置を隔てる距離と同様に図20Aで特定する。 本発明を実施する態様 Ａ． 定義 本明細書中で用いる用語“aPL抗体”は、疾患を媒介するβ2-GPIに特異的に結 合するあらゆる抗体を意味する。 本明細書中で用いる用語“Ｂ細胞アネルギー”は、抗体を産生および分泌する のにＴ細胞の助けを必要とするＢ細胞の非応答性を意図しており、そして、制限 されることなく、未成熟および/または成熟Ｂ細胞のクローンの欠損および/また はＢ細胞の抗体産生の不能を含む。 “非応答性”は、免疫原に対する体液性応答の治療学上の効果的な減少を意味 する。量的には、この減少（抗体産生の減少により測定される）は少なくとも50 ％、好ましくは少なくとも75％、および、最も好ましくは100％である。 “抗体”は、Ｔ細胞に依存する抗体を意味する。 本明細書中で用いる用語“免疫原”は、aPL抗体を含む体液性免疫応答を誘発 する物質を意味する。免疫原はＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとの両者を 持つ。aPL抗体が媒在する病理に関係するaPL免疫原は、外部の（個体にとって外 来の）免疫原（例えば、それには、治療用のタンパク質、ペプチドおよび抗体な どの個体にとって外来の天然の生体物質を含む薬物）、または、抗体が媒介する 凝固能亢進（発作）に関連したものなどの自己免疫原であり得る。 免疫原の“アナログ”という用語は、(ａ)免疫原が特異的に結合する抗体に特 異的に結合する分子、および（ｂ）Ｔ細胞エピトープが欠損する分子、を意味す る。アナログは、通常、免疫原の断片または誘導体であり、従って、免疫原と同 じ化学的クラスにある（例えば、免疫原がポリペプチドであり、アナログもポリ ペプチドである）が、化学的類似性は不可欠ではない。従って、アナログは、そ れが上記の（ａ）および（ｂ）の機能的特徴を有する限りは、免疫原と異なる化 学的クラスであり得る（例えば、免疫原が炭水化物であり、アナログはポリペプ チドである）。アナログは、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ多糖、核酸または 他の生化学物質であり得る。さらに免疫原またはアナログのどちらの化学的構造 は、本発明のために定義される必要は無い。 免疫原の“アナログ”という用語はまた、“ミモトープ”という用語を含む。 “ミモトープ”という用語は、抗体が免疫原に結合するのを競合的に阻害する分 子を意味する。抗体に特異的に結合するために、ミモトープは免疫原の抗原決定 基に似ていると考えられている。 本明細書中で用いる“原子価プラットホーム分子（valency platform molecul e）”は、控えめな数の免疫原アナログの結合を促進する部位を含む非免疫性分 子を意味する。 本明細書中で用いる“非免疫性”とは、原子価プラットホーム分子を述べると きに用いられ、原子価プラットホーム分子が、それが単独で個体に投与されたと きに、実質的に免疫応答を誘発しないことを意味する。 本明細書中で用いる“個体”は、ほ乳動物種の一員を示し、そしてヒト、霊長 類、マウス、およびウシや羊のような家畜、馬のようなスポーツ動物、ならびに 犬および猫のようなペットを含む。 本明細書中で用いる“薬剤伝達物（pharmacophore）”は、aPLアナログの抗体 標的への結合に関与する中心的な基の、三次元の配向と化学的性質を意味する。 Ｂ． aPLの抗体結合アナログの同定 aPL抗体結合アナログは、候補分子をスクリーニングすることにより、それら が（ａ）aPL抗体に特異的に結合するか、および（ｂ）Ｔ細胞エピトープが欠損 しているかどうかを、決定することにより同定され得る。aPL抗体への特異的な 結合は、以下の実施例に記すELISAアッセイのような日常的イムノアッセイを用 いて決定され得る。さらにＴ細胞エピトープが存在するか、欠損しているかを、 同様に、実施例に記した日常的Ｔ細胞活性化アッセイで決定し得る。この点から 、血清抗体に“特異的に結合”するアナログは、免疫原に対して、例えば10⁷Ｍ^{- 1} の適度な親和性を示す。Ｔ細胞エピトープが存在するか、欠損しているかを、 米国特許出願第08/118,055号に開示されているトリチウム化チミジン取り込みア ッセイを用いて決定し得る。Ｔ細胞エピトープの存在はまた、Ｔ細胞由来のリン ホカインの分泌を当該分野で周知の方法で測定することによって決定され得る。 バックグラウンドよりも統計学的に有意のチミジン取り込みを誘発しいないアナ ログは、Ｔ細胞エピトープが欠損していると考えられる。チミジンの取り込み量 は免疫原と共に変化し得る、と認識されている。典型的には約2〜3、より一般的 には約1〜2より低い刺激指数が、Ｔ細胞エピトープが欠損していることを示す。 Ｃ． 結合体の調製 aPL抗体結合アナログを非免疫性の原子価プラットホーム分子と結合させるこ とにより、本発明の結合体を調製する。好ましい原子価プラットホーム分子は、 生物学的に安定しており、すなわち治療効率を上げるために、生体内で、数時間 〜数日〜数ヶ月の排出半減期を有し、そして、規定された組成の合成一本鎖で形 成されることが好ましい。それらは典型的には、約200から約200,000の範囲の分 子量を持っており、通常は約200から約20,000である。本発明における原子価プ ラットホーム分子の例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ-D-リジン 、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンのようなポリマーが挙げら れる。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)に基づき、約200から 約8,000の分子量を有する。 本発明での使用に適した他の原子価プラットホーム分子は、化学的に規定され た非ポリマー性重合体の原子価プラットホーム分子であり、これは、共同に係る 、同時係属中の米国特許出願第08/152,506号(1993年11月15日出願)に開示され、 その全体が本明細書中で参考として援用される。本発明での使用に適した、特に 好ましい均一の化学的に規定された原子価プラットホーム分子は、2,2'-エチレ ンジオキシジエチルアミン(EDDA)およびトリエチレングリコール(TEG)の誘導体 である。 更なる適した原子価プラットホーム分子には、テトラアミノベンゼン、ペプタ アミノβシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリトリトール、1,4,8,11- テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)、および1,4,7,10-テトラアザシクロド デカン(Cyclen)が含まれる。 aPL抗体結合アナログの原子価プラットホーム分子への結合は、種々の要因に よって影響され得るが、典型的には１つまたはそれ以上の架橋剤およびアナログ と原子価プラットホーム分子上の官能基とが関与する。 ポリペプチドアナログは、アナログをキャリアーと結合させる為の部位として 作用するアミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基のような官能基を 含むアミノ酸側鎖部分を含む。アナログがこれらの官能基を持っていない場合、 このような官能基を持った残基をアナログに加え得る。このような残基は、ペプ チド合成分野で周知の、固相合成法または組み換え法によって導入され得る。炭 水化物または脂質のアナログの場合、機能的なアミノ基およびスルフヒドリル基 は、従来の合成により導入され得る。例えば、一級アミノ基はシアノ水素化ホウ 素ナトリウム存在下でエチレンジアミンを用いる反応により取り込まれ、そして 、スルフヒドリル基は、システアミン二塩酸塩での反応の後、標準的なジスルフ ィド還元剤で還元することにより導入され得る。原子価プラットホーム分子もま た、適切な官能基を既に持っていない場合には、類似した方法で官能基を持つよ うに誘導体化され得る。 様々な長さの親水性のリンカーは、ペプチドまたは他の生物活性分子を原子価 プラットホーム分子に結合するのに有用である。適切なリンカーとしては、エチ レングリコールの線状オリゴマーまたはポリマーが含まれる。このようなリンカ ーは、R¹S(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O(CH₂)_mCO₂R²という形のリンカーを含む。ここで、n =0- 200、m=1または2、R¹=Hまたはトリチルのような保護基、R²=Hまたはアルキルま たはアリールであり、例えば4-ニトロフェニルエステルである。これらのリンカ ーは、ハロアセチル，マレイアミド等のようなチオール反応性基を含む分子を、 チオエーテルを介して、アミド結合を介したアミノ基を含む第二の分子に結合さ せるのに有用である。これらのリンカーは結合順序に関しては柔軟性があり、即 ち、チオエーテルは最初または最後に形成され得る。 結合体は、通常、注射による投与のための調製される（たとえば、腹腔内、静 脈内、筋肉内、皮下）。従って、それらは、典型的には、生理食塩水、リンゲル 溶液、デキストロース溶液などのような、薬学的に受容可能なビヒクルと一緒に される。結合体は、通常、処方物重量の約0.01％から10％を構成する。結合体は 、個体に対して“治療有効量”、すなわち、関与する免疫原に対するＢ細胞アネ ルギーを産生し、そして問題となっている抗体が媒介した状態の予防、改善また は排除を達成するのに十分な量が投与される。特定の投薬措置、即ち、用量、タ イミング、反復回数は、特定の個体とその個体の医療履歴とに依存する。通常、 投与量は、約1μgから約100mg結合体/kg体重、好ましくは約100μgから約10mg/k g体重を一週間に与える。他の適切な投与計画は、毎日、週三回、または週一回 、または二週間から四週間に一回、または一月に一回、または個体や疾患に応じ た、より低頻度のスケジュールである。通常、Ｂ細胞の代謝回転率によって時機 が決められる反復投与が、体液性アネルギー状態を達成および/または維持する のに必要とされ得る。このような反復投与は、典型的には、抗体価の増加が検知 された場合、約1μgから約10mg/kg体重またはそれ以上を、30から60日毎、また はより短い間隔での処置を必要とする。あるいは、いくつかの病理では、結合体 の連続的徐放性の処方が示唆され得る。当該分野では、徐放性を達成するための 様々な処方およびデバイスが知られている。 抗ヘルパーＴ細胞処置は結合体と共に投与され得る。このような処置は、通常 ステロイドまたはシクロスポリンのようなＴ細胞を抑制する薬剤を使用する。 Ｄ． aPL抗体の抗原の性質 本発明者によるaPL抗体についての初期の研究は、これらの抗体により認識さ れる抗原部位の性質について追求した報告と一致していた。当初は、これらの抗 体は、VDRL試験で検知された抗体と同様にカルジオリピン分子を認識すると考え られた。図１に示すように、抗カルジオリピン抗体(ACA)固相ELISAにおいて、成 熟ウシ血清を魚ゼラチンに置換した場合、ACA標準として商業的に入手できる抗 体調製物の全てのACA活性を消失させた。この発見は、McNeilら（前出）およびG alliら（前出）によって提案されたように、ACA抗体がカルジオリピンそのもの より、むしろ、血清の決定基を認識することを示した。このタンパク質は、これ らの著者によってβ₂-GPIであることが示された。従って、“ACA”または“抗カ ルジオリピン抗体”という用語は、本来は誤称であるが、今日これらの抗体につ いて言及する際はまだ使用されている。 自己免疫性のIgG aPL抗体の多くは、β₂-GPI分子上の決定基を認識する。これ らのエピトープは、カルジオリピンへの結合の際にのみβ₂-GPI上で形成または 露出され得る(ネオエピトープ)。あるいは、β₂-GPI上のエピトープは、β₂-GPI 分子あたり1コピー存在し得、aPL抗体に対して低い親和性を持たない可能性があ る。カルジオリピンへの結合によって隣接するβ₂-GPI分子上のこれらの部位が2 つ並ぶことによってのみ、抗体−抗原相互作用を維持するのに十分な親和力が生 じ得る。 天然β₂-GPIのエピトープを模倣する本発明におけるaPLアナログの核磁気共鳴 (NMR)解析から、β₂-GPIエピトープの構造に関する更なる情報が得られた。例え ば、aPL抗体と高度に交差反応的である２つのペプチドaPLアナログのNMR溶液構 造の比較から、どちらのペプチドもペプチド配列のほぼ同じ位置にターンを持つ ことが分かった(図18および19を参照)。 Ｅ． ACA ELISA 臨床サンプルのGPL評価ならびに研究抗体およびβ₂-GPIのクロマトグラフィー による精製に関連して、大規模での試験の必要性は、aPL抗体のELISAアッセイの 開発に繋がり、その機能は市販のキットと非常に一致し、そして、最も良い再現 性を持つと分かっている設計に類似する（Redder、前出）。 Ｆ． aPL抗体の免疫アフィニティーによる精製 aPL抗体を単離するために、複数のラメラ状の、カルジオリピン含有分散物（ リポソーム：コレステロールおよびジセチルホスフェートも含む）をaPL血漿（ または血清）と共にインキュベートする。これらのリポソームは遠心分離によっ て血清からペレット化される。洗浄後、リポソーム混合物を２％オクチルグルコ シド界面活性剤により破砕し、プロテインA-アガロースカラムに供した。十分な 洗浄の後、まず脂質を除去し、次に非IgG成分を除き、IgG aPL抗体を穏やかな酸 でプロテインAから溶出し、中和し、緩衝液交換を行い、ACA ELISAアッセイを行 った。この手法により、aPL抗体は10,000倍に濃縮され、ウサギIgG抗ヒトβ₂-GP I抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって示されるように、β₂-GPIは 全く混入しない。 Ｇ． 繊維状ファージランダムペプチドライブラリーの構築 p-IIIタンパク質の11の異なるfUSE5繊維状ファージランダムペプチドライブラ リー（ファージあたり5コピーのペプチドのp-III）を構築する。これらのライブ ラリーは、模倣エピトープを発見するための広大な配列の形態と構造を提供する 。「ｘ」ライブラリーと命名された４つのライブラリーは、それぞれ、8,10,12 および15残基の長さのペプチドインサートを有し、アミノおよびカルボキシルの 両末端のプロリン残基が隣接している。これらのプロリン残基の目的は、天然の p-IIIタンパク質から生じ得る二次構造への寄与を無くすこと、およびインサー トを溶媒に露出することである。「ｙ'」ライブラリーは、長さが6,7,8,9,11お よび13アミノ酸であるシステイン結合のインサートを含む。「ｙ」ライブラリー は、「ｙ'」ライブラリーの6および8アミノ酸のインサートが無いことを除けば 、「ｙ'」ライブラリーと同じである。「ｙ」および「ｙ'」の両ライブラリーの これらのペプチドインサートは、環状で、より強固な構造を形成するためにアミ ノおよびカルボキシルの両末端にシステイン残基が隣接する。プロリン残基は、 先に述べた「ｘ」ライブラリーの場合と同様の理由により、これらのシステイン 残基の外側に組み込まれる。「ｘ」、「ｙ'」および「ｙ」ライブラリーは、天 然のp-IIIタンパク質のアミノ末端から5残基の所に位置している。「ｚ」ライブ ラ リーは、p-IIIタンパク質のアミノ末端に位置するランダムな8アミノ酸のインサ ートからなっており、隣接するプロリンまたはシステイン残基を含まない。「ｘ 」、「ｙ’」および「ｚ」ライブラリーの組み合わせは、約1億の異なったペプ チドインサートを、それぞれが有する11の異なったライブラリーを表す。 これらのライブラリーは、所望の長さのインサートを与えるのに適した長さの ランダムなオリゴヌクレオチド配列を、標準的な分子生物学の技術を用いてfUSE 5のp-III遺伝子に取り込むことにより構築される。fUSE5 DNAの制限エンドヌク レアーゼ処理に続き、ギャップ二重鎖として提供されるキナーゼ処理した過剰の オリゴヌクレオチドを加え、連結する。その後、DNAを電気穿孔法を用いてE．co liに導入し、テトラサイクリン含有培地で培養することにより選択する。この培 地からのファージ（ペプチドインサートを含む）を上清より単離し、洗浄後、緩 衝液中に再懸濁する。典型的なライブラリーは、7×10⁸の独立なクローンを8×1 0¹²形質転換単位/mlで持つことが示された。 Ｈ． ファージスクリーニングの方法論 ファージ提示ペプチドライブラリーのスクリーニングの本質は、何十億かの潜 在的な候補ファージを、目立った性質を有する比較的少数にする能力にある。