JP2003503314A - アルツハイマー病の精製抗原およびそれを獲得および使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アルツハイマー病抗原（Ａ６８）を含む調製物、この精製抗原を獲得する方法、および、この精製抗原を、例えば、アルツハイマー病の診断に、およびアルツハイマー病抗原に対するヒト自己抗体の検出に使用する方法を開示する。本発明に記載の抗原調製物は、それが実質的に免疫グロブリンＧを含まないという点で精製されている。本発明はさらに、組換えヒトタウ、ヒトを含む様々な種から単離されたタウ、およびリン酸化組換えヒトタウまたは単離タウ、並びに、Ａ６８抗イディオタイプ抗体などの、Ａ６８抗原調製物の代わりにまたはそれと共に（例えばアルツハイマー病の診断に）使用できる、アルツハイマー病抗原を製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、アルツハイマー病抗原（Ａ６８）を含む調製物、この精製抗原を得
る方法、および、この精製抗原調製物を、例えばアルツハイマー病の診断に使用
する方法に関する。本発明に記載の抗原調製物は、実質的に免疫グロブリンＧを
含まないという点で精製されている。本発明はさらに、組換えヒトタウ、ヒトを
含む様々な種から単離されたタウ、およびリン酸化組換えヒトタウまたは単離タ
ウ、並びに、Ａ６８抗イディオタイプ抗体などの、Ａ６８抗原調製物の代わりに
またはそれと共に（例えばアルツハイマー病の診断に）使用できる、アルツハイ
マー病抗原を製造する方法に関する。

【０００２】 （関連分野の記載） アルツハイマー病（ＡＤ）は、６５歳以上の人口の７％が罹患している進行的
な神経変性疾患であり、知的機能の進行的な消失により臨床的に、大脳皮質から
のニューロンの連続的な消失により病理学的に特徴づけられる。この病理学的機
能障害は、通常、新皮質中の神経突起斑の数の増加、および、コリン作動性ニュ
ーロンのシナプス前部のマーカーの減少に関連している。神経突起斑は、変性し
た軸索および神経終末、並びに、可能性あるアストロサイト様の要素からなり、
これらの斑は、中心にアミロイド・コアを示すことが多い。

【０００３】 アルツハイマー病の別の特徴的な病理特性は、神経原線維濃縮体の発達である
。神経原線維濃縮体は、正常な中間フィラメントおよび異常な特性を有する二重
らせん状フィラメント（これがねじれて濃縮体を形成する）からなる神経細胞内
の塊である。神経原線維濃縮体は、数個の異なるタンパク質からなる。

【０００４】 神経化学的研究により、神経伝達系が、アルツハイマー病により有害な影響を
受けることが確認された。最も一貫的かつ重度に影響を受ける系は、マイネルト
の基底核に位置するコリン作動性ニューロンの神経伝達系である。さらに、ソマ
トスタチン、サブスタンスＰ、および副腎皮質ホルモン放出因子の減少も観察さ
れる。

【０００５】 神経化学的変化、神経突起斑または神経原線維濃縮体などの上記の病状はいず
れもアルツハイマー病に独特なものではない。これらの機能障害は、正常な高齢
の個体の脳にも生じ、グアム・パーキンソン病、拳闘家痴呆、進行性核上麻痺な
どの他の疾病にも関連している。例えば、濃縮体を形成し神経突起斑を充填する
、ねじれたフィラメントである二重らせん状フィラメントは、特定の他の疾病で
も生じる。事実、免疫学的研究により、二重らせん状フィラメントのＡＤエピト
ープが、ピック病に罹患した脳の側頭皮質の罹患ニューロンに見られる球状構造
であるピック小体に存在することが示された。さらに、アルツハイマー病患者の
大脳皮質内の神経原線維濃縮体および神経突起斑の密度は、病気の段階と弱くし
か関連していない。

