JPH03505590A - ユビキチン及びｈ２ａヒストンの結合体から成る合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ユビキ　ン　びＨ２＾ヒストンの　ム　から成るム　ベア上一 本発明は汎発性エリテマトーデス（Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅ＋ｍａｔｅｕｘＤ ｉｓｓＭｍｉｎ＆、　ＬＥＤ）のような自己免疫疾患又はアルツハイマー病もし くはパーキンソン病のような神経系疾患に罹患した患者又は動物の生物体液、特 に血清中に存在する抗体により認識され得るペプチドに係る。

本発明はまた、所定の自己免疫疾患又は神経系疾患の潜在性のある人体における ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断のための、これらのペプチド及び該ペプチドを含有する組 成物の適用、並びに診断用ツール即ち「キット」の製造における該ペプチド及び 組成物の使用にも係る。

本発明は更に、これらの疾患に対する免疫組成物及びワクチン組成物の製造にお けるこれらのペプチドの適用にも係る。

本発明は最後に、これらの免疫原性ペプチド又は免疫原性にされるペプチドによ りｉｎ　ｖｉｖｏで誘導され得る抗体、自己免疫疾患又は神経系疾患に罹患した 人体におけるｉｎ−四１■−診断のための、これらの抗体及び該抗体を含有する 組成物の適用、更にはこれらの疾患に対する医薬の製造における該抗体及び組成 物の適用に係る。

ストレスタンパク質は非つィルス性悪染及び所定の自己免疫疾患のような多様な 疾患に関与する。ちなみにＳ、Ｍｕｌｌｅｒ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８５：８１７６、１９８８）は、ユビキチンが７６個の アミノ酸残基を含み且つ汎発性エリテマトーデス（ＬＥＤ）の主要な抗原標的で ある全真核細胞に存在する熱シヨツクタンパク質であることを記載した。　Ｖ、 Ｎａｎｅｔｔｏ他（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳ＾８５ ：４５０１Ｊ９８８）は、ユビキチンがアルツハイマー病及びパーキンソン病の ような神経系疾患に関与することを指摘した。　Ｂ、Ｓ、　ＰＯＬＬ＾（１ｍｌ ｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ　９：１３４．１９８８）の教示によれば、熱シヨツク タンパク質は体温上昇が主要な臨床徴候であるような全炎症症例に重要な役割を 果し得る。

今日、ユビキチンが遊離状態、又は核、細胞質もしくは膜の多数のタンパク質に 結合した状態、又は微小管に関連した状態で細胞中に存在し得ることは認められ ている。

細胞質ゾルのユビキチンの結合体は損傷又は異常タンパク質の分解の選択的媒介 物質であるとして知られている。

核のレベルにおいて、ユビキチンとＨ２＾及び）１２８ヒストンとの結合体の役 割は依然として解明されていない、これらの結合体の形成は特にクロマチンの能 動的に転写された領域に介在し且っクロマチンの緩和に関与し得るヒストンの可 逆的な選択的修飾に由来する。ユビキチンは更に、酵素ヒス１−ンデアラチラー ゼの活性を刺激することによりクロマチンの構造を間接的に修飾し得る。Ｍ、Ｒ ｅｅｈｓｔｅｉｎｅｒ＜＾ｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　３：１．１９８７）の論文は、ユビキチンと 核のヒストンとの結合体が細胞質ゾルのユビキチンの結合体よりも分解速度が遅 いことを述べている。

Ｈ，Ｂｕｓｃｈ他（Ｍｏｌｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　ｂｉｏｌ、　３：１．１９８１） 及び＾、’ｌＪ、　Ｔｈ。

ｒｎｅ他（ＥＭＢＯＪ、６：１００５．１９８７）は、核のレベルにおいてユビ キチンがユビキチンの７６位のＣ末端グリシンのα−ＣＯＯ）Ｉ基とＨ２＾ヒス トンの１１９位及びＨ２Ｂヒストンの１２０位のりシンの側鎖のε−ＮＩＩ２基 との間の結合を介して、酵素作用によりヒストンに結合し、こうして枝分がれ分 子を形成すると記載した。