元 のスクリーニングプロトコルは、Scott,J.KおよびG.P.Smith,(1990)Science 249 :315-324により推奨されるが、様々なaPL抗体の最良エピトープの選択を促進す るように、かなり改変されている。これらの手法は、最良の配列を提示する有用 な数のクローンが徹底的に調査される得る時点に達するまで、スクリーニングが 進行されるように、より大きなストリンジェシーの選択を行うように設計される 。いくつかの抗体に対しては、ライブラリーは非常に強く結合するアミノ酸配列 を持たないように思われ、そして高い程度のストリンジェンシーをもつ方法をス クリーニングに用いると、特異的なクローンがなくなってしまう。これに対して 、ライブラリーは、抗原の良好なアナログを示す多くのクローンをしばしば生じ 、そして高い程度のストリンジェンシーを有する方法の使用は最良のエピトープ を同定するのに必要となる。このことから、エピトープライブラリーのスクリー ニングから最良のエピトープを同定するために、種々の程度のストリンジェンシ ー を有するアッセイが開発された。ここに、それらのアッセイをストリンジェンシ ーの増大する順に示す：生物選抜＜マイクロ選抜＜ファージ捕獲ELISA＜ファー ジELISA＝コロニーブロット＝ペプチドELISA。 (i)生物選抜（Biopanning） ”生物選抜”は、アフィニティー精製されたaPL抗体および任意のペプチドイ ンサートを保持するファージを混合し、その後、抗体特異的な回収により結合フ ァージを捕獲する技術である。ファージはE.coliにテトラサイクリン耐性を与え るので、E.coliをテトラサイクリンを含む培地で培養し、そして単離する。生物 選抜を何度も行うことにより、サンプル中の免疫特異的なファージの数を増加さ せる。ファージは、3回目から5回目の選別の最後に常に回収されるが、それらは 選別している抗体に対して低い親和性で非特異的に結合した配列しか持たないか もしれない。これらのファージについてさらに評価する方法(マイクロ選抜)が必 要である。 (ii)マイクロ選抜（Micropanning） ファージのaPL抗体に対する結合の相対的な強さを見積もることは、“マイク ロ選抜”によって決定することができる。マイクロ選抜は、3回あるいはそれ以 上の生物選抜の後に実施され、そして生物選抜法で用いたのと同じ抗体を用いる 。方法は、生物選抜の最後の回で得られたファージの希釈、およびマイクロ選抜 による50あるいはそれ以上のこれらのクローンの分析から成る。マイクロ選抜は 、それぞれのクローンを同じくらいの密度まで増幅させた後、前もって一定量の 抗体で被覆したマイクロタイトレーションのウエル内で最適単一濃度で希釈した ファージをインキュベートすることによって達成される。ファージの最適単一濃 度は、最も広い範囲のマイクロ選抜のスコア(0から4+)を最も示しそうな濃度に より、試験中のクローンについて最大限の識別が行えるようにする濃度である。 それは、一連の希釈によって得られた数種のファージ濃度のそれぞれにおいて、 スコアが決定される場合、任意に選ばれた6個のクローンのマイクロ選抜の挙動 に基づく。抗体とインキュベートした後、非結合ファージを洗い流し、結合した フ ァージ量が、ファージのインサートの抗体に対する親和性の指標となる。結合し たファージの量を、穏やかな酸で溶出した後に中和し、E.coliに感染させて決定 する。感染したE.coliの数は、テトラサイクリンを含む寒天培地に微生物を塗り 、各クローンについて達成されたコロニーの密度により定量化される。 (iii)ファージ捕獲（Phage-Capture）ELISA ファージ捕獲ELISA試験は、相対的に低いストリンジェンシーを持つマイクロ 選抜アッセイと高いストリンジェンシーを持つファージELISAあるいはペプチドE LISAアッセイとの間をつなぐ中間的なアッセイとして開発された。予備実験では 、いくつかの抗体の調製に際しては、マイクロ選抜を用いると陽性クローンが多 すぎるが、ファージELISAあるいはペプチドELISAを用いると全くそれが得られな いことが示される。ファージELISAの限界を以下に示すが、5コピーのp-IIIのみ が各ファージに存在し、そして多数のファージを用いてウエルを被覆したとして も、インサートの産物はわずかしかなく、そして検出のためにインサートに対し て非常に高い親和性をもつ抗体が必要となる。ファージ捕獲ELISAを用いれば、 シグナルが何度も増幅されるので、抗体およびインサートの間のより低い親和性 の安定した相互作用の検出を容易にする。 ファージ捕獲ELISAは、次の工程から成る。マイクロタイトレーションウエル をaPL抗体で被覆し、そしてマイクロ選抜アッセイと同ようにファージクローン を加える。非結合ファージを洗い流し、結合ファージの量をファージの主要コー トタンパク質に結合する酵素結合ヤギ抗血清を用いて定量する。ファージ捕獲EL ISAによってスクリーニングされたファージは、多くのaPL抗体と反応し、その後 のELISAアッセイにおいて強いシグナルを示す。マイクロ選抜陽性ファージは、 ファージ捕獲ELISAにおいてほとんど陽性ではないので、この中間的な感度のレ ベルはペプチド合成の試みをより大きく効率的にする。結果として、ファージ捕 獲ELISAによって得られた陽性ファージから合成されたペプチドは、一般的に免 疫反応性を示す。 (iv)ファージELISA このファージ選択法は、インサートとスクリーニング抗体との非常に強い結合 を必要とする。マイクロタイトレーションプレートのウエルを直接ファージで被 覆し、スクリーニング抗体を加えてインキュベートする。洗浄して非結合抗体を 除いた後、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ結合体を加えると、これがファー ジに結合したaPL抗体と結合する。aPL抗体は、当該分野で周知の方法に従ってア ルカリホスファターゼと反応する発色基質をウエルに加えることにより、検出さ れる。 (V)コロニーブロット このアッセイは、生物選抜で選別されたファージに感染させたE．coliの大規 模でのコロニースクリーニングを可能にする。この手法は、免疫反応性クローン の同定として、ファージELISAに代わるものであり、同等の感度を示し、試験に 先だって各々のファージクローンを培養する必要もない。このアッセイでは、１ 回の生物選抜により得られたファージを感染させたE.coliを、大きな直径のニト ロセルロース(NC)メンブレンに塗り広げ、テトラサイクリンを含む寒天培地上で 一晩培養する(Barbasら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982)。それぞ れのコロニーは、同一の配列を持ったファージによる感染から生じる。このNC“ マスター”を用いてNC上にブロットを移していくつかのの複製を作り、そして寒 天培地上で培養を行うことができる。次に化学的および酵素的にブロット上のフ ァージ感染コロニーを破壊すれば、一般に用いられているウエスタンブロッティ ングの技術（すなわち、染色およびイムノブロッティング）により、ファージは プローブされ得る。ブロックされたブロットをスクリーニングaPL抗体とともに インキュベートすることもできる。非結合抗体を洗い流した後、抗ヒトIgG西洋 ワサビペルオキシダーゼ結合体を加えて、ファージと結合したaPL抗体に結合さ せる。発色基質を加えることによって、以後の研究でクローニングされ得る免疫 特異的なファージを提示するマスタープレート上の別々のコロニーの位置を特定 し得る。 (vi)ペプチドELISA これまでに述べたアッセイで最もよく反応するファージのペプチドインサート の配列を決定するDNA配列決定後に、対応するペプチドを当該分野で周知の標準 的なFmocペプチド化学を用いて作製する。ペプチドELISAアッセイに対しては、 例えば、ペプチドは枝分れした4価分子として作製され得る、すなわち各分子は ４コピーのインサートを有する。そのような分子でマイクロタイトレーションプ レートのウエルを被覆し、そしてエピトープを溶液に曝し、抗体を結合させる。 4価ペプチドは、最初の２つのカップリングで分岐点としてリジンの取り込みに よって合成され、この方法は、多元抗原ペプチド(MAPS)に対して使われた方法(P osnettら(1988)J.Biol.Chem.263：1719-1725)と類似する。グリシン-セリン-グ リシン-セリンから成るスペーサーをリジンの後の各アームに付加し、さらにフ ァージ内に見出される骨格アミノ酸、カルボキシル末端のプロリン-グリシン、 およびアミノ末端のアラニン-グリシン-プロリンを含むインサートを付加する。 この合成に用いる全てのアミノ酸を、標準的なFmoc法を用いて一度に加える。 これらのペプチドは、次いでマイクロタイトレーションウエルをペプチドで被 覆し、そして標準的なELISAの形式でaPL抗体との反応性をアッセイすることによ り実施されるELISAでアッセイされる。実施において、ペプチドは、通常、元の スクリーニング抗体と非常に強く結合し、そして他のaPL抗体ともいくらかの交 差反応性を示す。非特異的に結合しているペプチドを排除するために、非aPL抗 体のコントロールを含める。 (vii)競合結合ペプチドELISA 一旦ELISA陽性のペプチドを同定したら、それらのaPL抗体に対する相対的結合 親和性を定量し、そして2つのペプチドが、与えられた患者の血清中で同じ数の 抗体に結合するかどうかをペプチド競合ELISAアッセイにより決めることが必要 である。このアッセイでは、様々なモノマーペプチドがマイクロタイトレーショ ンプレートウエルを被覆している4価ペプチドと競合する。アッセイを行うため に、評価の対象となるペプチドは、標準的Fmoc化学合成により、モノマーとして すなわち4価ペプチド合成において使われるリジンによる枝分れのないように合 成する。モノマーペプチドを精製して既知濃度で溶解する。マイクロタイトレー ションプレートウエルを、aPL抗体と結合することがわかっている4価ペプチドで 被覆する。モノマーペプチドの希釈系列を、一定希釈のaPL抗体を加えてインキ ュベートする。aPL抗体の希釈は、4価ペプチドに対する抗体力価測定を行い、力 価曲線の勾配が負になる希釈を選択することにより前もって決定される。抗体と モノマーペプチドとを1時間インキュベートした後、抗体/ペプチド溶液をマイク ロタイトレーションウエルに加え、標準的な比色ELISAを行う。aPL抗体と4価ペ プチドとの結合を低下させる各々のモノマーペプチドの濃度は、各ウエルの比色 計での読み取り値をプロットすることで求められる。50％阻害点がモノマーペプ チドに対する結合の相対的強さの尺度として使われる。 このアッセイの変形は、ヒトβ₂-糖タンパク質Ｉ／カルジオリピン(β₂-GPI/C L)を4価ペプチドの代わりに被覆したマイクロタイトレーションプレートを用い て、β₂-GPI/CL上のエピトープに対するaPL抗体の結合に対するモノマーペプチ ドの阻害能を試験する。このアッセイでは、濃度を最適化したIgG涸渇ヒト血清 をβ₂-GPI源として用いる。プレート基質として4価ペプチドを用いるアッセイと 同様の様式で、最適濃度のaPL抗体と一緒に数種の濃度のモノマーペプチドをイ ンキュベートする。(β₂-GPI/CL)プレートでのaPL/ペプチドのインキュベーショ ンの後、抗体の結合の50％阻害に必要なペプチド濃度を、4価ペプチドを用いた アッセイでの値の1/2の最大値の吸光度で決定する。 (viii)置換および欠失合成による結合に対するアミノ酸の寄与の評価 寛容性誘導に対する所望のエピトープは、できるだけ多くのaPL抗体とのでき るだけ強い相互作用を有するべきであるが、不要な残基を含んでいてはならない 。エピトープの最小構成を推測するために、それぞれのペプチドのアナログを作 製する：(i)所定の残基を欠損するアナログ（例えば、カルボキシル末端および ／またはアミノ末端での骨格残基が欠失される）、または(ii)エピトープライブ ラリーのスクリーニングにおいて見出される配列と異なるアミノ酸置換が行われ たアナログ。これらのアミノ酸置換は、自然なもの（例えば、ロイシンに対して イソロイシン）、あるいは非自然なもの（例えば、プロリンに対してα-メチル プロリン）いずれかであり得る。これらの欠失および／または置換の効果は、次 い でペプチド競合ELISAによって測定される。 (ix)β₂-GPIの第5ドメインの変異誘発によるaPL血清特異性の分類 寛容原が一般に有効であるためには、患者の大部分におけるaPL抗体の大半に それが結合しなければならない。異なる患者から得たいくつかの抗体が、標的エ ピトープを含有すると考えられるβ₂-GPIの84アミノ酸の第5ドメイン中の同一の 残基に結合するかどうかを決めることは重要である。数種の抗体が同一残基に結 合する場合、ペプチドの構造データから誘導される、全ての抗体と反応する単一 のミモトープを設計し得る。それに対して、抗体が異なる残基と結合する場合、 それぞれの抗体に対して特異的な寛容原が必要となる。β₂-GPIの第5ドメイン内 のaPL抗体結合残基内に重要な残基が関与しているかどうかを同定するために、 部位特異的変異誘発を行った。得られた変異β₂-GPIを、数種のaPL抗体との反応 性についてアッセイした。結果は不確実であった。β₂-GPIの第5ドメインとグル タチオンSトランズフェラーゼ(GST)とを含む融合タンパク質が、A.Steinkassere rから得られ、E.coliで発現された(Steinkassererら(1992)FEBS Lett．313: 193 -197)。ACA ELISAでは、この融合タンパク質は天然β₂-GPIとうまく置換された 。アミノ酸置換は、標準的な部位特異的変異誘発を用いて行う。 Ｉ． 合成aPLエピトープの単離 GPLスコアが151(高力価)で、再発性の発作や胎児死亡、狼蒼および３つの大動 脈弁の移植の経歴の患者から得られた抗体ACA-6501を、カルジオリピンリポソー ムでイムノアフィニティーにより精製し、抗体を4つの異なるファージライブラ リーのスクリーニングにおいて使用した：xy、xyz、xy'z、および以前に行った スクリーニングに基づいて７位をアルギニンに固定した特別なpro/cys結合の7-m erライブラリー。表1に示すように、マイクロ選抜を行ったファージにおいて(試 験した140から)36の配列が得られた。これらはかなりの相同性を示し、そして、 6および7位での保存されたDR残基が特に目をひく。コンセンサス配列はCLLLAPDR Cである。この相同性にもかかわらず、ファージELISAの比色試験後、7つのファ ージのみが陽性であった。(表2参照)。アフィニティー精製されたACA-6626(高い が、ACA-6501よりは低い力価の患者由来)を用いてxy'zファージをスクリーニン グすると、ファージELISA試験された5つの独立の配列が得られた。どれも比色陽 性ではなかったが、化学発光基質によりELISA免疫結合体が発色されたとき、2つ が陽性であった。ACA-6626と会合する配列のモチーフは、関連しているようであ るが、ACA-6501により認められたものとは異なる(表3参照)。両抗体は、結合前 の空いた配列を覆うcys結合の(おそらく環状化および束縛された)エピトープを 好んだ。 ^*コンセンサスまたは平均配列に対応する ACA-6644は、本明細書中において示された方法の従い、プールされたp-IIIフ ァージライブラリーをスクリーニングするために使用された別の高力価aPL抗体 である。次の配列が見い出された。 ACA-6644/CBc GILLNEFA ACA-6644/CBd GILTIDNL ACA-6644/CBf GILALDYV これらの配列はすべて、N末端でファージの骨格残基を欠失する“z”エピトープ ライブラリー成分から誘導された。ペプチドとして合成すると、その配列は、AC A-6644およびACA-6501を含む数種のACA血清と免疫反応性を示した。分析の結果 、 表４に示すように、ACA-6501を用いてすでに得ていた配列と疑いのない相同性を 明らかにした。 これらの二つのaPL抗体によってスクリーニングされた非常に異なる二つの源の ライブラリーに由来する集約された配列の相同性は、その配列が、本来の標的抗 原の主要な、おそらくはイムノドミナントな領域の模倣であり得ることを示唆す る。 p-IIIライブラリーのACA-6701によるスクリーニングでは、高い程度の内部の 相同性を有するが、他のaPL抗体を用いて以前に得られたものとは異なる二つの 独特の配列が得られた。配列は、以下に示すとおりである。 ACA-6701/3B1 LSDPGYVRNIFH ACA-6701/3E1 LTDPRYTRDISNFTD 樹脂に結合したペプチドとして、配列は、その親血清(ACA-6701)と強い免疫反応 性を有したが、他のaPL抗体とは最小に交差反応性であった。 