【０００６】 従って、アルツハイマー病の診断は、極めて難しい。この疾病の存命中の診断
は、主に、他の疾病の排除により実施される。Ｍｅｄｉｃｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第３巻、第３号、２２１〜２３６項（１９８３）のＰ
ｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓによる「アルツハイマー病および老年性痴呆の神経化学
」と題した文献は、アルツハイマー病を考察し、２２３項で以下のように述べて
いる： アルツハイマー病の診断における問題は、確信的な試験が全くないことである
：臨床医は、卒中、微小血管疾患、脳腫瘍、甲状腺機能不全、薬物反応、重度の
うつ病、および、高齢の人々の知的欠陥を引き起こし得る多くの他の容態といっ
た痴呆の他の原因を除外しなければならない。これらの全ての問題が症状の原因
として消去された場合にのみ、アルツハイマー病という診断が許可されるべきで
ある。

【０００７】 アルツハイマー病の存命中の診断は、特殊な染色技術を使用した、脳組織中の
神経突起斑および濃縮体の数の決定に基づいている。しかし、神経組織病理学的
研究に基づいたこのような診断法には、数個の脳切片の徹底的な染色および顕微
鏡検査が必要である。さらに、斑および濃縮体は、アルツハイマー病を有する個
体に限定されず、正常な高齢の個体または他の疾病に罹患した個体の脳にも存在
し得る。従って、診断を実施するための決定的かつ信頼性のある方法が必要であ
る。

【０００８】 Ｇｌｅｎｎｅｒらに発行された米国特許第４，６６６，８２９号は、アルツハ
イマー病に特異的な抗原を同定する試みを開示している。しかし、Ｇｌｅｎｎｅ
ｒらにより記載された抗原は、アルツハイマー病を有さない高齢の成人にも存在
する（Ｇｈａｎｂａｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、２６３、２９０７〜２９１０項（
１９９０）参照）。それ故、他の疾病または加齢の徴候とは異なるとして、アル
ツハイマー病を診断する方法が依然として必要である。

【０００９】 同様に、Ｖｏｏｒｈｅｉｓらに発行された米国特許第５，４９２，８１２号は
、患者の血液中のタウペプチドをスクリーニングすることにより実施される、ア
ルツハイマー病の診断法を開示している。この方法は、タウタンパク質のアミノ
末端の２００アミノ酸またはカルボキシ末端の５０アミノ酸から得られた、タウ
ペプチドに特異的に結合する、抗体またはＦａｂ断片の使用を必要とする。この
方法は、「様々なタウタンパク質の２００アミノ酸Ｎ末端残基の全部、並びに、
５０アミノ酸の大半のＣ末端残基のいくつかの部分が、罹患ニューロンの変性お
よび破壊中にユビキチン認識プロテアーゼまたは他のプロテアーゼによりフィラ
メントから切断されると、遊離されるであろう」ことを必要とする（５列、１２
〜１９行）。この方法はさらに、切断されたセグメントが、脳の外の体液に入る
ことを必要とする（５列、１９〜２２行）。従ってこの方法は、タウタンパク質
複合体のタンパク質分解的断片化に依存し、それが行なわれなければ無効である
。この方法はさらに、その後タンパク質分解断片が体液に放出されることに依存
し、それが行なわれなければ無効である。従って、アルツハイマー病関連抗原を
直接的にアッセイする手段、特に、タンパク質分解的断片化およびその後の血流
への断片の放出を必要としない手段が同定されることが望ましい。

【００１０】 これらの方針に沿って、ＧｈａｎｂａｒｉらのＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９６／
２０２１８号は、アルツハイマー病関連抗原、および、この抗原に対して指向さ
れるモノクローナル抗体の単離を記載している。この抗原は、アルツハイマー病
に特異的であり、アルツハイマー病患者に大量に存在し、アルツハイマー病でな
い患者にはほとんど検出されない。しかし、この抗原は、Ｇｈａｎｂａｒｉらの
調製において単に「部分的に精製」されており、主要タンパク質が約６８，００
０ダルトンの分子量を有するタンパク質凝集物からなり、タウおよび超リン酸化
タウを含むものとして記載されている（例えば、Ｇｈａｎｂａｒｉらの実施例２
参照）。従って、いくつかの適用において、より精製されたこのアルツハイマー
病抗原の調製物が望ましいおよび／または必要であり得る。