哺乳動物細胞中でユビキチンに結合したＨ２＾及び）１２Ｂヒストンは夫々１０ ％及び１％の率で存在する。

Ｓ、Ｍｕｌｌｅｒ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ ５：８１７６、１９８８）は、ユビキチン及び該ユビキチンのアミノ酸残基２２ 〜４５に対応する合成フラグメントとＥＬＩＳΔ型の酵素抗体試験で反応するこ とが可能な抗体が汎発性エリテマトーデス罹患患者の血清中に存在すると記載し た。

本発明者は更に研究を進め、汎発性エリテマトーデス罹患患者の血清が同様にイ ムノトランスファープロット法において、意外にもユビキチンの市販調製物中で 汚染物質として認識される約５２及び４３キロダルトンの２つのポリペプチドと 反応することを確認するに至った。

Ｈ２＾及びＨ２Ｂヒストンの特異的抗血清を使用することにより、本発明者はこ れらの４３及び５２キロダルトンの２つのポリペプチドが夫々Ｈ２＾ヒストン、 に結合したユビキチンと、Ｈ２＾ヒストン及び）１２Ｂヒストンに結合したユビ キチン混合物とに対応することを立証した。

ユビキチン及びユビキチンとヒストンとの結合体のペプチド配列分研究した結果 、本発明者はユピキチンとＨ２＾ヒストンとの結合体の分枝部分に対応する合成 ペプチドを調製するに至り、４３及び５２キロダルトンのポリペプチドにおける ユビキチンとＨ２＾ヒストンとの結合体の存在を確認することができた。

これらのペプチドで免疫した動物の抗血清はユビキチン及びＨ２＾ヒストンの結 合体と特異的に反応し、Ｈ２＾ヒストン及び／又は遊離ユビキチンとは反応しな い、更に、ユビキチンと免疫学的に反応する汎発性エリテマトーデスに罹患した 患者の血清は同様にこれらのペプチドと反応する。

したがって、これらのペプチドは汎発性エリテマトーデスの診断に適用すること ができ、より広義にはユビキチンとＨ２＾ヒストンとの結合体が介在する全自己 免疫疾患又は神経系疾患の診断に適用することができる。

これらのペプチドを研究した結果、これらのペプチドが汎発性エリテマトーデス における自己抗体の出現に重要な役割を果すと思われるユビキチンとＨ２＾ヒス トンとの結合体を認識し得る抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ産生を誘導するために免疫性 であるか又は免疫性にされるという利点を有することを立証し、したがって、こ の型の疾患に対するワクチンの製造のためにこれらのペプチドを完全に適切に使 用できることを立証するに至った。

以下の文中で本発明のペプチドの構造に含まれるアミノ酸残基を表すために、次 の対応表にしたがって各天然アミノ酸を３文字で表す標記を使用する。

＾１ａ　　　　アラニン Ｃｙｓ　　　　システィン ＾ｓｐ　　　　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　　　　グルタミン酸 Ｐｈｅ　　　　フェニルアラニン 本発明のペプチドは次式： に対応するペプチドに共通する免疫特性を有する。

本発明の好適ペプチドは次式・ （式中、Ｘ及びＹは遊１１ｉ　Ｎ［１２基、炭素原子数１〜５の１もしくは２個 のアルキル基によりアミド化されたＮ）１２基、又はＮ末端アミノ酸が遊離Ｎ） １２基もしくは前記のようにアミド化されたＮＩ！２基を有する１〜１０個のア ミノ酸残基を含むペプチド基を表し、Ｚは遊離ＯＨ基、炭素原子数１〜５のアル キル基を含むアルコキシル基、又はＣ末端アミノ酸が遊ＭＯＷ基もしくは前記の ようなアルコキシル基を有する１〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド基を表 す〉に対応する。