アフィニティー精製したACA抗体を用いて任意のp-IIIファージライブラリーの スクリーニングを続行した結果、はじめに試験した9つのアフィニティー精製さ れたACA抗体全てに対してかなりの交差反応性を示すペプチドを見出した。その 後の試験から、AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP688)の配列をもつこのペプチドACA-6641/3 G3は、すでに発見されたどのペプチドよりも最も高い交差反応性であることが決 定された。65個の高力価のACA抗血清に対して試験を行ったところ、6641/3G3(LJ P688)、あるいはその短縮型は、93.8％の血清と高い交差反応性を、3.1％と中程 度の交差反応性を示し、そして交差反応性のないものが3.1％あった。このペプ チドの化学的最適化は、短縮化、系統的なアミノ酸の置換および非ジスルフィド 環化の実験により行われた。 任意のファージライブラリーのスクリーニングにより選ばれた数種のペプチド のモチーフは以下に示す。 Ｊ． アフィニティー精製されたIgG aPL抗体とaPL関連ペプチドとの免疫反応性 アフィニティー精製されたACA-6501を用いて得られ、そしてファージELISA陽 性と認められたファージ配列を、コンビナトリアル（combinatorial）合成ペプ チドライブラリーのために最近開発された固体支持体上で合成し、Rapp樹脂のこ の支持体は、高いペプチド密度を有し、最初のアミノ酸のカップリング前に親水 性のポリエチレングリコールのスペーサーを使用する。合成の結果、抗体結合実 験に理想的に適した樹脂結合のペプチドが得られた。図2に示すように、ペプチ ド5A12(CLILAPDRCの配列)は、非関連のコントロールペプチドを劇的に上回る性 能であったが、普通のIgGとは有意に結合しなかった。同様の結果が、試験した 他のファージELISA陽性のペプチドを用いて得られた。実験で示されたように、 樹脂ペプチド結合のアフィニティー精製されたACA-6501 aPL抗体を免疫結合体呈 色反応により検出した。 Ｋ． aPL血清抗体の合成ペプチドとの反応性 血清を用いて、樹脂結合のペプチドがaPLに免疫特異的に結合できることがわ かり、aPL抗体を試験する能力は大幅に向上した。図3に示すように、ペプチドは 、ACA-6626結合のaPL抗血清を用いるスクリーニングから得られるが、普通の血 清との明確な結合は認められなかった。図３はまた、aPL血清に対するACA6501-5 A12ペプチドの免疫特異的な結合の挙動を示す。ペプチド5A12に対する通常の血 清との結合は無く、データは示さなかった。 Ｌ． ライブラリースクリーニング抗体の供給源でないaPL抗血清に対する合成 ペプチドの交差反応性 aPL血清試験のために二つのペプチドを選択した。一つ(5A12)はACA-6501スク リーニングを表し、もう一つ(4D3)はACA6626スクリーニングを表す。図４と図５ に示すように、それぞれのペプチドは、スクリーニング抗体の元の血清と優先的 に反応した。しかしながら、有意な程度の交差反応性が、特にACA-6501とACA-66 26との間で検出可能であった。GPLのスコアが低いかまたは無い１９の患者血清 、およびGPLが中程度から高い13の病的血清の調査を、5A12樹脂結合ペプチドを 用いて行った。１９のコントロールサンプル中のたった２例だけが低いペプチド 結合を示したのに対して、１３の病的サンプルでは８例の検出可能なペプチド結 合を示した。これらの結果は、合成ペプチドが発作患者の治療において診断また は予後のアッセイに有用であることを明らかにする。 上記のセクションＩで述べたように、合成ペプチド6641/3G3は、いくつかの高 力価のACA抗血清に対して試験された。このペプチドは、図14に示すように、試 験されたACA抗血清の大多数と交差反応することが判った。6641/3G3は、10個のA CA抗体のすべてと用量依存的な交差反応性を示し、1.8mg/mlで完全に阻害（〉80 ％）し、そしてこれらは、以下の表５に表したように、ACA抗体に対して特異的 であった。 ＲＳ＝再発性発作 ＲＦＬ＝再発性胎児死亡 Ｍ． 新しいペプチド合成方法論 aPLライブラリースクリーニングによる新たな候補配列の同定には、新たに合 成したペプチドを抗体の結合について試験することが必要であった。既知のペプ チドの代用のRapp樹脂を用いて、飽和結合アッセイのような定量的な結合研究、 および放射能標識したaPL IgGを用いる平衡測定を行うことが可能である。 ペプチドの合成は、選択的合成によるミモトープの分子的分割を可能にする。 これは、抗体結合を高める目的で鎖に沿う各アミノ酸の改変を含む。選択的合成 は、配列中のそれぞれのアミノ酸の相対的な重要性を明らかにする。もし必要で あれば、特定の残基位置での選択的な置換は、T細胞アッセイの間で発見されたT 細胞の増殖反応を無くしてしまうのに対して、B細胞の反応性は維持するように 設計され得る。 ペプチド6641/3G3(LJP688)は、多くのアッセイに用いられた。そのアッセイに は、以下のようなものを含んだ：N末端とC末端の両方での短縮型、ジスルフィド の置換体、2から8位のアミノ酸のグリシンおよびアラニンへの置換体、2,4,5,お よび8位での枝分かれした脂肪族アミノ酸への置換体、α-メチルアミノ酸への置 換を含む、ペプチドの立体配座に影響するアミノ酸への置換体、7位での塩基性 アミノ酸への置換体、2から9位をでのD-アミノ酸への置換体、および1から9位で のN-α-メチルアミノ酸への置換体。これらの結果を、後の表8に示す。これらの 置換および短縮の構造と活性の関係を、表6に示す。 Ｎ． α−メチルアミノ酸置換による、ペプチドの免疫反応性の増強およびプロ テアーゼ攻撃に対する抵抗性の付与 プロリン残基は、ポリペプチド鎖の立体配座に影響するために特別な意味を有 する。それらは、しばしば、球状タンパク質の表面の逆ターン中に存在する。本 発明のファージエピトープライブラリーにおいて、すべてのランダムペプチドイ ンサートは境界プロリンと隣接する。加えて、ACA-6501を用いて発見されたミノ トープのほとんどは、コンピューターに基づいて予想されたが、β-ターンの一 部として存在し得る第３のプロリンを持っている。β-ターンを模倣したものは 、小ペプチドにおいて逆ターンの立体配座の安定性を高めるために使用され得る 。その様な模倣物には、プロリンアナログの(S)-α-メチルプロリン(α-Mepro) があり、これはターンの立体配座の安定化に加えて、プロテアーゼ分解に対する 抵抗性を付与する。プロテアーゼ抵抗性は、血漿内で作用するように設計される 有望な薬物に望まれる性質である。ペプチドACA-6501/3B10 AGPCLLLAPPDRCPG(イ ンサートを太字で示す)は、コンセンサスペプチドである。それは、他の35の相 同的な配列との比較をもとに、それぞれの位置に最も広く存在する残基を特徴と する配列を有する。その代表的な特徴のために、その配列は多くの系統的な改変 および欠失がなされ、そして活性は、後にaPL抗体結合によって評価された。最 も重要な知見の１つは、3位と9位でのプロリンが活性に重要であるという発見で ある。プロリン-3は、ファージの骨格に由来するもので、ランダムインサートの 一部ではない。最も劇的な効果は、9位のプロリンをα-MeProに置換することに よって得られた。この置換で、免疫反応性は6倍に高められた。 α-メチルアミノ酸およびN-α-メチルアミノ酸に置換した研究は、ペプチド66 41/3G3に関して行われ、その結果を上記の表6に示す。 Ｍ． 環状チオエーテルアナログの調製 本発明の方法によって同定された模倣物ペプチドは、チオエーテル置換を含む 更なる改変行うことができる。環状ジスルフィドアナログの環状チオエーテルア ナログへの修飾は、アナログ結合体の血漿中の半減期を延ばし、そのために投与 量を低く押さえる。環状チオエーテルアナログはまた、環状ジスルフィドペプチ ドと共にしばしば生じるジスルフィド結合の交換という問題を解消する。加えて 、環状チオエーテルアナログはまた、T細胞に対するMHCクラスII提示を妨げ得る 。従って、アネルギーの誘導を促進する。最終的に、環状チオエーテルアナログ は、原子価プラットホーム分子結合体生成において用いられるチオール依存性の 結合反応に有用である。 ４つの環状チオエーテルアナログを、その全体を本明細書中で援用される、代 理人整理番号252312006600の共有に係る、同時係属中の特許出願に記載される方 法論によって調製した。Rink^TMアミド 4-メチルベンゾヒドリルアミノ樹脂ある いはMBHA樹脂のどちらかを用いて、6641/3G3の全長のペプチドアナログを調製し 、クロロペプチドへ変換し、固体支持体から切断し、そして環化した。以下にチ オエーテル反応のスキームを示す。最適な環状チオエーテルアナログは以下に示 したアナログを含む。 あるいは、チオエーテルアナログは以下の反応スキームで調製される。 以下のアナログは、環状チオエーテル反応スキーム２によって作られるアナロ グとして表される。 代表的な環状チオエーテルアナログを、ACA6501およびACA6701のACA抗体に対 する活性について試験した。その結果は以下の表７に示す。 HCTEアナログのLJP699が、LJP688を切り縮めたCLGVLGKLCの参照ペプチドのLJP69 0、AGPCLGVLGKLCPGよりも優れていた。 本明細書中で引用されるすべての文献、特許および特許出願は本明細書中で参 考としてその全体が援用される。以下の実施例は、本発明およびその独創性をさ らに示すことを意図する。これらの実施例は、本発明の範囲を決して限定してい るわけではない。 実施例 実施例１：血清6501の抗カルジオリピン抗体(ACA)の測定 マイクロタイタープレートImmulon I（Dynatech Laboratories，Inc.,Chantil ly，VA）の番号付けされたウェルを、ウェルあたり30μLのエタノール中の50μg のカルジオリピン（Sigma Chemical，St．Louis，MO）で被覆した。プレートを 、４℃で一晩乾燥し、10%成熟ウシ血清（ABS）（Irvine Scientific Co.,Santa Ana,CA）を含むリン酸緩衝化整理食塩水（ABS/PBS）の200μLで２時間室温（RT ）ブロックした。プレートを、トリス緩衝液（TBS）で５回洗浄し、その後、10 μLの試験血清ACA-6501およびaPL標準物質を添加した。aPL標準物質（APL Diagn ostics，Inc.,Louisville，KY）を、製造者の使用説明書に基づいて再構成し、1 0%ABS-PBSで1:50に希釈した。試験血清ACA-6501を、50から2000倍に10%ABS-PBS で連続的に希釈し、二連で所定のウェルに添加し、２時間室温でインキュベート した。プレートをTBSで５回洗浄し、10%ABS-PBSで1000倍に希釈したヤギ抗ヒトI gG/アルカリホスファターゼ結合体（Zymed，South San Francisco，CA，Cat．No .628422）の100μLを加えて１時間室温でインキュベートした。再度、プレート を５回TBSで洗浄し、アッセイは、100μLフェノールフタレインモノホスフェー ト(PPMP)基質溶液（Sigma，Cat．No．P-5758）を添加することにより行った。基 質溶液は、脱イオン水で26倍に希釈した後に塩酸でpH10.15に調節することによ り、0.13M PPMPおよび7.8M 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールの保存溶液から 調製した。約30分後、反応を、0.2M二塩基性リン酸ナトリウム（dibasic sodium phosphate）(Mallinckrodt，Analytical Reagent)の50μLを各ウェルに添加し て停止させた。光学密度は、マイクロプレート自動読み取り機（Bio-Tek Instru ments，Win ooski,VT，Model EL311）において550nmで読み取った。奇数番号のコントロール ウェル（ブランク、カルジオリピン（CL）なし）の光学密度を、偶数番号のウェ ルの光学密度から差し引いた。aPL標準物質の吸光度の値を、Graph Pad Prizm(G raph Pad Software,Inc.,San Diego,CA)を使ってプロットし、GPL(IgGリン脂質) の標準曲線を作成した。希釈した6501試験血清の吸光度の値を用いて、GPLの標 準曲線を基にしてGPLスコアを計算した。 実施例２：抗カルジオリピン抗体(ACA)の血清6501からの精製 25mL丸底フラスコ（Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.）に、1.2mlのカル ジオリピン（Sigma Chemical,St.Louis,MO,#C-1649）、0.464mLのコレステロー ル(Sigma Diag.,St.Louis,MO.,#965-25)、クロロホルム1mLあたり5mgジセチルホ スフェート(Sigma Chemical，St.Louis,MO，D-2631)の0.088mLの混合物をRotava p(Buchi，Switzerland)にて約５分間乾燥した。続いて溶媒を除き、0.96%(w/v)N aCl（J.T.Baker，Inc.,Phillipsburg，NJ）Baker analysed reagent）の2mLを添 加して、Vortex Genie Mixer(Scientific Industris，Inc.，Bohemia，NY)を用 いて１分間混合した。リポソーム懸濁液を、37度で１時間インキュベートした。 その間、血清6501を、８℃で、10分間、Sorvall RT 6000遠心分離(Dupont Co.Wi lmingtonn,DE)にて600xｇで遠心分離した。４mLの上清を、調製したリポソーム 懸濁液の1mLが入れた25mL丸底フラスコに移した。混合物を、旋回型振とう機Tek tator(Scientific Products，McGraw Park，IL)で、中速の撹拌振とうを48時間 ４℃で行った。その後、引き続き２時間37℃で振とうした。20mLの冷TBSを添加 し、50mL容のポリカーボネート遠心管（Nalge Co.,Rochester,NY）に移した。そ してSS-34ローター（Sorvall-Dupont，Wilmington，DE）で、RC3遠心分離機にて 、15分間、４℃で、27000xｇで遠心分離した。沈殿を、RC3遠心分離分機を用い て、25mLの冷0.96%NaClで３回洗浄した。ペレットを、2%(w/v)n-オクチル-β-D- グリコピラノシド(Calbiochem，La jolla，CA)のTBS溶液の1mLに溶解し、そして 、0.6mLのプロテイン A/架橋アガロース(Repligen Corporation，Cambridge, MA )カラムに加えた。カラムは、1M 酢酸でペット量の15倍で予め洗浄し、15倍量の TBSで平衡化した。抗体-プロテイン A/アガロースカラムを、脂質を取り除 くために、ベット量の40倍の2%オクチルグルコピラノシドで洗浄した。その後、 280nmでの光学密度がベースラインに達するまで、TBSで十分に洗浄した。結合し た抗体を、1M酢酸で溶出した。1mLのフラクションで分取して、フラクション毎 に0.34mLの3M Tris(Bio-Rad,電気泳動用試薬)で、直ちに中和して氷浴中に保存 した。それぞれの光学密度を、分光光度計(Hewlett-Packard，8452A Diode Arra y Spectrophotometer，Palo Alto,CA)にて280nmで決定した。抗体を含んだフラ クションを集め、Centricon-30濃縮器（Amicon Division，W.R．Grace & Co.，B everly，MA）を用いて、TBSで４回濃縮および洗浄した。4mLの血清6501から精製 された抗体の最終収量を、1mg=1.34OD₂₈₀をもとに、濃縮液のアリコート280nmで の光学密度の値から決定した。得られた平均収量は、4mLの血清6501から抗体750 μgであった。精製された抗体を、ACA活性について試験し、Laemmli SDS-PAGEで 純度を調べた。 実施例３：P-IIIライブラリーのベクター調製物の構築 fUSE 5（Scott,J.K．および G.Smith，前出）を、P-IIIライブラリーの構築の ためのベクターとして使用し、Holmes,D.S.およびM.Quigly(1981)，Anal．Bioch em.144:193)の変法を、二本鎖複製形態(RF)を生成するために用いた。簡単に説 明すると、fUSE 5を保持した800mlのE.coli K802培養物を、2YT培地(Difco Labs ，Ann Arbor，MI)に20μg/mLテトラサイクリンを加え、18時間、37℃で振とう培 養した。