【００１１】 それ故、本発明は、とりわけ、アルツハイマー病抗原の精製調製物を提供する
。それはまた、とりわけ、精製調製物を使用してアルツハイマー病を診断する方
法も提供する。それはさらに、アルツハイマー病抗原の精製調製物を得る方法も
提供する。本発明のこれらおよび他の態様および利点、並びに、追加の本発明の
特徴は、本明細書に提供した本発明の記載から明らかであろう。

【００１２】 （発明の概要） 本発明は、とりわけ、アルツハイマー病抗原（Ａ６８）を含む調製物、並びに
、この精製抗原（Ａｇ）を獲得する方法、および、精製Ａｇを、例えば、アルツ
ハイマー病（ＡＤ）の診断に使用する方法を提供する。このＡｇは、実質的に免
疫グロブリン（ＩｇＧ）を含まない点で精製されている。本発明は、さらに、組
換えヒトタウ、ヒトを含む様々な種から単離されたタウ、およびリン酸化組換え
ヒトタウまたは単離タウ、並びに、Ａ６８抗イディオタイプ抗体（Ａｂ）などの
、Ａ６８の代わりにまたはそれと共に（例えばＡＤ自己抗体の結合に）使用でき
るＡＤ抗原を製造する方法も提供する。本発明はさらに、Ａ６８に対して指向さ
れる自己抗体とのその反応性を増強する、これらの抗原の処置も記載する。これ
らの処置は、ヒペリシン、遊離脂肪酸および／またはヒドロキシノネナールまた
は他の進行した糖化最終生成物での処理を含む。

【００１３】 本発明はまた、ＡＤを診断するために、ウシ微小管結合タンパク質調製物（Ｍ
ＡＰｆ）を使用する方法を記載する。本発明は、Ａ６８およびＭＡＰｆの両方と
の自己抗体の反応性の解析を記載し、これらの反応性の定量的または定性的解析
により、ＡＤの診断が提供される。

【００１４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 「アルツハイマー病を有する個体」により、この疾病に罹患している、または
この疾病により影響を受けている、またはこの疾病の臨床症状を顕現している、
個体または患者を意味する。本発明によると、「アルツハイマー病」の診断は、
許容された臨床診断標準に基づく。好ましくは、本発明に従ってアルツハイマー
病と診断された個体は、一般的に許容されているアルツハイマー病診断基準のほ
とんど（すなわち大半）に合致する個体である。望ましくは、特定の非定型的な
特徴のために、かかる個体は、「アルツハイマー病の可能性」と医師は記載し得
、これらの個体の少なくとも７５％から８５％が、検死解剖でアルツハイマー病
に罹患していることが判明するだろう。さらにより好ましくは、本発明に従って
アルツハイマー病と診断された個体は、利用可能なアルツハイマー病診断の最善
の臨床基準に合致する個体であり、医師は「推定アルツハイマー病」と記載し得
る。かかる診断が当業者によりなされる場合、最適にはこれらの患者の約９０％
が、検死解剖でアルツハイマー病であることが判明するだろう。

【００１５】 アルツハイマー病抗原調製 本発明は、とりわけ、Ａ６８と称されるアルツハイマー病抗原に関する。この
抗原は、アルツハイマー病患者の脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）から得られると記
載されてきたが、本明細書では、抗原が本明細書に示した特性を有するならば、
ヒトのどの部位で見出されるかに関わらず、「アルツハイマー病抗原」と称する
。１つのかかるアルツハイマー病抗原はタンパク質であり、よって、アルツハイ
マー病抗原は、タンパク質特性が考察において顕著な因子である場合には、「ア
ルツハイマータンパク質」と本明細書で称する。アルツハイマー抗原と免疫的に
反応性である自己抗体は、本明細書では、「アルツハイマー抗体」と称する。ア
ルツハイマー病抗原はまた、以下にさらに記載したような、抗原に対して指向さ
れた抗体との反応性を増加するように修飾された、この抗原を含む調製物の成分
も意味する。