Ｘ及び／又はＹ及び／又は２に含まれる１〜１０個のアミノ酸残基の基は、本質 的に式（１）のペプチドの免疫学的特性を維持するように選択される。

式（１）中、ユビキチンとＨ２＾ヒストンとの結合体中のこれらの２つの化合物 の間の分校レベルにおいて配列ｃｒｙ−ｃｒｙ−＾ｒｇ−Ｌｅｕはユビキチンの 配列フラクションに対応し、配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＧｌｕはＨ２＾ヒス トンの配列のフラクションに対応する。したがって、Ｘ及び／又はＹ及び／又は ２に含まれる１〜ＩＯ個のアミノ酸残基の基は特に、ユビキチンとＨ２＾ヒスト ンどの結合体において式（１）のペプチドの隣接アミノａ残基に対応し得る。

式（Ｉｔ）のペプチドのうちでは、Ｙが遊ｕＮＨ２又は遊Ｉ　ＮＯ３基を有する 残基Ｔｙｒを表し、Ｘが場合によりアセチル化されたアミン官能基を有する残基 Ｃｙｓを表し、２がＯＨ基を表すようなペプチドが特に好適である。

式（ｆｆ＞のペプチドのうちでは同様に、Ｙが遊１１ｊｉＮｌ＋２基又は遊離Ｎ ｌ２基を有する残基Ｔｙｒを表し、Ｘが２つの残基Ｌｅｕ及びＰｒｏの連頌（残 基Ｐｒｏは式（ｎ）におけるＸの隣接残基Ｌｙｓとのペプチド結合により結合さ れ、残基Ｌｅｕのアミン官能基は場合によりアセチル化されている）を表し、２ がＯＨ基を表すようなペプチドも好適である。

本発明は具体的には次式： （式中、残基Ｌｅｕのアミン官能基はアセチル化（Ａｃ）されている）及び次式 ： （式中、残基Ｃｙｓのアミン官能基はアセチル化（＾Ｃ）されている）に対応す る。

本発明は前記ペプチド以外に、１つ又は複数のアミノ酸の挿入及び／又は欠失及 び／又は置換によって修飾された、但し前記ペプチドの抗原特性又は免疫原特性 はそのまま保持しているペプチドにも係わり、更にペプチド結合（−ＣＯ−Ｎ） １〜）が例えば−ＣＯ−Ｎ（Ｃ）１３）−１−Ｃｆ１２−ＣＨ２−−ＣＯ−ＣＨ ２−のような構造で置換されているペプチド、あるいはペプチド以外が１つ又は 複数の挿入基、例えば−ＣＨ２−１−Ｎ）Ｉ−１−〇−のような挿入基を有する ペプチドにも係わる２本発明はまた、不斉炭素原子を有するアミノ酸残基がＤ又 はＬの形態を有するペプチドにも係わる。

本発明のペプチドは、例えばアミノ酸残基を所期の順序で順次縮合するか、又は アミノ酸残基を既に複数のアミノ酸を適当な順序で含んでいる予め形成したフラ グメントと縮合させるか、又は予め形成した複数のフラグメントを縮合させるこ とにより一般的なペプチド固相合成方法によって製造し得る。この場合、アミノ 残基又はフラグメントに担持された反応基は、縮合時に形成されるペプチド結合 に関与するアミン及びカルボキシル官能基を除いて、総て予め保護しておく。

本発明のペプチドの製造方法の１つでは、アミン官能基をｔｅｒｔブチルオキシ カルボニル基で保護したＧｌｕ残基とカルボキシル基を介して樹脂に固定し、こ の樹脂をジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸で洗浄することによってアミン官 能基を脱保護し、その後アミン官能基を前述のように保護した第２のアミノ酸残 基をジメチルホルムアミド中で結合させ、これを繰り返してアミノ酸残基を互い に固定することにより、ヒストンＨ２＾配列フラクションに対応する本発明のペ プチドの一部分を形成する。Ｎ末端残基のアミン官能基は脱保護の後、ジイソプ ロピルエチルアミンの存在下で過剰量の無水酢酸の作用によりアセチル化し得る 。