菌体を遠心分離により集菌し、75ml STETに再懸濁した。STETは、50mM Tris/HCl pH 8.0に、8%スクロースと0.5% Triton X-100と50mM EDTAとを含む。 リゾチーム（STET中で10mg/mL）を、終濃度1mg/mLになるように添加した。室温 で5分間後、３つに分けたアリコートを、ときどき撹拌しながら沸騰水中に3.5分 間置いた。粘りけのあるスラリーを、18000xGで30分間遠心分離し、上清に等量 のイソプロパノールを添加した。これを-20℃に冷却し、核酸を遠心分離によっ て集めた。RFを、Sambrookら、MOLECULAR CLONINIG：A LABORATORY MANUAL（Col d Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY，2d ed.，1989） に記載されるように,塩化セシウム勾配から分離した。 ランダムインサートの調製 挿入用のDNAを、Cwirlaら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87:6378-6382に記 載されている”ギャップ二重鎖（gapped duplex）”法で作製した。この方法で は、中央部に縮重領域を含むオリゴヌクレオチドは、それぞれの端での短い定常 領域によって囲まれている。二つのより短い相補的オリゴヌクレオチドを、ベク ターを消化するために用いられる制限酵素によって生成する粘着末端に相補的な 突出末端を持つ”ギャップ二重鎖”を形成するためにアニーリングする。この場 合、長い方の縮重オリゴヌクレオチドは以下の配列を持つ：5'GGGCTGGACCC(NNK) xCCGGGGGCTGCTG3'、ここで、NはAまたはCまたはGまたはTであり、ＫはGまたはT であり、そしてｘはランダム領域におけるコドンの数である。EpiGS2は、縮重オ リゴヌクレオチドの5'末端で塩基対形成するように設計され、その配列は、5'GG GTCCAGCCCCGT3'である。同様に、EpiGS3は、縮重オリゴヌクレオチドの3'末端と アニーリングするように設計され、5'CAGCCCCCGG3'の配列を持つ。正確にアニー リングするとき、３つのオリゴヌクレオチドは”ギャップ二重鎖”を形成する。 これらは、Sfilで消化したfUSE 5に挿入した際に、5'末端付近のランダムインサ ート断片を伴うP-IIIのリーディングフレームを保持する。 以上に述べたオリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲルから切り出して 調製した。1nmolのEpiGS2とEpiGS3、および50pmolの縮重オリゴヌクレオチドを6 6μLの容量で別々にリン酸化した。次いで３つのオリゴヌクレオチドを一つに集 め、50mMになるようにNaClを加え、混合物を65℃で5分間加熱し、続いて室温へ ゆっくりと冷した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、氷中で冷やし、直 ちにfUSE 5との連結反応に用いた。連結反応は、Sfilで完全に消化した10μgのf USE 5 DNA、30μLの”ギャップ二重鎖”溶液、および1000U T4リガーゼから成り 、全量を450μLとした。連結は、16℃で18時間インキュベーションした。混合物 を、次いでフェノール・クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させ、沈殿物を 20μLの水に溶解した。 ライブラリーの形成と増幅 連結したＤＮＡをエレクトロポレーション法(Dowerら、（1988）Nucleic Acid Res．16:6127-6145)によってE.coliに導入した。凍結エレクトロコンピテントMC 1061菌体(0.1mL)を、4μLの連結DNAを2mmの冷キュベット内で混合し、BTXエレク トロポレーション装置(BTX Corp.,San Diego,CA)によって2.5kV，5.2mSのパルス を加えた。パルスをあてた後、直ちに菌体生育培地の1mL SOC（Dowerら、前出） を加えた。５つの別々のエレクトロポレーションを実行し、集めて、37℃で１時 間培養した。そのとき、サンプルを取り出し、コロニー生成数を決めるために希 釈した。残りの混合物を、20μg／mLテトラサイクリンを含む1L 2YT（1.6%ペプ トン，140，1%酵母エキストラクト，0.5%NaCl，Difco Labs，Ann Arbor，MI）で 希釈し、37℃で18時間、275rpmで振とう培養した。ファージを、PEG/NaCl沈殿を ２回行うことによって精製し、0.02%アジ化ナトリウムを含む1.2mL TBSに再懸濁 した。ファージ粒子数を、269nmの吸光度で決定した。ファージ力価を、飢餓状 態のE.coliの10μLにファージの希釈液の10μlを混合することにより決定した。 実施例４：aPL抗体のP-IIIライブラリーのスクリーニング アフィニティー精製したACA-6501（affACAA-6501，10μg；7μLの1.44mg/mL保 存溶液）を1.4mLのシリコーン処理したポリプロピレン製マイクロチューブに移 し、X,Y,およびZライブラリー(epi^xyz)[それぞれ、11μL+8.5μL+2μL；全量21. 5μL、約10¹⁰のクローン]由来のプールされたファージをともに、0.5%ウシ血清 アルブミン(BSA)を含むTBS（pH7.4）の100μLの最終用量で室温で２時間インキ ュベートした。このインキュベーションの間に、新鮮な飢餓状態のE.coli K-91 株の調製の最終段階を行った。2YT培地にて、37℃、250rpmで約５時間振とう培 養したE．coli懸濁液を、50mlポリプロピレンチューブを用いて1000×gで、10分 間室温で遠心分離した。20mlの80mM NaClをE．coliペレットに加え、37℃で100r pmで45分間インキュベートした。上記の遠心分離に続き、飢餓状態のE．coliペ レットを1mLの50mMリン酸アンモニウム/80mM NaClに懸濁し、後にファージ増幅 に用いた。プロテインG-アガロースビーズをTBS/BSAで２回洗浄し、TBS/0.5％Tw een-20で２回洗浄し、TBS/Tween中で50％懸濁液として４℃で保存した。 プロテインG-アガロースビーズ懸濁液の200μｌを、ACA-6501/ファージ混合物 に加え、室温でさらに１時間インキュベートした。この時点で、混合物を冷却し 、 冷えたTBS/Tweenで３回洗浄し、沈殿を低温室内で微量遠心分離で回収した。洗 浄済みのビーズを、非特異的な付着を防ぐ目的で、予めTBS/BSAおよびTBS/Tween で洗浄した新しい微量遠心チューブに移した。さらに３回TBS/Tweenで洗浄した 後、結合したACA-6501を保持したファージを有するビーズを、300μｌの0.2N HC l/グリシン、pH2.1で室温で10分間ひっくり返すことによって溶出した。16000× ｇで遠心分離した後、酸性溶出液の上清を回収し、100μｌの溶出液をさらにビ ーズペレットに加え、手順を繰り返した。10分後、ファージを含む溶出液（増幅 していない1回目のファージを指す）を溜めておき（〜400μｌ）、17×100mmの 滅菌済み細胞培養チューブに移し、これに50μｌの0.5M NaClを加え、その後2.5 M Tris塩基（通常約25-35μｌ）でpHを中性化した。等量の飢餓状態のE．coli懸 濁液を直ちに加え、37℃100rpmで10分間インキュベートした。混合物を、20μg/ mlテトラサイクリン（Tet）含有の25mlの2YT培地を含む滅菌済み250ml培養フラ スコに移し、その後37℃250rpmで一晩インキュベートした。 一晩の培養から増幅ファージを単離するために、懸濁液をポリカーボネートチ ューブに入れ、12000×ｇで10分間遠心分離した。ペレットを捨てた。ポリプロ ピレンチューブ中で70℃で30分間上清を熱処理した後、再度ポリカーボネートチ ューブで遠心分離し、上清を保存した。ファージを沈殿させるために、この上清 に、1/4量の20％（w/v）ポリエチレングリコール（分子量8000（PEG 8000））を 加えた。溶液を、100回上下反転させることで混ぜ、４℃で２時間インキュベー トした。４℃で、35000×ｇで30分間遠心分離した後、ファージを含むペレット を約0.5mlのTBS/BSAに再懸濁し、1.4mlの微量遠心分離チューブに移した。16000 ×ｇで１分間遠心分離した後、上清はきれいなチューブに移し、１回増幅したフ ァージと名付けた。 ２回、３回、および４回の生物選抜の間、その前の回の増幅ファージの75μｌ を、最終体積100μｌ中で、７μｌのaffACA-6501と共にインキュベートした。５ 回目のファージに関して、affACA-6501を、まず1：1000で希釈し、他の回の記載 のように処理した。後に続く全ての段階を、第１回目の記載のように行った。５ 回目の生物選抜で得られたファージを、ファージ濃度を決定するため、2YT/Tet プレート上で一時的に力価測定を行った。増幅したファージの一時的な力価測定 には、TBS/BSAまたは2YT培地中での1×10⁶の最初のファージ希釈が必要である。 全ての回に関して、希釈した10μｌのファージを飢餓状態のE．coliの40μｌと 共に37℃で10分間、振とうすることなく、インキュベートした。950μｌの2YT/ 希釈Tet（0.2μg/ml）の添加後、混合物を37℃、250rpmの振とうで30-45分間イ ンキュベートした。1：10、1：100、および1：1000で希釈したファージ溶液およ び正味のファージ溶液の10μｌを20μg/mlテトラサイクリンを含む寒天プレート を用いて、2YT/希釈Tetにスポットした。 マイクロ選抜 1mmulonタイプ２プレートを、プロテインGで被覆した。プロテインGを、0.IM NaHCO₃中、10μg/mlで調製し、ウェルあたり100μlをマイクロタイトレーション プレートのウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートから過剰な プロテインＧを除いた後、それぞれのウェルを250-300μｌの2YTで、室温で１時 間振とう台上で振動させてブロックした。Tris緩衝化生理食塩水（pH7.4/0.5％T ween 20（TBS/Tween））を用いて、自動プレート洗浄機により、200μｌでウェ ルを４回洗浄した。2YTを用いて2.5μg/mlに希釈したaffACA-6501（または、対 照としての標準IgG）の100μｌを洗浄ウェルに加えた。プレートを、室温での回 転台上で１時間振とうしたあたりで低温室の回転装置に移した。 マイクロ選抜により試験されるファージを、マイクロ選抜で調製された寒天プ レートから得た。試験されるそれぞれのクローンを、滅菌つま楊枝を用いて、ウ ェルあたり250μｌの2YT/Tetを含む丸底の96ウェルマイクロタイトレーションプ レート（Corning、Corning、NY）のウェルに移し、37℃で一晩培養した。クロー ンの命名は、スクリーニング抗体、起源の生物選抜の回数、一晩培養したプレー トのクローン位置に基づく。例えば、ACA-6501/3B10は、ACA-6501を用いて、３ 回目で、マイクロタイトレーションプレートのB10と名付けられたウェルから単 離されたクローンを指す。一晩インキュベートした後、ファージ培養液をマイク ロタイトレーションプレートホルダーを用いて、室温で1300×g、10分間遠心分 離した。上清を“正味の”ファージ源とする。 最初のマイクロ選抜を、1：10から1：10⁶の比率の希釈で試験した６個のクロ ーンに限定した。これらの試験的に用いたクローンの結果は、それぞれの回の供 給源となるプレートのクローンに十分な結果を与える適切な単一希釈を導くため に用いた。生物選抜の３回目、４回目、および５回目から無作為に選択し、培養 したクローンを表すプレートを、ウェル当たり最終容量250μｌで、マイクロタ イトレーションプレート中の2YTを用いて“正味の”溶液から、１：100,000に希 釈した。所望の希釈となった最終プレートからの100μｌを、上記の通り調製さ れたプロテインG結合のACA-6501および正常IgGを含むプレートに加えた。希釈し たファージをaPL抗体または対照IgGとともに、４℃で２時間水平回転装置上でイ ンキュベートした。自動プレート洗浄機中で、TBS/Tweenにより９回洗浄した後 、IgG結合のファージを、20μｌの0.2N HCl-グリシン/0.1％BSA、pH2.2で溶出し た。溶出液のインキュベートを室温で10分間続け、その間に、新しい飢餓状態の E．coliの20μｌをウェルに含む新しいCorningマイクロタイトレーションプレー トを準備し、冷却した。pHを中性にするために、140μｌの29mM Trisをファージ 溶出液を含むプレートに加え、その後、20μｌファージ懸濁液を、各ウェルから 、飢餓状態のE．coliを含むプレートの対応するウェルに移した。37℃で10分間 インキュベートした後、200μの2YT/希釈Tetを加え、さらに37℃で30分間インキ ュベートした。マルチチャンネル分注器を用いて、それぞれのウェルから10μｌ を、大きな2YT/Tet寒天プレートにスポットした。しかし、最後のマイクロタイ トレーションプレートからの8×12ウェルのパターン、および配置は保ったまま にした。30分間スポットを乾燥させた後、プレートを37℃で一晩インキュベート した。次の日、コロニーを半定量的に０から4+まで評価した、０は〈10コロニー を表し、+/-は10-20；1+は20-50；2+は50-70％コンフルエント；3+は70-90％コ ンフルエント；4+は〉90％コンフルエントコロニーを表す。1：10⁵の希釈で試験 した94個のクローン[3回目のクローン81個、４回目の６個、５回目の７個]のう ち、６個のクローンはマイクロ選抜のスコアが０であり、３個は1+、14個は2+、 62個は3+、９個は4+であった。２回目から５回目の生物選抜を表すプレートから の無作為のクローンの調査を、後述するG-トラックDNA配列決定により行った。 ４回目の生物選抜により、配列の多様性は劇的に減少するという結果が得られた （図８参照）。従って、２回目のプレートは、1：3×10⁵の希釈でのファージを 用いて、 マイクロ選抜を行った。この際、それよりも以前（２回目）からのクローンを含 む。総計94個のクローンを試験し、これは、1×10⁵の希釈で高いスコアを有する 29個[３回目から26個、４回目から１個、および５回目から２個]、および２回目 からの65個のクローン（以前には試験されなかった）を含む。1：3×10⁵の希釈 で試験された94個のクローンのうち、26個のスコアは０、11個は+/-、10個は1+ 、13個は2+、34個は3+、4+はなしであった。 G-トラックDNA配列決定 一本鎖ウイルスDNAを、37℃で一晩インキュベートした培養から単離した。培 養物を調製するために、2YT/Tet（チューブでは２ml、またはマイクロタイトレ ーションプレートの丸底ウェルでは250μｌのいずれかとして）に、マイクロタ イトレーションプレートで予め培養した培養物を広げたプレートからの個々のフ ァージを接種した。培養上清の20％PEG/2.5M NaCl沈殿によるファージの精製、 ならびにフェノール-クロロホルム抽出またはアルカリ変性によるビリオンDNAの 単離または遊離の実施は、チューブでの培養液に関しては、Smith，G．P.および J.K．Scott，”繊維状ファージにおけるペプチドおよびタンパク質ライブラリー ”（1993）Meth．Enzymol．217:228-257、およびマイクロタイトレーションプレ ートでのファージに関しては、Haas，S.J.およびG.P．Smith G．P.，”繊維状フ ァージ由来ウイルスDNA の迅速配列決定”（1993）BioTechniques 15:422-431の 記載に従った。Sangerら(Sangerら”鎖停止阻害剤を用いたDNA配列決定”(1970) Proc．Natl．Acad．Sci．74:5463-5467)のジデオキシヌクレオチド鎖停止配列決 定技術を、市販のSequenaseキット(U.S．Biochemical/Amersham，Arlington Hei ghts，IL)を用いて行い、チューブ培養のファージDNAに関しては、SmithおよびS cott(前述)、ならびにマイクロタイトレーションプレートからのファージDNAに 関しては、HaasおよびSmith(前述)の通りに行った。ddCTP停止混合物のみを用い て、7％ポリアクリルアミド/尿素配列決定ゲルでの電気泳動、オートラジオグラ フィーを用いることにより、ひとつの塩基(G)により示されるGトラッキングもし くは配列パターンを得た。