【００１６】 「Ａ６８抗原の部分精製調製物」としてのアルツハイマー病抗原の同定、単離
および特徴づけは、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６／２０２１８号に記載され
ている（例えば、特に実施例２並びにこの文書の残り、これ全体を本明細書に参
考として援用する）。特に、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６／２０２１８号は
、正常個体および他の障害を有する個体と比較して、アルツハイマー病患者（実
施例２Ａ、実施例８参照）にこの抗原が限定されていることを記載する。一般に
、アルツハイマー抗原は、アルツハイマー患者に見出されるが、他の神経疾患に
罹患している患者を含む、アルツハイマーではない患者にも、はるかに低い（ま
たは測定不可能な）量で存在する。

【００１７】 本明細書に記載した抗原は、アルツハイマー病（すなわちアルツハイマー病抗
原）に関連し、数個のタンパク質を含み、主要タンパク質種は、還元ＳＤＳゲル
上で約６８，０００ダルトンの見かけの分子量を有する。抗原は、約６０から約
７０ｋＤａの見かけのＭ_ｒで、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
上でバンドまたはバンド群として電気泳動で移動する。抗原は、望ましくは、ヒ
ト脳（典型的には凍結）から調製され、アルツハイマー病患者の大脳皮質から調
製されることが最も多い。抗原の他の特徴は、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６
／２０２１８号に示され、以下の特徴を含むがこれに限定されない：ＡＴＣＣ番
号ＨＢ９２０５として同定されたハイブリドーマ細胞系により産生されるモノク
ローナル抗体（すなわちＡＬＺ−５０、以下にさらに記載）と免疫的に反応性で
ある；還元または非還元形で約６の等電点を有する：０．０１Ｍリン酸ナトリウ
ム溶液に少なくとも５０％可溶性である；ｐＨ６．８の０．０１Ｍリン酸ナトリ
ウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウムおよび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
リド溶液に少なくとも５０％可溶性で、４℃の５０％飽和硫酸アンモニウムに沈
降する。

【００１８】 それが最初に記載されて以来、アルツハイマー病抗原は、さらに、Ａ６８、超
リン酸化タウ（Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：６７５〜６７８、１９９１
）、異常リン酸化タウ（Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４９１３〜４９１７、１９８６）、可溶性ＰＨＦ（Ｇ
ｒｅｅｎｂｅｒｇおよびＤａｖｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．８７：５８２７〜５８３１、１９９０）、ＰＨＦタウ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５６４〜５６９、１９９２）およびアルツ
ハイマー病関連タンパク質（ＡＤＡＰ）（Ｇｈａｎｂａｒｉら、ＪＡＭＡ ２６
３：２９０７〜２９１０、１９９０）と称されている。

【００１９】 本発明は、Ａ６８などのアルツハイマー抗原を含むタンパク質調製物に関する
。正常タウに比べて、アルツハイマー抗原、例えばＡ６８は、超リン酸化されて
おり、変化したコンフォメーションを示す。

【００２０】 本発明の目的のために、Ａ６８は、一般に、超リン酸化形のタウを含むタンパ
ク質調製物を意味し、これは、アルツハイマー病において、二重らせん状フィラ
メントの主なタンパク質構成成分である。より特定すると、Ａ６８、「Ａ６８抗
原」および「Ａ６８タンパク質調製物」は、少なくとも超リン酸化された形のタ
ウを含み、特記しない限り、実質的にＩｇＧを含まない、タンパク質調製物を意
味する。Ｖｏｏｈｅｉｓ（米国特許第５，４９２，８１２号）により記載され使
用された正常なタウと異なり、アルツハイマー抗原であるＡ６８および超リン酸
化タウは、正常個体、すなわち、アルツハイマー病を有さない個体では測定でき
ない。

【００２１】 ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９６／２０２１８号の実施例１は、Ａ６８の「部分精
製」形を記載する（すなわち「ＷＯ９６／２０２１８ Ａ６８」）。驚くべきこ
とに、ＷＯ９６／２０２１８号の部分精製Ａ６８は、かなりの量の免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）を含むことが発見された。続いて、かかるＩｇＧの除去により、
かなりかつ驚くべきことに、前記したＡ６８タンパク質調製物の効力、および、
アッセイでの使用における効力は増加することが判明した。