官能基を３つ有するアミノ酸の側鎖は例えば次のような基で保護し得る：グルタ ミン酸の場合はシクロヘキシル、スレオニンの場合はベンジル、アルギニンの場 合はトシル、システィンの場合はバラメチルベンジル、チロシンの場合は２，６ −シクロロベ、ンジル、成るリジンの場合はフルオレニルメチルオキシカルボニ ル、その他のりシンの場合には２−クロロベンジルオキシカルボニル。

分枝形成が生じるリジンの側鎖は有利にはフルオレニルメチルオキシカルボニル で保護し、ピペリジンとジメチルホルムアミドとの混合物でこの側鎖を脱保護し た後で、ユビキチン配列フラクションに対応する第１のグ１ノシン残基を前述の ごとく結合し、これにアミノ酸を順次結合してν）く、その結果、アミン基が脱 保護される毎にそのアミン基上にペプチド鎖が形成される。既に形成された部分 は樹脂に結合したままである。

総ての保護基を除去したら、例えばフ・ン素水素酸により本発明のペプチドを固 体支持体から遊離させる。この未精製物質を凍結乾燥し中圧液相クロマトグラフ ィーにかけると、純度的９５％の生成物が得られる。この生成物の特性を、高圧 液相クロマトグラフィーとアミノ酸組成分析と質量分析とによって調べる。

式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のペプチドのアミノ酸組成の分析結果は下記の通りで ある。

括弧内は計算値である。

−式（ＩＩＩ）のペプチド。

Ｇｌｘ　１．００（１）；Ｇｌｙ　２．００（２）；ｘｒｇ、、０．９５（１） ＸＴｈｒ　１．１５（ｉ）；Ｐｒ。

０．９５（Ｌｌ；Ｔｙｒ　１．０２（１）ルｅｕ　１８２（２１ルｙｓ　２．１ Ｈ２）−式（ＩＶ）のペプチド； Ｇｌｘ　１．０１＋１１；Ｇｌｙ　１．９７（２）；Ａｒｇ　０−９７（１１； Ｔｈｒ　ｌ−０８０１；Ｔｙｒｌ、０３（１）；、Ｃｙｓ　Ｏ，８７（１）；Ｌ ｅｕ　１．０６＋ｉｌ；Ｌｙｓｌ、８７（２〉ＦＡＢ法による質量分析で確認さ れた式（ＩＩ）及び（Ｉｎのペプチドの分子量は下記の通りである。

括弧内は計算値である。

−ペプチド（ＩＩＩ）　：１３０３．８（１３０３，５）−ヘアｆ　Ｆ　（ＩＶ ）　：　１１９６．６（１１９６，６）。

式（ＩＩＩ）及び（ｍのペプチドの安定性を１（ＰＬＣ分析によって調べた。室 温暗所で数箇月貯蔵した後でも変質は全く認められなかった。末端Ｃｙｓ残基に 起因する式（ｍのペプチドの二量体化（ｄｉｍ！ｒｉｓａｔｉｏｎ）は９％以下 であった。

本発明は、本発明のペプチドを担体分子に結合することによって形成した結合体 （ｃｏｎ　ｊｕｇｕ＆）にも係わる。担体分子は場合によっては生理学的に許容 し得る非毒性の分子である。

例えば、ＹがＴｙｒ残基を表す式（Ｉ）のペプチドは有利にはビス−ジアゾベン ジジンにより保護用タンパク質に結合し得る。本発明の別の実施態様では、Ｘが Ｃｙｓ残基を表す式（ＩＩ）のペプチドをチオール基によって担体分子又は支持 体に結合し得る。