標準的なゲル電気泳動およびオートラジオグラフィー の手順に従った(Sambrookら、前述)。 ACA-6501ライブラリースクリーニングからの1：1×10⁵のファージ希釈で試験 したマイクロ選抜プレートに由来する76個のクローンのG-トラッキングにより、 11個の異なる配列が確認されたが、1：3×10⁵のファージ希釈で試験した２回目 のマイクロ選抜プレートに由来する64個のクローンは、30個の異なる配列が確認 された。４つの全てジデオキシヌクレオチドシリン酸を用いる従来のDNA配列決 定を、最高のマイクロ選抜スコアおよび独特の配列のファージクローンに適用し 、xyzライブラリーに関して表１に示した12個の配列が得れた。 ファージ捕獲ELISA クローン、ACA-6635/3A12、3B3、3C8、3A5、3C9、および3B7を、3mlの培養物 として培養した。アフィニィティー精製されたACA-6635を、リン酸緩衝化生理食 塩水、pH7.2で2.5μg/mlに希釈し、100μｌをImmulon-2マイクロタイトレーショ ンプレートウェルに加えた。２時間後、プレートを、振とうせずに自動プレート 洗浄機を用いて３回TBS/Tweenで洗浄した。プレートを、ウェル当たり150μｌの 0.1％BSA(グロブリンを含まない)のPBS溶液でブロックした。４℃で１時間後、 プレートを前述の通り３回洗浄した。それぞれのファージ培養液を17000×g、３ 分間遠心分離した後、それぞれの上清を0.1％ BSA/PBSで1：10に希釈し、100μ ｌを、アフィニティー精製したACA-6635で被覆した各ウェルに加えた。そして、 ４℃で２時間インキュベートした。プレートを前述のようにTBS/Tweenで洗浄し た。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジIgG抗M13ファージ抗体(Pharmacia， Inc.，Piscataway，NJ)を、0.1％BSA/PBSで1：5000に希釈し、100μｌを、それ ぞれのウェルに加えた。４℃で１時間インキュベーションした後、プレートを前 述のように４回洗浄した。結合体の製造者の説明書に従い調製した基質100μｌ をそれぞれのウェルに加えた。19分後、それぞれのウェルの405nmの光学密度を 、自動マイクロプレート吸光度読み取り機(Biotek，Winooski，VT)で読みとった 。ACA-6635ファージライブラリー由来の試験された７個のクローンを、高いマイ クロ選抜スコアおよび負のファージELISAスコアのために選択した（以下参照） 。図９に示すように、試験した７個のクローンのうち３個(3A12、3B3、および3A 5)は、ファージ捕獲ELISAで非常に強い免疫特異的シグナルを呈した。 ファージELISA 3ml培養物を35クローン（いくつかのファージライブライリースクリーニング でアフィニティー精製されたACA-6501親和性で以前に単離された）ならびに１つ のFUSE２ファージークローン（ペプチドインサートを欠損しておりコントロール をして用いた）から調製した。17000×gで３分間遠心分離した後、それぞれのフ ァージ上清(吸光度をもとに、約2×10¹¹粒子/mlに調整)の100μｌをマイクロタ イトレーションプレート(Falcon，Becton-Dickinson Labware，Lincoln Park，N Y)のウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートした。TBS 7.4で４回洗浄した 後、室温下プレートを125μｌの0.5％ BSA/TBSで１時間ブロックした。さらに４ 回TBSで洗浄した後、TBS/BSAにて2.5μg/mlに予め希釈した100μｌのaffACA-650 1をそれぞれのウェルに加え、37℃で１時間インキュベートした。さらに４回の 洗浄の後、TBS/0.5％ Tweenにて1：1000に希釈した100μｌの抗ヒトIgGをそれぞ れのウェルに加えた。室温で1時間後、酵素基質を加え、２時間インキュベート を続けた。反応を停止させるために50μｌの0.2M Na₂HPO₄を添加した後、自動プ レート吸光度読取り機により550nmの吸光度を測定した。図10に示したように、A CA-6501を用いて、７個のクローンから、ファージELISAで有意なシグナルが確認 された。:5A12、3B6、3E7、3B10（2D7と同じ配列）、2G11、2H1、2H2。これらの クローンの配列を表２に示した。 ペプチドELISA 標準的なプロトコルで、ジメチルホルムアミド中の四量体ペプチドの保存溶液 を、pH9.5の炭酸緩衝液にて10μg/mlに1000倍に希釈した。それぞれのマイクロ タイトレーションプレートウェルを、100μｌの希釈したペプチド溶液で4℃で一 晩被覆した後、緩衝化アルブミンでブロックされる。ペプチド被覆されたマイク ロタイトレーションプレートを、1：50を始めとするいくつかの希釈度のaPL血清 で1-2時間室温でインキュベートした。洗浄の後、ペプチドが結合したヒトIgGの 存在を、標準的なELISA手順に従い、酵素結合抗ヒトIgGにより決定した。 競合的結合ペプチドELISA (A)Immulon IIプレート(Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly VA)のウェ ルのうちブランクコントロールとして用いる３個のウェルを除く、各ウェルに35 mMの重炭酸ナトリウム(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，reagent grade)を 含む50mM炭酸ナトリウム（pH9.5）中に10μgの４価ペプチドACA 6501/3B10を含 む溶液100μｌで、少なくとも１時間室温で被覆した。次いで、液体をウェルか ら除き、TBS中に0.5％（wt/vol）BSA(Sigma Chemical，St．Louis，MO，#A7638) を含む溶液を１ウェルあたり200μｌを加えた（ブロッキングのためにブランク ウェルも含む）。そして、室温で少なくとも１時間インキュベートした。４個の 1.5ml微量遠心管に１から４の番号を付けた。以下の試薬を１番の微量遠心管(Br inkman Instruments，Westbury，NY)中で混ぜた: 30μｌの5％BSA; 284μlのTBS ; TBS 中に約400-500μg/mlのモノマーペプチド(ACA-5A12または-CB2または-3B1 0、または負のコントロールとしての乱雑にされた（scrambled）-3B10)を含む保 存溶液の8μl；および0.5％ BSA-TBSで1：10希釈の8.2μlの血清6501。以下の試 薬を２番の微量遠心管中で混ぜた: 30μｌの5％BSA; 290μｌのTBS; TBS中に約4 00-500μg/mlのモノマーペプチド(ACA-5A12または-CB2または-3B10、または負の コントロールとしての乱雑にされた-3B10)を含む保存溶液の２μｌ；および0.5 ％ BSA-TBSで1：10の希釈の8.2μlの血清6501。以下の試薬を３番の微量遠心管 中で混ぜた：30μｌの5％BSA；約400-500μg/mlのモノマーペプチド(5A12または -CB2または-3B10、またはコントロールとしての乱雑にされた配列-3B10)の１：1 0希釈の287μl；予め0.5％ BSA-TBSで1：10希釈したACA-6501血清溶液の8.2μｌ 。以下の試薬を４番のEppendorf微量遠心管中で混ぜた: 60μの５％BSA; 584μ ｌのTBS; 0.5％ BSA-TBSで1：10希釈した血清6501の16.5μｌ。ブロックされた プレートをTBSで５回洗浄した。１番目の微量遠心管の溶液を１ウェルあたり100 μｌずつ３連で加えた。２番、３番、４番の微量遠心管中の溶液の同量を３連の ウェルに加えた。４番目の微量遠心管中の100μｌの溶液をマイクロタイトレー ションプレートの３つのブロックしたそれぞれのブランクウェルに加えた。プレ ートを旋回振とう機(American Dade，Miami，Fl，Rotator Ｖ)中で40rpmの振動 で室温で１時間インキュベートし、次いでTBSで５回洗浄した。0.5％ B SA-TBS中で1：1000に希釈したヤギ抗ヒトIgG/アルカリホスファターゼ結合体(Zy med，South San Francisco，CA，Cat．no．62-8422)の100μｌのアリコートを加 え、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをTBSで５回洗浄した後 、実施例１で記述したように100μｌの希釈したPPMPの基質溶液を加えることで 、アッセイを行った。20分後、ウェル当たり50μｌの0.2M Na₂HPO₄(Mallinckrod t，St．Louis，MO.，reagent grade)を添加することで反応を停止した。光学密 度を、マイクロプレートリーダーで550nmにて読んだ(Bio-Tek Instruments,Wino oski,VT,Model EL311)。ウェルあたりのペプチドの量に対する550nmの光学密度 をGraph Pad Prizm(Graph Pad Software，Inc.，San Diego)で描いた。血清6501 が４価3B10と結合することを50％阻害するために必要なペプチドの量をグラフか ら計算した。 レート(Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，VA)を、エタノール中にカル ジオリピン(CL，50μg;Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)を含む溶液30μｌ でウェルを被覆した。２個のコントロール用のウェルには、30μｌのエタノール のみを満たした。４℃で一晩エバポレーションした後、それぞれのウェルを5％( w/v)魚ゼラチンを含むPBS 200μｌで、室温で２時間ブロックした。CL被覆の、 ブロックしたプレートをTBSで５回洗浄し、それぞれのウェルに2.3％(v/v PBS中 )IgG涸渇化ヒト血清(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)100μｌとしてβ2-GP Iを加え、室温で２時間インキュベートした。 インキュベーションの間、3％魚ゼラチンを含む1:1 TBS/PBSで希釈した22μｌ ACA6501血清(最終希釈度1:400)と種々の量の各６種類のペプチドを、Eppendorf 微量遠心管を用いて最終容量220μｌとして混ぜた。特に、チューブ番号１番は 、３％魚ゼラチンTBS-PBS溶液の181.3μｌ、16.7μｌのペプチド保存溶液および ３％魚ゼラチン／TBS-PBSで40倍希釈したACA6501血清22μｌを混合した。ペプチ ド＃951(ジセリン非環状陰性コントロール)、＃952(LJP690の１つのブロット)、 チオエーテル CCTE-3G3、CHTE-3G3、HCTE-3G3、およびHHTE-3G3について、保存 溶液を450〜800μg/mlの範囲とした。２番のチューブに関しては、次のものを加 えた：148μｌの魚ゼラチン/TBS-PBS、50μｌのペプチド保存溶液、ACA6501血清 を40倍に希釈した溶液22μｌ。３番のチューブには、48μｌの魚ゼラチン/TBS-P BS、50μｌのペプチド保存溶液、およびACA6501血清を40倍に希釈した溶液22μ ｌを加えた。４番のコントロールチューブには、396μｌの魚ゼラチン/TBS-PBS 、ACA6501血清を40倍に希釈した溶液（ペプチドを含まず）44μｌを入れた。そ れぞれのチューブは室温で約１時間インキュベートした。 CL/β2-GPIマイクロタイトレーションプレートをTBSで５回洗浄し、抗体ペプ チド(またはペプチドを含まない混合物)を含む番号１、２、３、４番のEppendor fチューブから２連で、100μｌのアリコートのウェルに加えた。４番のチューブ から100μｌを分取したものを、カルジオリピンを含まない二連のコントロール ウェルに加えた。マイクロタイトレーションプレートを、室温下旋回振とう機(A merican Scientific，Rotator Ｖ）にて40rpmで振とうしながら、１時間インキ ュベートした。その後、TBSにて５回洗浄した後、0.5％（w/v）BSA-TBSで1：100 0希釈したヤギ抗ヒトIgGアルカリファターゼ結合体(Zymed，Cat No．62-8422)10 0μｌを加えた。室温で１時間インキュベートした後、マイクロタイトレーショ ンプレートを再度TBSで５回洗浄し、100μｌのPMPP溶液(水で１：26に希釈した 、水l00mlの7.8gフェノールフタレインモノホスフェートおよび69.5g2-アミノ-2 -メチル-1-プロパノールの保存溶液)を加えることで比色酵素検出を行った。21 分後、50μｌの0.2M Na₂HPO₄(Mallinckrodt)をそれぞれのウェルに加えることで 、反応を停止させた。550nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Tek Inst ruments，Model EL 311)にて読みとった。加えたペプチドに対する吸光度は、図 12に示したようにGraph Pad Prism(Graph Pad Software，Inc.)で描いた。ACA65 01の結合を50％阻害するペプチドの量(IC₅₀)は、加えたペプチドの量と極大とな る吸光度の半分の値の交点としてグラフから計算した。 実施例５：ペプチド3B10の短縮実験およびその得られるペプチドの競合ELISAの 結果 マイクロタイトレーションプレート(96ウェル、平底ポリスチレン製、Immulon -2 Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，VA)を、炭酸緩衝液pH9.6(15mM N a₂CO₃/35mM NaHCO₃)に10μg/mlの濃度で４価ACA-6501/3B10ペプチドで１ウェル あたり100μｌで、室温で１時間被覆した。ウェルから液体を除いた後、それぞ れのウェルを0.5％(wt/vol)BSA(グロブリンなし，cat．no．A7638，Sigma Chemi cal Co.，St Louis,MO)を含有するTBS 200μｌで、室温で１時間ブロックした。 プレートの３個のウェルはブランクコントロールのウェルとして使用するため、 ４価ペプチドで被覆しなかった。 ブロッキング工程の間、それぞれの可溶性の、モノマーペプチドの試験を行う ために、３つのテストチューブ(Eppendorf micro test tubes，Brinkmann Instr uments，Westbury,NY)を準備した。それぞれのテストチューブには、30μｌの5 ％BSA/TBS、8.2μｌのACA-6501血清(0.5％BSA/TBSで1：10で希釈)、および種々 の量のペプチド/TBSストックを含み、最終容量が330μｌとなるように必要なTBS 緩衝溶液をさらに加えた。この330μｌ容量は、４価ペプチドで被覆されたプレ ートに結合するACA-6501をブロックするための能力について、試験された各ペプ チド濃度について３連の100μｌのサンプルを作成するのに十分な量であった。 アミノ末端が短縮し、ala-gly骨格の通常試験されるべき寄与が欠損したペプチ ド139に関しては、保存溶液の濃度を約340-400μg/ml TBSとし、そして3種のペ プチド濃度を調製するために19μｌ、75μｌ、292μｌのアリコートを取り出し た。ペプチド142(Ｎ末端のalaのみ欠失したもの)、ペプチド143(短縮していない もの)に関しては、保存溶液の濃度を400-500μg/ml TBSとした。それぞれのペプ チドに対して、３種の濃度を調製するため、それぞれの保存溶液から１μｌ、４ μｌ、16μｌのアリコートを取り出した。ペプチドモノマーコントロールチュー ブ(ペプチドを含まないもの)に関しては、最終容量660μｌ含むチューブを次の ものを含むように調製した：60μｌの5％ BSA、1：10の比で希釈したACA-6501の 16.5μｌ、および583.5μｌのTBS、すなわち、330μｌチューブの最終濃度(0.5 ％ BSA、および1：400のACVA-6501血清)に等しいが、体積は２倍で、ペプチドは 含まない。 ブロッキングインキュベーション後、４価ペプチドで被覆したプレートをTBS で５回洗浄した。ペプチド139、142、143を異なる濃度で含む330μｌの各チュー ブから、100μｌを、被覆した３連のウェルに加えた。ペプチドを含まない660μ ｌコントロールチューブから３つの100μｌのアリコートを、被覆したウェルに それぞれ加えて、さらに３つの100μｌのアリコートを、被覆していないブラン クウェルにそれぞれ加えた。