【００２２】 本発明は、ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０５として同定されたハイブリドーマ細胞系
により産生されたモノクローナル抗体（すなわちＡｌｚ−５０）と免疫的に反応
性である、抗原（すなわちＡ６８）から実質的になる、タンパク質調製物を提供
し、ここでの調製物は、実質的に免疫グロブリンＧを含まない。本明細書に使用
したような「実質的に免疫グロブリンＧを含まない」は、好ましくは調製物に存
在する総タンパク質の約０．０５％以下である、さらにより好ましくは調製物に
存在する総タンパク質の約０．００１５％以下である量の免疫グロブリンＧ、お
よび／または、望ましくは抗原１μｇあたり約５００ｐｇ未満の免疫グロブリン
Ｇ（すなわち、Ａ６８の量を、Ａｌｚ−５０抗体を使用してウェスタン解析によ
り、または他の適切な手段により評価する）、最適には抗原１μｇあたり約１５
ｐｇ未満の免疫グロブリンＧである総免疫グロブリン量を有する調製物を意味す
る。特に、実質的に免疫グロブリンＧを含まないにより、望ましくは、本発明の
アッセイに干渉しない免疫グロブリンレベルを意味する。

【００２３】 さらに、本発明は、望ましくは、免疫グロブリンＧを実質的に含まない、精製
抗原調製物を提供し、この調製物は、アルツハイマー病の診断マーカーであり、
ここでの抗原は、好ましくは、 （ａ）還元形または非還元形で約６の等電点を有し； （ｂ）ａｆｆｉ−Ｂｌｕｅカラムに結合し； （ｃ）ｐＨ６．８の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウムお
よび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）溶液に少なくとも
５０％可溶性であり、４℃の５０％飽和硫酸アンモニウムに沈降し； （ｄ）ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０５として同定されたハイブリドーマ細胞系により
産生されるモノクローナル抗体（すなわちＡｌｚ−５０）と免疫的に反応性であ
る、 主要ペプチド種を含む。

【００２４】 好ましい実施形態において、精製抗原調製物は、上記したようなＡ６８タンパ
ク質調製物である。

【００２５】 アルツハイマー抗原タンパク質調製物を獲得するプロセス 従って、本発明は、アルツハイマー抗原タンパク質調製物を獲得するプロセス
を提供する。第一段階として、望ましくは、部分精製調製物を得る。好ましい実
施形態において、部分精製Ａ６８調製物は、望ましくは、 （ａ）前記抗原を含む皮質脳組織の試料を獲得し； （ｂ）前記試料を緩衝液中でホモジナイズして、ホモジネートを獲得し； （ｃ）前記ホモジネートから粒状物質を取り出し； （ｄ）前記抗原と抗体が結合して抗原−抗体複合体を形成する条件下でホモジネ
ートを前記抗体（すなわちアフィニティー精製のような、固定ＡＤ抗体）と接触
させることにより、前記ホモジネートから前記抗原を取り出し； （ｅ）前記抗原−抗体複合体から前記抗原を溶出し、部分精製タンパク質調製物
を獲得することを含む方法により獲得する。

【００２６】 より特定すると、この調製法は、望ましくは、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）な
どの約５容量の緩衝水に組織をホモジナイズすることにより実施し、ここでの緩
衝液はさらに、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む。ホモジネート
は、最適には、例えば、約４℃で約６０分間約２７，０００×ｇで遠心分離する
ことにより分画する。望ましくは、上清を収集し、好ましくは約４℃で約１６時
間繰返しアフィニティカラムを通過させる。最適には、アフィニティカラムはＭ
Ｃｌカラムであり、望ましくは、これは、Ａ６８と特異的に反応する精製マウス
モノクローナル抗体（例えば、実施例に記載したようなＭＣ１抗体）を使用し、
製造業者の指示に従って抗体をＡｆｆｉｇｅｌ−１０にカップリングすることに
より調製する。好ましくは、Ａ６８抗原は、ＭＣ１カラムマトリックスに付着す
ることにより、上清から特異的に取り出される。ＴＢＳで徹底的に洗浄した後、
Ａ６８を、最適には、例えば３ＭのＫＳＣＮを使用して、ＭＣ１カラムから溶出
し、よって、Ａ６８タンパク質調製物が提供される。Ａ６８タンパク質調製物は
、次いで、好ましくは、緩衝液（例えばＴＢＳ）に対して透析し、−８０℃で保
存する。