担体分子としては、破傷風アナトキシン、アルブミン又はアルブミン血清のよう な天然タンパク質が挙げられる。

本発明のペプチドは抗原特性を有するため、ユビキチンとヒストンＨ２＾との結 合体が関与する自己免疫疾患又は神経系疾患に懸かった患者の決定又は検査を行 う診断操作で使用することができる。本発明は、これらの疾患のいずれかに懸か った患者の血清又は他の体液中に存在する自己抗体によって認識され得るペプチ ドを少なくとも１種頭含む組成物にも係わる。ペプチド−抗体複合体のｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ検出は、ＥＬＩＳΔ、イムノフルオレッサンス、ラジオイムノロジー又 はラジオイムノブレシビテーションタイプのイムノエンザイムテストで行う。

本発明は、これらのテストを実施すべく適当なマーカーで標識した本発明のペプ チドにも係わる。これらのマーカーとしては、ビオチンもしくはその誘導体、ペ ルオキシダーゼのような酵素、フルオレセインのような蛍光マーカー、ラジオア イソトープのような放射性マーカー等を使用し得る。

これらのテストは例えば下記のステップを含むニー　本発明のペプチド又は本発 明のペプチドの結合体を含む組成物を微量滴定プレートのウェル内か又はビーズ のような別の支持体上に所定量配置し、 −テストすべき生物学的液体をウェル内に配置するか又はビーズと共にインキュ ベートし、 −微量滴定プレート又はビーズをインキュベートし且つ濯いだ後で、ペプチド− 抗体複合体検出シスーテムをウェル内に配置するか又はビーズと共にインキュベ ートして、前記複合体が形成されたか否かを検出する。

全身性エリテマトーデス患者の血清をＥＬＩＳΔタイプのイムノエンザイムテス トにかけたところ、ユビキチンを認識する所与の血清集団の９６％が式（ｍのへ ブチドと反応するのに対し、自己抗体を有するユビキチンと反応しない血清は１ ３％しか式（ＩＶ）のペプチドと結合し得ないことが判明した。検査した全身性 エリテマトーデス患者の血清のうち５１．８％がヒストンＨ２＾に対する自己抗 体を含み、５３．８％が式（ｍのペプチドと反応し、４６．１％が反応しない。

本発明は、本発明のペプチドに対して形成された抗体にも係わる。これらの抗体 はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得、本発明のペプチドの１ つに対して免疫した動物の膵臓細胞と骨髄腫細胞系の細胞との間の一般的な細胞 融合方法によって形成したハイブリドーマにより産生される。

オバルブミンに結合した式（ＩＶ）のペプチドを用いてウサギ抗血清を製造した 。得られた抗体はＥＬＩＳΔタイプのイムノエン′ザイムテストではユビキチン ′ともヒス”＋−二、Ｈ２＾とも反応しない、イムノトランスファーでは５．、 ’＝ｈらの抗体によって、４３及び５２キロダルトンの感染作用フラクションが ユビキチンとヒストンＨ２＾との結合体に対応することが判明した。

本発明のペプチドは極めて特殊な分枝構造を有するため、これらのペプチドを用 いて形成した抗体はユビキチンとヒストンＨ２Δとの結合体に対して極めて特異 的なプローブを構成する。このプローブは、遊離したユビキチン又はヒストンＨ ２＾とは結合し得ない。

これまでは遊離ユビキチンをヒストンＨ２Δと結合したユビキチンと区別するこ とはできなかったが、本発明の抗体を用いればこの結合体を明確に同定すること かできる。

また、本発明のペプチドに対して形成された抗体、並びに本発明のペプチドと反 応し且つアフィニティクロマトグラフィー後に得られた患者の自己抗体は、最初 の抗原性ペプチドの正確なコピーの一部分を構成し、従って自己免疫疾患に見ら れる自己抗体に結合し得る抗イデイオタイプ抗体の製造に使用できる。

本発明はこのような抗・イブイオタ１′プ抗体と、これらの抗・イディオタイプ 抗体を含む組成物と、人体中の自己抗体の存在をｉｎ　ｖｉνＱ　ｉｔ断するた めの前記組成物の使用と、自己免疫疾、うに対する医薬の製造とにも係わる。