プレートを、旋回振とう機(Rotator Ｖ，American Dade，Miami，FL)上で、室温下40rev/分で１時間インキュベートし、その後TBS で５回洗浄した。BSA/TBSで1：1000の比に希釈したヤギ抗ヒトIgG/アルカリホス ファターゼ結合体(Cat．no．62-8422，Zymed，South San Francisco，CA)をマイ クロプレートにそれぞれ１ウェルあたり100μｌずつ加えた。室温で１時間イン キュベーション後、プレートを再びTBSで５回洗浄した。新しく調製した希釈PPM P基質溶液を、ウェル当たり100μｌずつ加え、発色を行った。PPMP(フェノール フタレインモノホスフェート、cat．no．P-5758，Sigma Chemical Co.，St．Lou is，MO)希釈溶液は、PPMP保存溶液(0.13M PPMP、7.8Mアミノ-2-メチル-1-プロパ ノールをHClにてpH10.15に調整したもの)を水で1：26の比となるように希釈して 調製した。30分後、１ウェル当たり50μｌの0.2M Na₂HPO₃(reagent grade，Mall ickrodt，St．Louis，MO)を加えることにより、反応を停止させた。マイクロプ レートリーダー(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)にて550nmの吸光度の測定 を行い、１ウェルあたりの加えたペプチドに対するA_550nmの結果をGraph Pad Pr izm(Graph Pad Software，Inc.，San Diego，CA)を用いて描いた。図11に示した ように、水平の線は、モノマーペプチドの競合の非存在下で得られた結合反応の 最大の1/2に対応するように描かれた。50％の阻害に必要なペプチドの量は、試 験したそれぞれのペプチドをプロットしたこの線の交点から読みとった。50％阻 害値を図12に示す。N末端のAlaの欠失は負の結果は得られなかったが、さらにGl yを欠失したものは、50％の阻害を達成するのに必要な濃度は約８倍に増加した ことを結果は示す。 実施例６：αメチルプロリンの3B10への置換およびその結果得られるELISA ペプチドACA-6501/3B10、および３位、９位のプロリンをα-Me-Proに置換した そのアナログの試験を、実施例５に示した方法論を用いて行った。ペプチド3B10 、726(３位をα-Me-Proに置換したもの)、727(９位をα-Me-Proに置換したもの) 、728(３位、９位共にα-Me-Proに置換したもの)を、可溶性モノマーペプチドと して、４量体ペプチド3B10で被覆したマイクロタイトレーションプレートおよび AC A-6501血清を用いる競合結合ELISAで試験した。 マイクロタイトレーションプレートを、実施例５で記述したように４量体3B10 ペプチドで被覆した。4個のペプチドそれぞれの試験に対して、チューブに３種 のペプチド濃度を調製した。実施例５にあるように、これらの12個のチューブは 、330μlの最終容量において、0.5％ BSA/TBS、および1：400の比で最終希釈し たACA-6501血清の最終濃度を有した。全てのペプチド保存溶液は、400-500μg/m l TBSとした。30μｌの0.5％BSA/TBSおよび8.2μｌのACA-6501血清(0.5％BSA/TB Sにて1：10の比で希釈したもの)を含むチューブに、４種のペプチド保存溶液の それぞれから１μｌ、４μｌ、または16μｌのアリコートを加えた。さらに最終 容量が330μｌとなるように、適切な容量のTBSを加えた。競合ペプチドを含まな いコントロールチューブを、最終容量660μｌとなるよう実施例５に記載した通 り調製した。 ４価ペプチドで被覆したプレートのブロッキングインキュベーションを行った 後、４種のペプチドのそれぞれのペプチド濃度のチューブ、ならびにペプチドを 含まないコントロールチューブ、さらにブランクコントロールのチューブから３ つの100μｌのアリコートを、実施例５に示したように実験した。マイクロタイ トレーションプレートELISA手順ならびにデータ運用を、実施例５に記載のよう に行った。図13に示したように、９位をα-Me-Proに置換したペプチド727は、非 改変ペプチド3B10、または両方のプロリンを変えたアナログ(ペプチド728)より も活性が有意に上昇していた。3位を置換したペプチド726は、置換の結果として 活性を失った。 実施例７：6626 抗体およびそれに対応する配列を用いるスクリーニングの簡単 な説明 アフィニティー精製したACA-6626(AffACA-6626)を、前述の通り8mlのACA-6626 血漿からアフィニィティー精製により単離した。AffACA-6626(10μg)を、ACA-65 01生物選抜に関して前述したように、最終容量100μｌの全てのp-III成分ライブ ラリーのプールから成るエピトープxy'zファージライブラリーと一緒にインキュ ベートした。３回の生物選抜の後、２回目、３回目の試料から無作為に選択した ファージ、マイクロ選抜により試験した。わずかなクローンのみが、１：1000の 希釈度で弱いながらも免疫陽性であった。さらに４回目の生物選抜を行った。４ 回目のクローン94涸のマイクロ選抜から、43個の免疫陽性が明らかとなり、いく つかは1：100,000という高いファージ希釈度でも陽性であった。ACA-6501に関し て前述したように、43個の免疫陽性クローンのG-トラッキングDNA配列決定を行 ったところ、５個の独特の配列が明らかとなった。慣習的な４塩基DNA配列決定 の後、表３の翻訳アミノ酸配列が得られた。 実施例８：患者6644由来のACAに特異的な配列の同定 epi^xy'zファージディスプレイライブラリーを、患者番号6644からACAアフィニ ィティー精製した抗体を用いて実施例４と同様の方法でスクリーニングした。ペ プチド合成の前に、最終的な同定工程段階として前述のコロニーブロットアッセ イを用いた。約150個のコロニーを元のニトロセルロースメンブラン上にプレー トし、そしてアッセイした。患者6644由来の抗体を、1μg/mlの濃度で用いた。 ニトロセルロースメンブラン上にプレートし、アッセイした150個のコロニーの うち、このスクリーニングで、４個だけが強力な陽性を示し、２個が弱い陽性を 示した。このスクリーニングにより選択された６個の陽性ファージのインサート の配列決定は、インサートは全て遊離アミノ末端(epi^z) を有する８マーライブラリーに由来した。 実施例９：ACA-6641を用いるファージライブラリースクリーニングの要約 患者番号6641由来の4mlの血漿から、AffACA-6641を単離した。前述のように、 最終容量100μｌで、AffACA-6641(10μg)をプールしたp-IIIファージライブラリ ーと共にインキュベートした。４回の生物選抜後、３回目および４回目からの45 個のクローンを、マイクロ選抜により試験した。45涸のうち、23個は陰性であっ た。３回目のファージは、２個のクローンが4+のスコアであり、２個が3+のスコ アであり、２個が2+のスコアであった。４回目からは、１個のクローンが4+のス コアであり、１個が3+のスコアであり、３個が2+のスコアであった。G-トラッキ ングDNA配列決定の結果、６個の独特の配列を得た。クローン3G3の一つだけが、 ファージ捕獲ELISAで強い陽性であった。４塩基DNA配列決定から、次のような翻 訳ペプチド配列を得た。 CLGVLGKLC 実施例10：非免疫学的多価キャリアーへのペプチド結合 B細胞寛容原の発展のためのいくつかの４価プラットフォームは、以下の関連 物に記載されたように行った。共有に係る継続出願の米国特許出願第08/118,055 号（1993年９月８日出願）、同第08/152,506号（1993年11月15日出願）、米国特 許第5,268,454号、同第5,276,013号、同第5,162,515号、これらは全体が本明細 書中に参考として援用される。エピトープライブラリーのaPL抗体スクリーニン グにより選別された候補ペプチドを結合させ、抗体の結合のような免疫化学的挙 動の変化について試験した。 アミン基を有する非免疫原性多価プラットフォームを、次のようなスキームに 示されるように合成した。 化合物２： 無水エタノール50ml中に8.0g(5.7mmol)の１を含む溶液および35ml のシクロヘキセンを含む溶液を窒素下に置き、そして炭素上の10％Pd 500mgを加 えた。混合物を、撹拌しながら２時間環流した。冷却する際に、混合物をセライ トを通して濾過し、濃縮することで5.0gのオイル状の２を得た。 遊離カルボキシル基で保護されたペプチド(PHN-peptide-CO₂H ペプチドを、Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂のFMOC化学、トリフルオロ酢酸 (TFA)安定保護基(カルボキシル基上のベンジルエステルまたはシクロヘキシエス テルおよびアミノ基上のカルボベンジルオキシ(CBZ)を用いて標準的な固相法で 合成した。アミノ酸残基をアミノ末端に逐次結合させた。ペプチドをTFAを有す る樹脂から取り除いて、カルボキシル末端で１つの遊離カルボキシル基を提供し 、そして他の全てのカルボキシル基、アミンをブロックした。保護されたペプチ ドは逆相HPLCにより精製した。 ペプチド-プラットフォーム結合４ 保護したペプチド(0.3mmol)を、ジメチルホルムアミド（DMF）1mlに溶解し、 その溶液に0.3mmolのジイソプロピルカルボジイミドおよび0.3mmolの1-ヒドロキ シベンゾトリアゾル水和物(HOBT)を加えた。この溶液を0.025mmolのテトラアミ ノプラットフォーム、1ml DMFに溶解した２を加えた。完了後、未粗製の完全に 保護された結合体３を得るため、真空下でDMFを除去した。結合体3を１時間0℃ でアニソールの存在下でフッ化水素酸(HF)と反応させることで複合体４を得た。 精製を調製用逆相HPLCにより達成した。 以下に、プラットフォーム上でのペプチドのアミノ基のカルボキシル基への結 合のスキーム示す。 化合物５- ４個のカルボキシル酸基を有するプラットフォーム コハク酸無水物(1.0g，10mmol)を、861mg(1.0mmol)の２および252mg(3.0mmol) のNaHCO₃を含む1/1ジオキサン/H₂O 20ml溶液に加える。そしてその混合物を室温 で16時間撹拌する。混合物は1N HClで酸性にし、そして濃縮する。濃縮液を、シ リカゲルクロマトグラフィーにより精製して５を提供する。 遊離アミンを持つペプチド(H₂N-ペプチド-CONH₂) ペプチドを、アミド樹脂上で標準的な固相法を用いて合成する。これは、TFA の安定な保護基(カルボキシル基上のベンジルエステルまたはシクロヘキシルエ ステルおよびアミノ基上のCBZ)を用いて樹脂から切断した後にカルボキシ末端ア ミドを得る。アミノ酸残基を、標準的なFMOC化学を用いて逐次アミノ末端に添加 する。保護されたペプチドに遊離アミンリンカーを提供するため、トリフルオロ 酢酸を用いてペプチドを樹脂から取り除く。保護されたペプチドを、逆相HPLCを 用いて精製する。 ペプチド-プラットフォーム結合体、７ DMF 1mlに、0.05mmolの遊離アミンを有する保護ペプチド(H₂N-ペプチド-CONH₂ )、0.1mmolのジイソプロピレチルアミン、および0.01mmolの５を加えた溶液を調 製する。BOP試薬(ベンゾトリアゾル-1-イロキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホ ニウムヘキサフルロホスフェート)(0.1mmol)を加え、そして混合物を分析HPLCに より証明されたように、反応が完了するまで撹拌する。ペプチド保護基を、0℃ でアニソールの存在下でHFで処理することにより取り除き、保護基が除去された 結合体の７を得る。化合物７を、調製逆相HPLCにより精製する。 以下のスキームは、どのようにメルカプト基リンカーをペプチドのアミノ末端 に結合させ、次に、どのようにペプチド/リンカーをテトラブロモアセチル化プ ラットフォームに結合させて、化合物13が生ずるかを示す。 化合物９ 濃硫酸(100μl)を、60℃の、4.48g(17.2mmol)のトリフェニルメタノールおよ び1.62g(15.3mmol，1.3ml)の3-メルカプトプロピオン酸を含有する35mlのEtOAc 溶液に加えた。混合物を60℃で10分間撹拌し、室温(RT)に冷却して、１時間氷上 に置いた。得られた白色固体を、濾過により回収して4.52g(75％)の９を得た。 化合物10 ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(2.41g，11.7mmol)を、０℃の、2.72g( 7.8mmol)の９および1.08g(7.8mmol)のp-ニトロフェノールを含有する41mlのCH₂C l₂溶液に加えた。混合物を16時間撹拌し、室温まで戻した。混合物を濾過するこ とでN,N-ジシクロヘキシウレア(DCU)を除去し、濾液を濃縮した。残渣をヘキサ ン/CH₂Cl₂から結晶化させることで、淡い黄色の結晶として3.17g(86％)の10が得 られた。 化合物11−結合したメルカプトプロピオニルリンカーを有する環状チオエーテル ペプチド 環状チオエーテルペプチド(一つのイオウをCH₂に置換した環状ジスルフィドペ プチドのアナログ)および炭酸ナトリウムを含む水ならびにジオキサンを、p-ニ トロフェニルエステル10で試験した。もし、ペプチドがリジンを含むならば、お そらくブロックされるに違いない。生じた修飾ペプチドをトリフルオロ酢酸と反 応させて、チオールリンカー修飾ペプチド11を得た。 化合物13−環状チオエーテルペプチドとブロモアセチル化プラットフォームとの 結合体 0.10mmolのチオール修飾ペプチドを含有するHe散布された100mMホウ酸ナトリ ウムpH9溶液に、9/1=MeOH/H₂O中40mg/mlとして0.025のブロモアセチル化プラッ トフォーム12を加えた。溶液を、HPLCにより証明されたように結合が完了するま で、N₂窒素雰囲気下で撹拌した。結合体を逆相HPLCにより精製した。 実施例12：LJP685の合成 γ-ブロモ-N-BOC-α-アミノブチル酸t-ブチルエステル、化合物14： 40mlの乾燥THF中に4.03g(13.3mmol)のN-BOC-グルタミン酸-α-t-ブチルエステ ルおよび1.61ml(1.48g，14.6mmol)のN-メチルモルホリンを含む溶液を、N₂雰囲 気下で15℃まで冷却した。この混合物にイソブチルクロロホルミン酸(1.73ml, 1 .82g，13.3mmol)を滴下した。混合物を10分間撹拌し、そして8mlのTHF中に2.03g (16.0mmol)のN-ヒドロキシ-2-メルカプトピリジンを含む溶液を加え、さらにEt₃ N 2.23ml(1.62g，16.0mmol)を加えた。光を遮るために混合物をホイルで覆い、 そして室温で１時間撹拌した。混合物を濾過し、そして濾液を光に極力曝さない ように注意しながらロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液を20mlのBrCC l₃に溶解し、そして溶液を-70℃まで冷却した。固体を真空下に置き、次いでN₂ でパージし、室温まで戻し、20℃の水浴に置いた。その後上方近距離から500Wの 太陽灯を５分間照射した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、シリカ ゲルクロマトグラフィー(40mm×150mm，トルエンをUV活性物質が溶出し終わるま で溶離剤として用いた。2％ EtOAc/トルエン(500ml)，5％ EtOAc/トルエン(500m l))を用いて精製した。未精製の分画を再度精製した。TLC（R_f0.23，5％EtOAc/ トルエン）による精製画分を混合し、そして濃縮することで3.23g（72％）の化 合物14が油状固体として生じた。 N-BOC-グリシルプロリン-4-ニトロフェニルエステル，化合物15： 乾燥THF 82mlに3.0g(11.6mmol)のN-BOC-グリシルプロリンおよび1.93g(13.9mm ol)の4-ニトロフェノールを含有する溶液を0℃まで冷却し、3.34g（16.2mmol） のDCCを加えた。混合物を０℃で１時間撹拌し、氷浴を取り除き、混合物を室温 で16時間撹拌した。混合物にHOAc(579μl)を加え、30分間撹拌した。混合物をフ リーザーに30分間置いた後、真空濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマト グラフィー(18×150mmベッド，2.5％ EtOAc/97.5％ CH₂Cl₂/1％ HOAc)を用いて 精製した。微量の酢酸を、ロータリーエバポレーターで数回ジオキサンから濃縮 することで除去した。