【００２７】 部分精製Ａ６８調製物を獲得する別の手段が、例えば。、ＰＣＴ国際特許出願
番号ＷＯ９６／２０２１８号に示されている。ＷＯ９６／２０２１８号のプロセ
スは、Ａ６８の部分精製（すなわち「濃縮」）調製物を提供するが、かなりの量
のタンパク質が調製物に残っている。特に、ＷＯ９６／２０２１８号のＡ６８タ
ンパク質調製物は、総タンパク質の約１から約５％を含む、内因性ヒト免疫グロ
ブリンを含む。これらの免疫グロブリンは、ウェスタン解析（例えば、図２、実
施例）またはＥＬＩＺＡ（例えば、表２、実施例）による、アルツハイマー抗原
に対する血清自己抗体を検出する能力に干渉する。従って、ＷＯ９６／２０２１
８号のＡ６８タンパク質調製物は、本発明によると実質的に純粋ではなく、単に
部分的に精製されている。

【００２８】 従って、血清自己抗体を解析する前に、または、ＷＯ９６／２０２１８号のＡ
６８タンパク質調製物を使用する前に、混入している免疫グロブリンを除去する
ことが本発明によると必要である。本発明は、従って、上記のプロセスに追加の
段階（ｆ）を提供し、この段階は、溶出液から免疫グロブリンＧを除去し、実質
的に免疫グロブリンＧを含まない抗原調製物を得ることを含む。これは、例えば
、ＷＯ９６／２０２１８号のＡ６８調製物を、最適にはアガロースビーズに最初
に固定されている、望ましくはプロテインＡまたはプロテインＧ、好ましくはプ
ロテインＡおよびプロテインＧの両方と共にインキュベートすることにより実施
される。望ましくは、約１ｍｌの部分的に純粋なＡ６８調製物を、プロテインＡ
充填ビーズ（一般には約７５μｌ）およびプロテインＧ充填ビーズ（一般には約
７５μｌ）に加える。試料は、好ましくは、最適には約８時間４℃で、回転器に
入れる。インキュベート後、望ましくは、ビーズを、約１４，０００×ｇで微量
遠心機を約３分間使用して回転して溶液から出す。次いで、上清を好ましくは、
プロテインＡおよびプロテインＧ充填ビーズ（一般には各々約７５μｌ）を含む
新しい管に移し、最適には１６時間まで４℃で回転器でインキュベートする。続
いて、プロテインＡおよびプロテインＧビーズを、所望により、約３分間約１４
，０００×ｇで微量遠心機を使用してペレット化する。前記Ａ６８タンパク質調
製物を含む上清を次いで保存する（例えば、−８０℃で２５０μｌのアリコート
で）。

【００２９】 別に、免疫グロブリンＧは、望ましくはプロテインＡおよびプロテインＧの両
方の使用、例えば固定細菌またはパンソルビンの使用などに実質的に等価な免疫
グロブリンＧ除去法を用いて、タンパク質調製物をインキュベートすることによ
り除去する。

【００３０】 精製Ａ６８抗原調製物の総タンパク質濃度は、望ましくは、例えばクーマシー
とタンパク質アッセイ試薬（ピアスカタログ番号２３２３６）を使用したクーマ
シーブルータンパク質アッセイにより、および標準物質として既知濃度のＢＳＡ
を用いた製造業者により記載のマイクロアッセイにより決定する。続いて、抗原
調製物の、Ａ６８特異的モノクローナル抗体ＭＣ１５との反応性は、望ましくは
、化学発光による間接的なＥＬＩＺＡにより決定し、活性は、相対的な光単位（
ｒｌｕ）／ｎｇ（タンパク質）として表現する。その後のＡ６８抗原調製物のタ
ンパク質濃度は、望ましくは、最初のロットのＭＣ１５反応性に対して、その後
の抗原調製物のＭＣ１５反応性を比較することにより推定できる。この方法は、
Ａ６８タンパク質濃度を、クーマシーブルータンパク質アッセイを使用して測定
する場合に典型的に遭遇するばらつきの問題を回避する。