本発明は更に、本発明のペプチド又は抗イデイオタイプ抗体の少なくとも１つを 任意に担体分子に結合したものを有効成分とするワクチンを製造するための免疫 原組成物にも係わる。この組成物は、前記ペプチドに対する抗体の産生を誘導し 、自己免疫疾患の病理学的現象及び／又は発病を防止する。ワクチンとして使用 できる本発明の医薬組成物は、注射又は他の投与方法によって投与できる溶液又 は懸濁液からなり、本発明のペプチドを１ｋｇ当たり１１０１Ｉ〜１００ｍｇ含 む用量で使用される。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．次式： 【配列があります】（Ｉ） に対応するペプチドに共通する免疫特性を有することを特徴とするペプチド。
2. ２．次式： 【配列があります】（ＩＩ） （式中、Ｘ及びＹは遊離ＮＨ２基、炭素原子数１〜５の１もしくは２個のアルキ ル基によりアミド化されたＮＨ２基、又はＨ末端アミノ酸が遊離ＮＨ２基もしく は前記のようにアミド化されたＮＨ２基を有する１〜１０個のアミノ酸残基を含 むペプチド基を表し、Ｚは遊離ＯＨ基、炭素原子数１〜５のアルキル基を含むア ルコキシル基、又はＣ末端アミノ酸が遊離ＯＨ基もしくは前記のようなアルコキ シル基を有する１〜１０個のアミノ酸残基を含むペプチド基を表す）に対応する ことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
3. ３．式（ＩＩ）中、Ｙが遊離ＮＨ２基又は遊離ＮＨ２基を有する残基Ｔｙｒを表 し、Ｘが２つの残基Ｌｅｕ及びＰｒｏの連鎖（残基Ｐｒｏは式（ＩＩ）中のＸの 隣接残基Ｌｙｓとのペプチド結合により結合され、残基Ｌｅｕのアミン官能基は 場合によりアセチル化されている）を表し、ＺがＯＨ基を表すことを特徴とする 請求項１又は２に記載のペプチド。
4. ４．次式： 【配列があります】（ＩＩＩ） （式中、残基Ｌｅｕのアミン官能基はアセチル化（Ａｃ）されている）に対応す ることを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
5. ５．式（ＩＩ）中、Ｙが遊離ＮＨ２基又は遊離ＮＨ２基を有する残基Ｔｙｒを表 し、Ｘが場合によりアセチル化されたアミン官能基を有する残基Ｃｙｓを表し、 ＺがＯＨ基を表すことを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
6. ６．次式： 【配列があります】（ＩＶ） （式中、残基Ｃｙｓのアミン官能基はアセチル化（Ａｃ）されている）に対応す ることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
7. ７．ユビキチンとＨ２Ａヒストンとの結合体を特異的に認識することを特徴とす る請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドに対して形成された抗体。
8. ８．自己免疫疾患患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体を認識するこ とを特徴とする請求項７に記載の抗体に対して形成された抗イディオタイプ抗体 。
9. ９．自己免疫疾患患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体を認識するこ とを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドと反応する自己 抗体に対して形成された抗イディオタイプ抗体。
10. １０．自己免疫疾患患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体と特異的に 反応することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも１ 種のペプチドを含有する抗原組成物。
11. １１．ユビキチンとＨ２Ａヒストンとの結合体を認識することが可能な抗体の産 生を誘導することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくと も１種のペプチド又はこのペプチドと担体分子との結合体を含有する免疫組成物 。
12. １２．生物体液中における自己抗体の存在のｉｎｖｉｔｒｏ診断方法であって、 この生物体液を請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のペプチ ド、又はこれらのペプチドと担体分子との結合体又は請求項７に記載の抗イディ オタイプ抗体と接触させる段階と、物理的又は化学的方法により該生物体液中に おける抗原−抗体複合体又は抗体−抗イディオタイプ抗体複合体の存在を検出す る段階とを少なくとも含むことを特徴とする方法。