濃縮物を1/3ヘキサン-Et₂Oを加えて摩砕し、生じた白色固 体を濾過により回収して4.1g(90%)の化合物15を白色固体として得た；TLC Rf 0. 09、40/60/1 EtOAc/ヘキサン/酢酸HOAc。 N-FMOC-S-t-ブチルチオシステインアミド、化合物16： 115mlのTHF中に、5.0g( 11.6mmol)のFMOC-S-t-ブチルチオシステインおよび1.33g(11.6mmol)のN-ヒドロ キシスクシンイミドを含む溶液を0℃に冷却した。溶液に3.58gのDCC(17.37mmol) を加えた。0℃で1時間攪拌し、1.6gの(NH₄)HCO₃を含む50ml水を42.9ml加えた。 この混合物を4.5時間攪拌し、氷浴から徐々に室温に戻しロータリーエバポレー ターで濃縮してTHFを除去し、水相と白色固体を生じた。この混合物に200mlのCH₂ Cl₂を加え固体がほとんど溶解するまで攪拌し、100mlの1N HClを加えて振った 。CH₂Cl₂層を100mlの飽和NaHCO₃溶液で洗浄し、(Na₂SO₄)で乾燥し、濾過した。 濾液をホットプレート上で沸騰させ、CH₂Cl₂ヘキサン300mlから結晶化させて4.3 6g(87%)の白色固体の化合物16を得た；mp127〜129℃； 化合物17： 2.91g(6.75mmol)の化合物16を含有する33.8mlのジオキサンに水(16 .9ml)を加え、窒素を5〜10分導入した。この混合物を窒素雰囲気下でを保持し、 溶液に1.13gのNaHCO₃(13.5mmol)を加え、その後1.77mlのPBu₃(1.44g、7.09mmol) を加えた。この混合物を室温で1時間攪拌し、1X 100mlの1N塩酸水溶液と2X 100m lの塩化メチレンとの間で分割した。CH₂Cl₂層を組み合わせ、そして濃縮し、33. 8mlのジオキサンに部分的に溶解した白色固体を生じた。水(9ml)を加え、5〜10 分窒素でパージした。混合物を窒素雰囲気で保持し、2.17gのK₂CO₃(16.9mmol)を 加え、その後化合物14を2.63g(8.1mmol)加えた。16時間攪拌し、1X 100mlの1N H Cl水溶液と2X 100mlの10% MeOH/CH₂Cl₂との間で分割した。CH₂Cl₂層を組 み合わせ、NaSO₄で乾燥し、濾過し、そして濃縮して半固体の残渣を得た。シリ カゲルクロマトグラフィー(1/3 CH₃CN/CH₂Cl₂)で精製して3.2g(80%)の白色固体 の化合物17を生じた；TLC R_f0.27、1/3 CH₃CN/CH₂Cl₂。分析サンプルのさらなる 精製をヘキサン-EtOAcから再結晶することにより行った；mp105〜106.5℃； 化合物18： 1.27g(2.11mmol)の化合物17に23.2mlの20/1/TFA/H₂O/メルカプトエ タノール溶液を加えた。混合物を室温で1時間攪拌し、約3ml容量に濃縮した。50 mlのエーテルを加えて産物を沈殿させた。生じた固体をさらに２倍のエーテルで 洗浄し、そして真空乾燥して812mgの固体を得た。固体を10.6mlのジオキサンお よび10.6mlの水に懸濁した。NaHCO₃(355mg、4.22mmol)をこの混合物に添加し、 その後1.33g(3.38mmol)の化合物15を含む10.5mlのジオキサン溶液を加えた。こ の混合物を室温で20時間攪拌し、そして100mlの1N HClと3× 100mlのCH₂Cl₂との 間で分割した。組み合わせたCH₂Cl₂層を(Na₂SO₄)で乾燥し、濾過し、そして濃縮 した。シリカゲルクロマトグラフィー(35 X 150mm、段階的グラジエント、5/95/ 1 MeOH/CH₂CL₂/HOAc(1L)〜10/95/1)により精製した。純粋な画分を濃縮し、残渣 をエーテルで摩砕して881mg(60%)の化合物18を生じた。TLC R_f0.59、10/90/1 Me OH/CH₂Cl₂/HOAc;mP116〜117.6℃； N-FMOC-L-アラニル-L-2-メチルプロリン、化合物19： 2-メチルプロリン(Seeba chら(1983)J．Am．Chem．Soc．105: 5390-5398)(1.00g、4.75mmol)、4.00gのNaH CO₃(47.6mmol)、および31mgのHOBT(0.23mmol)を含有する6.9mlのDMF溶液を0℃に 冷却し、そしてN-FMOC-L-アラニンを加えた。反応物を、0℃で1時間、次いで室 温で18時間攪拌した。混合物を50mlのEtOAcと3X 50mlの1N HClとの間で分割した 。EtOAc層を(MgSO₄)で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。シリカゲルクロマトグ ラフィー(段階グラジエント45/55/1 EtOAc/ヘキサン/HOAc〜47/53/1 EtOAc/ヘキ サン／HOAc〜50/50/1 EtOAc/ヘキサン/HOAc)により精製することにより、白色固 体の化合物19を1.72g(86%)得た。産物を、微量の酢酸を除去するためジオキサン から数度濃縮した：mp59〜60℃。 N-FMOC-L-ロイシニル-HMPB-MBHA樹脂： N-FMOC-L-ロイシン中に22.5mlのCH₂Cl₂ および数滴のDMFを含有する溶液を0℃に冷却した。この溶液にジイソプロピルカ ルボジイミド(DIC)1.71ml(1.38g，10.9mmol)を加え、混合物を0℃で20分攪拌し た。溶液を濃縮して油状にした；その間に、2.5g(0.87mmol/g、2.18mmol)のHMPB -MBHA樹脂(Nova Biochem)に十分な量のDMF(およそ3ml)を加えて樹脂を膨潤させ た。濃縮油を最小量のDMF(およそ1ml)で溶解し、膨潤した樹脂に加え、続いてお よそ1mlのDMFに溶解し、266mg(2.18mmol)のDMAPを加えた。混合物を1時間穏やか に振とうし、洗浄(2X DMF、2X MeOH、2X DMF、2X MeOH)した。樹脂を真空乾燥さ せて2.77g(85%)を得、そして置換量をGeisen試験で0.540mmol/gと決定した。 アスパラギン酸にt-ブチルエステル、アルギニンにPmc基を有し、そしてチオエ ーテルインサートを有するN-FMOC-直鎖状ペプチド、化合物20： このペプチド は、N-FMOC-L-ロイシニル-HMPB-MBHA樹脂上での標準的なFMOC合成法により調製 した。化合物18の結合工程を除いて3等量のアミノ酸、HOBT、および(DIC)を各々 の結合工程に用いた。化合物18の2等量を、3等量のHOBT、ジイソプロピルカルボ ジイミドとともに用いた。各工程を、10μｌのブロモフェノールブルー指示薬を 用いてモニターした。反応の完了をまたニンヒドリン試験(1mgを、ピリジン1滴 、および5%ニンヒドリンを含有するエタノール溶液1滴、ならびに80%フェノール を含有するエタノール液1滴とともに100℃で2分加熱すると、反応が完結してい ないビーズが青色に変化する)により評価した。従って、1.13mg(0.613mmol)の樹 脂をペプチドを調製するために用いた。最後の結合工程後、15mlの1%トリフルオ ロ酢酸を含有するCH₂Cl₂溶液で2分間処理して樹脂からの切り出した。2分後、溶 液を加圧濾過して30mlの10%ピリジン含有MeOH溶液に滴下した。これを10回繰り 返し、HPLC(C18、グラジエント、60/40/0.1 CH₃CH/H₂O/TFA〜90/10/0.1、CH₃CH/ H₂O/TFA 210 mn、1ml/分、4.6mm X 250mmカラム)で確認されたようにペプチドを 含む濾液を濃縮した。濃縮物を、10%HOAc溶液40mlに溶解し、HPLCで精製して0.5 28g(49%)のペプチド20を得た。 ペプチド20の環状ペプチド21への変換(FMOC基の除去、環化および保護基の除去) ： 99mlのDBUを含む10mlのCH₃CN溶液(5ml)を、96mg(0.052mmol)のペプチド20に 加えた。この溶液を1時間攪拌して残渣に濃縮た。この残渣を2X 10mlのEt₂O で摩砕して白色固体を得た。固体を100mlのCH₃CNおよび0.1Mのジフェニルフォス フォリルアジド(DPPA)を含有するCH₃CN溶液312ml/(0.312mmol)に溶解した。混合 物を20時間攪拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を2X 50mlのEt₂ Oで摩砕し、くすんだ白色固体を92/3/2/3 TFA/アニソール/EDT/Me₂S 5mlで1時間 処理した。50mlポリプロピレン遠心管中で、産物をEt₂O 40mlを加えて沈殿させ た。沈殿物を0℃に冷却し、2000rpmで5分間遠心分離した。上清をデカントし、 ペレットをEt₂Oで洗浄し、再び遠心分離した。ペレットを乾燥させ、4mlの50/50 CH₃CN/H₂Oに溶解した。この混合物を36mlのH₂O/0.1%TFA水溶液で希釈し、濾過 し、そしてHPLC(1”C₁₈カラム、グラジエント、10/90/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA〜35/6 5/0.1、CH₃CN/H₂O/TFA 230nm)で精製した。HPLCで確認した純粋な画分を凍結乾 燥して52mg(90%)の化合物21を得た。 実施例12: LJP685結合体の合成 LJP685(化合物21としてもいわれる)を3-トリチルメルカプトプロピオン酸のPN Pエステルで処理し、生じた産物を脱トリチル化して遊離チオールリンカーを有 するペプチドである(化合物22)を得た。原子価プラットフォーム分子12と過剰な 化合物22との反応で、4価の結合体25が生成された。化合物21を、より長いリン カーを有する化合物33(下記の反応スキーム参照)で処理し、その後脱トリチル化 して化合物24を得た。化合物24と原子価プラットフォーム分子12を反応させて4 価結合体26を得た。どちらの結合反応もHPLCにより非常にはっきりと示された。 LJP685に対するMTUリンカーの結合、化合物24の合成： 15mg(0.013mmol)の化合 物21を、29.5mgの化合物23と17.5μlのジイソプロピルエチルアミンの両方を含 む0.5mlのDMF溶液160μlに加えた。この混合物を2時間攪拌し、Et₂Oで沈殿させ た。沈殿を乾燥した後、650mgの1/1/0.056/0.040 TFT/CH₂Cl₂/チオフェノール/M eSに溶解してこの溶液を1時間放置した。Et₂O沈殿は、HPLC(C₁₈,グラジエント、 15-45% CN/H₂O/水、0.1%TFA)で精製された粗化合物24を生じた。純粋な産物を含 む画分を凍結乾燥して8.6mgの白色固体の化合物24を得た。 LJP685-MTU-AHAB-TEG、化合物26： ヘリウムを導入したpH8.5、200mMホウ酸緩 衝液630ml中に8.6mg(6.3X10^-6mol)の化合物24を含む溶液を、40mg/mlの化合物12 の溶液を含有する40μlの9/1 MeOH/H₂Oに加えた。この混合物を24時間攪拌し、1 mlの10% HOAc/H₂Oを加えた。混合物をHPLC(C₁₈、グラジエント25-55% CH₃CN/H₂O /水、0.1%TFA)で精製して、8.3mgの化合物26(LJP685-MTU-AHAB-TEG)を得た。 実施例13: 拡張SHリンカーの展開 チオ安息香酸エステル(化合物28)を化合物27から調製した。化合物28を部分的 に化合物29に変換した。チオ安息香酸をエタノール分解で除き、得られたチオー ルをトリチル化した。次いでエチルエステルを加水分解して化合物29を調製した 。化合物29からニトロフェニルホスフェート(PNP)エステル(化合物30)を調製し た。化合物27をアジ化ナトリウムで処理しアミンを還元して、アミノトリオキソ ウデカン酸エチルエステル(化合物31)を調製した。アミン31を化合物30でアシル 化し て化合物32を得た。水酸化ナトリウムでの処理で化合物32を加水分解して遊離の カルボン酸を得た。中間体のカルボン酸をp-ニトロフェノールと縮合させてパラ ーニトロフェニル(PNP)エステル(化合物33)を得た。リンカー33にペプチドを結 合させトリチル基を除いて化合物34を得た。これはMTU-ATU-AHAB-TEG結合体の生 成に用いる。 実施例14：(LJP685)₄/MTU-ATU-AHAB-TEG結合体(化合物35)の合成 4価結合体35を以下に示すように調製した。リンカーと結合したペプチド(化合 物34)を、ヘリウムを導入したpH8.5、200mMのホウ酸緩衝液に溶解した。この混 合物に、0.3当量モルのプラットフォーム化合物12を加えた。1時間攪拌して産物 をHPLCで精製した。 実施例15：(LJP685)₄/DABA-PEG結合体(化合物36)の合成 pH8.5ホウ酸緩衝液中でIA-DABA-PEGを化合物24で処理して結合体36を得た。 実施例16：活性化のためのT細胞アッセイ ペプチドで刺激されたT細胞によるトリチウム化チミジンの取り込みを、96ウ ェル丸底プレート中でモニターした。5X10⁵個の、排出するリンパ節細胞(マウス )または単離した抹消血液リンパ球(ヒト)の単一細胞懸濁液を、1〜30μgの間の ペプチドと混ぜ、１ウェルあたりの最終容量を150μlにして、5%CO₂で37℃で中5 日間インキュベートした。この時点で1マイクロキュリーの標識化したチミジン を加え、さらに15〜24時間インキュベートした。回収した細胞をフィルター上に 集め、液体シンチレーション分光測定機で計数した。 実施例17：試験管内での耐性のインビトロ誘導 5匹のC57B1/6マウスをそれぞれ含む8つの群に、10μg/マウスのLJP685-KLHに ミョウバン、およびアジュバンドとしてのB.pertussisワクチンとの混合物で初 回抗原刺激した。3週間後、脾臓を採取し単一細胞懸濁液を調製して、平衡化塩 溶液で3回洗い、完全RPMI-1640培地に再懸濁した。濃度は1.5ml培地あたり1個の 脾臓に相当する。細胞懸濁液を2.5mlペトリ皿にアリコートし、(LJP685)₄-DABA- PEG(化合物36)および(LJP685)₄TEG(化合物35)を加えて(濃度はそれぞれ100μM、 20μM,および4μM)37℃で2時間インキュベートした。細胞の1つの群は寛容原な しでインキュベートし、陽性コントロールとして作用した。次いで細胞を大容量 の平衡化塩溶液で洗い、2.5mlの平衡化塩溶液に再懸濁した。処理したすべての 細胞をそれぞれの群において平等に5つのレシピエントに分ける様式で、650R照 射同系レシピエントマウスに注射した。陽性コントロールも含め、すべてのレシ ピエントマウスに10μgのLJP 685-KLHを含有する生理食塩水を腹膜内に注入して 補助免疫化を行った。補助免疫化の7日後にマウスを採血し、その血清を抗LJP68 5抗体の存在について試験した。どちらの結合体で処理しても、有意の、投与量 に依存した抗LJP685抗体の図16および17に示されるような減少が見られた。この 測定は，HANDBOOK OF EXPERIMENTALIMMUNOLOGY(Weir，D.M.編、Blackwell Scien tific Publications，Palo Alto、CA、1986)第2巻、Cellular Immunology、Iver son，G.M.による「インビボ養子免疫応答アッセイ」に記載の、Antigen Binding Capacity(ABC)による。 実施例18 5A12、CB2、3G3ペプチドのNMR溶液構造解析 上記の実施例に記載の方法論を用いて、ファージライブラリースクリーニング から単離した２つのペプチドをNMR解析に供した。元のペプチドは最後から2位に プロリンがあるが、2次元(2D)2量子フィルター相関分光法(DQF-COSY)NMRデータ は、この位置のシスおよびトランスアイソマーからなる2つの構造の存在を示唆 したためこのアミノ酸を除去した。プロリンを除去して得られたペプチドは、AC A抗体との結合のK_dが50-100nMの範囲にあり、DQF-COSYスペクトルのフィンガー プリント領域内に予想された数のピークがある。得られた環状ペプチドは5A12(G PCLILAPDRCG)およびCB2(GPCILLARDRCG)である。この2つのペプチド間の主な相違 点は、8位のプロリンのアルギニンへの置換である。このためCB2の1D 1H NMRス ペクトルでの分散がずっと小さく、これは5A12がより堅固なペプチドであること と矛盾しなかった。アルギニンに置換はまた、pKa値にも反映されるようなイオ ン化したアスパルチルカルボキシル基の0.55kcal/molの安定性を生じた。構造解 析をより高次の5A12ペプチドについて行った。重水素交換や温度係数のデータで は水素結合の証拠が全くないが、核オーバーハウザー効果(NOE)、回転オーバー ハウザー効果(ROE)および結合データは1つの構造と一致していた。距離幾何計算 では50構造のファミリーが生じた。上位15のものはすべての2.1 0.2オングスト ロームの原子について平均の根平均二乗偏差(RMSD)を有した。本発明者らはこの ペプチドが分子の反対側の端でターンする卵形を有していて、ジスルフィドおよ びシスが、プロリン8がそれであることを決定した。骨格のLIL領域にまたよじれ がある。最後にカルボキシ末端のグリシンは非常に可動性であり、残基内のNOE が唯一陽性である。これはβ2-GPIのACAエピトープを模倣するペプチドについて 決定された最初の構造情報を表している。 距離幾何計算と合わせたNMRデータはペプチド925(CLGVLAKLC)、6位のグリシン がアラニンに置換した短縮型のペプチド3G3(AGPCLGVLGKLCPG)の3次元構造を決定 するのに用いられた。ペプチド925の構造をpH3.8、25℃の水中で決定した。9つ の構造のアセンブルが計算され、そのすべてがNMRデータと一致するものであっ た。水素でない原子のR?MSDはそれぞれの構造を重心から比較すると2.45 0.36 オ ングストロームであった。図18は、集合の重心から最も近い構造、つまりペプチ ド925分子の形を合理的に表している。図19は、ペプチド925(図の底辺に3G3とし て標識されている)とペプチド5A12の構造を比較している。両方のペプチドとも ペプチド配列のほぼ同じ位置でターンしている。 ペプチドの薬物伝達物が小さな疎水性群および正に帯電した群であるとおよそ 見当がついてきている。図20に示すようにペプチド925の、gem-ジメチル基およ びアミノ基がこのペプチドの薬物伝達物群であるだいたい検討がつけられている 。いくつかの骨格に薬物伝達群をつなぎ止める炭化水素リンカーは図20で特定さ れた長さを持ち、これらのリンカーが骨格と結合している点が特定された距離か ら分離された。最後に、二つのリンカーの相対的な方向を決める二面角は22°と 決定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジョーンズ，デイビッド エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92127, サンディエゴ，フロリンド ロード 11265 (72)発明者 ユ，リン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122, サンディエゴ，ロンバード プレイス 8933，アパートメント 228

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．aPLエピトープが結合するＢ細胞に特異的に結合するaPLアナログ。 ２．前記アナログがＴ細胞エピトープを欠失する、請求項１に記載のアナログ。 ３．前記アナログがペプチドである、請求項１に記載のアナログ。 ４．前記ペプチドが、CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDR C、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGN PTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH、またはLTDPRYTRDISNF TDの配列を含む、請求項３に記載のアナログ。 ５．前記ペプチドが、AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGK LCPG、AGPCLGVLGKLCG、またはCLGVLGKLCの配列を含む、請求項３に記載のアナロ グ。 ６．前記ペプチドが少なくとも１つのプロリンを含み、そしてさらに少なくとも １つの該プロリンがαメチルプロリンに置換された、請求項３に記載のアナログ 。 ７．少なくとも１つのＬアミノ酸がＤアミノ酸に置換された、請求項３に記載の アナログ。 ８．前記ペプチドがジスルフィド結合によって環化された、請求項３に記載のア ナログ。 ９．前記ジスルフィド結合がチオエステル結合に置換された、請求項８に記載の アナログ。 １０．前記ペプチドが少なくとも１つのロイシンを含み、そしてさらに少なくと も１つの該ロイシンがイソロイシンに置換された、請求項３に記載のアナログ。 １１．非免疫原性原子価プラットホーム分子の結合体、および(a)aPL免疫原が結 合するＢ細胞に特異的に結合し、そして(b)該免疫原のＴ細胞エピトープを欠失 するaPL抗体結合アナログ、を含むaPL免疫原に対して特異的なＢ細胞寛容を誘導 するための組成物。 １２．前記aPL抗体結合アナログが、CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTL DRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、C TNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH、または LTDPRYTRDISNFTDの配列を含むペプチドである、請求項１１に記載の組成物。 １３．前記aPL抗体結合アナログが、AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGK LCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、またはCLGVLGKLCの配列を含むペプチドで ある、請求項１１に記載の組成物。 １４．前記aPL抗体結合アナログが、請求項６に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １５．前記aPL抗体結合アナログが、請求項７に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １６．前記aPL抗体結合アナログが、請求項８に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １７．前記aPL抗体結合アナログが、請求項９に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １８．前記aPL抗体結合アナログが、請求項１０に記載のアナログである、請求 項１１に記載の組成物。 １９．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がトリエチレングリコールを含 む、請求項１１に記載の組成物。 ２０．前記原子価プラットホーム分子がAHAB-トリエチレングリコールを含む、 請求項１９に記載の組成物。 ２１．前記原子価プラットホーム分子がDABA-TEGを含む、請求項１９に記載の組 成物。 ２２．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がポリエチレングリコールを含 む、請求項１１に記載の組成物。 ２３．前記原子価プラットホーム分子がDABA-ポリエチレングリコールを含む、 請求項２２に記載の組成物。 ２４．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がテトラアミノベンゼンを含む 、請求項１１に記載の組成物。 ２５．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がヘプタアミノβシクロデキス トリンを含む、請求項１１に記載の組成物。 ２６．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がテトラアミノペンタエリトリ トールを含む、請求項１１に記載の組成物。 ２７．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子が1,4,8,11-テトラアザシクロ テトラデカン(Cyclam)を含む、請求項１１に記載の組成物。 ２８．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子が1,4,7,10-テトラアザシクロ ドデカン(Cyclem)を含む、請求項１１に記載の組成物。 ２９．有効量の請求項１１に記載の組成物をそれが必要な個体に投与する工程を 含む、aPL抗体媒介疾患を患う個体を処置する方法。 ３０．前記aPl抗体媒介疾患が発作である、請求項２９に記載の方法。 ３１．前記aPL抗体媒介疾患が胎児死亡である、請求項２９に記載の方法。 ３２．前記aPL抗体媒介疾患が抗リン脂質抗体症候群(APS)である、請求項２９に 記載の方法。 ３３．前記aPL抗体媒介疾患が初期の抗リン脂質抗体症候群(PAPS)である、請求 項２９に記載の方法。 ３４．前記aPL抗体媒介疾患が血栓症である、請求項２９に記載の方法。 ３５．aPL抗体媒介疾患を患うヒトから単離されたaPL抗体に特異的に結合するエ ピトープのアナログを同定する方法であって、以下の工程を包含する方法： (a)ファージランダムペプチドライブラリーを調製する工程； (b)aPL模倣エピトープを同定するために該ライブラリーをaPL抗体でスクリー ニングする工程であって、ここで、該スクリーニング工程が、以下の工程を包含 する工程： (i)該ライブラリーを生物選抜によってスクリーニングする工程； (ii)(i)における生物選抜によって単離されたファージをマイクロ選抜によ ってさらにスクリーニングする工程；および (iii)(ii)で回収したaPL抗体高親和性結合ペプチドを含むファージをイムノ アッセイによって同定する工程。 ３６．ファージランダムペプチドライブラリーを生物選抜し、aPL抗体に結合す るペプチドを同定および単離する方法であって： (a)アフィニティー精製されたaPL抗体をランダムペプチドインサートを有する ファージと反応させる工程； (b)該aPL抗体に結合するランダムペプチドインサートを有するファージを回収 する工程； (c)微生物を(b)で回収したファージで感染させる工程；および (d)該ファージを単離するために、該感染微生物を抗生物質を含む培地で培養 する工程、 を包含する、方法。 ３７．ファージランダムペプチドライブラリーをマイクロ選抜し、aPL抗体に高 い結合親和性を有するペプチドを同定および単離する方法であって： (a)ランダムペプチドインサートを有するファージを生物選抜により単離する 工程； (b)工程(a)で回収した該ファージを、プロテインＧに結合したaPL抗体で被覆 されたマイクロプレートウェル中でインキュベートする工程； (c)マイクロプレートを洗浄し、未結合のファージを除去する工程； (d)結合したファージを溶出する工程； (e)微生物を(d)で回収したファージで感染させる工程；および (f)該感染微生物を抗生物質を含む培地で培養し、該ファージを単離する工程 、 を包含する、方法。 ３８．前記イムノアッセイがファージ捕獲ELISAである、請求項３５に記載の方 法であって： (a)aPL抗体で被覆されたマイクロプレートウェル中で、マイクロ選抜によって 単離されたランダムインサートを有するファージをインキュベートする工程； (b)未結合のファージを洗い流す工程； (c)該ウェルに対する標識された抗ファージ抗体をインキュベートする工程； (d)末結合の標識抗ファージ抗体を洗い流す工程； (e)標識基質を添加する工程；および (f)該基質のシグナル発生を測定して高親和性結合ファージを同定する工程、 を包含する、方法。 ３９．前記標識が酵素である、請求項３８に記載の方法。 ４０．前記基質が比色性である、請求項３８に記載の方法。 ４１．高親和性結合ファージのファージ捕獲ELISAアッセイをさらに行う工程を さらに包含する、請求項３８に記載の方法であって： (a)マイクロプレート上で均一な量のファージを被覆する工程； (b)aPL抗体を該ウェル中でインキュベートする工程、 (c)未結合の抗体を洗い流す工程、 (e)標識された抗aPL抗体を該結合aPL抗体と共にインキュベートする工程； (f)未結合の標識抗aPL抗体を洗い流す工程； (g)基質を該ウェルに添加する工程；および (h)前記基質のシグナル発生を測定し、該ファージの相対的結合親和性を測定 する工程、 を包含する、方法。 ４２．前記標識が酵素である、請求項４１に記載の方法。 ４３．前記基質が比色性である、請求項４１に記載の方法。 ４４．前記イムノアッセイがコロニーブロットイムノアッセイである請求項２６ に記載の方法であって： (a)ランダムペプチドインサートを有するファージで感染された微生物を、寒 天含有培養培地上のメンブラン上で培養する工程； (b)(a)で培養された該微生物を、該微生物を寒天含有培養培地上のメンブラン 上でブロットすることにより複製転写する工程； (c)該転写微生物をインキュベートする工程； (d)該微生物を溶解する工程； (e)該微生物を消化する工程； (f)該メンブランをブロックする工程； (g)該メンブランをaPL抗体でインキュベートする工程； (h)未結合のaPL抗体を洗い流す工程； (i)標識された抗aPL抗体を該メンブランとともにインキュベートする工程； (j)未結合の標識された抗aPL抗体を洗い流す工程； (k)基質を添加する工程；および (l)該基質のシグナル発生を測定し、高親和性結合ファージを同定する工程、 を包含する、方法。 ４５．前記メンブランがニトロセルロースである、請求項４４に記載の方法。 ４６．前記微生物がリゾチームで消化される、請求項４４に記載の方法。 ４７．前記ブロック溶液がゼラチンである、請求項４４に記載の方法。 ４８．前記標識が酵素である、請求項４４に記載の方法。 ４９．前記基質が比色性である、請求項４４に記載の方法。 ５０．aPL抗体媒介疾患を患うヒトから単離されたaPL抗体に特異的に結合する親 和性結合特性エピトープをアッセイしそしてランクづける方法であって、 (a)マイクロタイトレーションプレートのウェルをカルジオリピンで被覆する 工程； (b)該カルジオリピンに結合しそして該プレートの該ウェルへの非特異的結合 を防止するために、成熟ウシまたはヒトの血清をβ２-GPIの供給源として添加す る工程； (c)モノマーアナログおよび高力価aPL抗体の溶液を所定時間インキュベートす る工程； (d)該aPL抗体/アナログ混合物を該マイクロタイトレーションプレートのウェ ルに添加し、そして所定時間インキュベートする工程； (e)該ウェルを洗浄し、未結合のaPL抗体を洗い流す工程； (f)標識と結合した抗ヒトIgGを該プレートの該ウェルに添加し、そして所定時 間インキュベートする工程； (g)該ウェルを洗浄し、未結合の抗ヒトIgG結合体を洗い流す工程； (h)該標識結合体の基質を添加し、そして基質/標識反応を所定時間行う工程； (i)該基質/標識反応の最終産物を測定し、該ウェルに結合したaPL抗体の量を 定量化する工程； (j)該aPL抗体の結合の阻害が、もしあればその割合を計算し、該アナログの該 aPL抗体に対する親和性を決定する工程、 を包含する、方法。 ５１．前記結合体が酵素で標識される、請求項５０に記載の方法。 ５２．前記基質が比色性である、請求項５０に記載の方法。 ５３．aPL抗体媒介疾患を患っていると疑われる被験体から採取された体液中のa PL抗体の存在を決定する診断イムノアッセイであって、 (a)体液のサンプルを特異的にaPL抗体に結合するエピトープのアナログと接触 させる工程； (b)該アナログが結合したaPL抗体を検出する工程、 を包含する、診断イムノアッセイ。 ５４．請求項５３に記載のイムノアッセイであって、 (a)マイクロタイトレーションプレートのウェルを、aPL抗体に特異的に結合す るエピトープのアナログで被覆する工程； (b)該ウェルを洗浄し、未結合のアナログを洗い流す工程； (c)体液の試験サンプルを該ウェルに添加し、所定時間インキュベートする工 程； (d)該ウェルを洗浄し、未結合の試験サンプルを除去する工程； (e)標識と結合した抗ヒトIgGを該プレートの該ウェルに添加し、そして所定時 間インキュベートする工程； (f)該ウェルを洗浄し、未結合の抗ヒト結合体を洗い流す工程； (g)該標識された結合体の基質を添加し、そして該基質/標識反応を所定時間行 う工程； (h)該基質/標識反応の該最終産物を測定し、該試験サンプル中の抗aPL抗体の 存在を決定する工程、 を包含する、イムノアッセイ。 ５５．前記標識が酵素であり、そして前記基質が比色性である、請求項５４に記 載のイムノアッセイ。 ５６．ペプチドまたは他の生物活性分子を式 Ｒ¹Ｓ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）_mＣＯ₂Ｒ² を用いて原子価プラットホーム分子に結合するための親水性のリンカー、ここで ｎ＝０〜200、ｍ＝１または２、Ｒ¹＝Ｈまたはトリチルのような保護基、Ｒ²＝ Ｈまたは４-ニトロフェニルエステルのようなアルキルまたはアリールである。