【００３１】 プロテインＡ／Ｇで処理したＡ６８（または部分精製Ａ６８調製物）の免疫グ
ロブリンＧ含量の決定は、望ましくは、精製ヒトＩｇＧ（ＭＯ州セントルイス所
在シグマ社）を標準物質として使用して、化学発光による間接的なＥＬＩＺＡに
より、または、他の適切な手段（すなわち、特に実施例に記載の手段）により実
施できる。

【００３２】 本発明のこれらの方法を使用して、実質的に免疫グロブリンＧを含まず、すな
わち、調製物の総タンパク質の約０．０５％以下（さらにより好ましくは約０．
００１５％以下）の量の免疫グロブリンＧを有する、および／または、望ましく
は１μｇのＡ６８あたり約５００ｐｇ未満の免疫グロブリンＧを有する（さらに
より好ましくは、約１５ｐｇ未満の免疫グロブリンＧを有する）、Ａ６８タンパ
ク質調製物を得ることができる。抗原をウェスタンブロット解析に使用する場合
、精製Ａ６８抗原は、１つのゲルレーンあたりに添加された抗原の量あたり、好
ましくは約５００ｐｇ未満のＩｇＧ、より望ましくは約１５ｐｇ未満のＩｇＧを
含む。実質的に免疫グロブリンＧを含まない抗原調製物は、存在する全てのＩｇ
Ｇを「遮断」または「縛る」方法、または他の適切なＩｇＧ除去手段を使用して
も、達成できることがさらに考えられる。かかる方法は、Ａ６８のカプリル酸沈
降；抗ヒトＩｇＧレジンを使用した吸着；およびパンソルビンの使用を含むがこ
れに限定されない。

【００３３】 アルツハイマー抗原タンパク質調製物を利用するアッセイ 本発明は、とりわけ、アルツハイマー病関連抗原に特異的な抗体（自己抗体）
の検出に関し、この抗原は、アルツハイマー病の個体に存在し、アルツハイマー
病を有さない個体には実質的に存在しない。本発明は、アルツハイマー病を診断
（すなわち、ＡＤ抗原に対する自己抗体の存在を検出）する特異的かつ感度の高
いアッセイを提供する。本発明の方法は、他の疾患の排除プロセスに基づいた診
断を必要とする従来技術の決定を克服し、従って、処置選択肢の評価に対する明
瞭さを提供する。

【００３４】 従って、本発明は、望ましくは、アルツハイマー病を有する個体に存在し、ア
ルツハイマー病を有さない個体には実質的に存在しない、アルツハイマー病関連
抗原に対する抗体（すなわち自己抗体）の検出に関する。本発明はまた、ヒト、
並びに、ウシタウなどの他の種（すなわち望ましくは哺乳動物種）由来のタウタ
ンパク質に特異的な自己抗体の検出にも関する。かかるタウタンパク質抗体は、
ＡＤを有さない個体に存在し、ＡＤを有する個体には実質的に存在しない。本発
明は、ＡＤを診断する特異的かつ感度の高いアッセイを提供する。診断は、血清
、血漿、および脳脊髄液などの体液に存在するアルツハイマー抗体およびＭＡＰ
ｆ自己抗体の相対レベルに基づいて実施され、よって、かなりのアルツハイマー
抗体レベルを有し、ＭＡＰｆに対する実質的なレベルの自己抗体は有さない個体
は、ＡＤと診断される。

【００３５】 この方法は、従って、プロテインＡ／Ｇで処理したＡ６８（すなわち、実質的
に免疫グロブリンＧを含まないＡ６８調製物）を、アルツハイマー病の診断であ
る自己抗体の検出のための抗原として使用することを提供する。部分精製Ａ６８
調製物ではなく、本発明により実質的にＩｇＧを含まなように精製されたＡ６８
は、様々な方法（例えば、ウェスタンブロット解析、化学発光サンドイッチＥＬ
ＩＳＡアッセイ、化学発光による間接的なＥＬＩＳＡアッセイ、直接的なＥＬＩ
ＳＡアッセイ、免疫沈降アッセイ、およびその他）に使用して、アルツハイマー
病に特異的な自己抗体を検出できることは本発明の新しくかつ意外な発見である
。これらのアッセイは、直接的および／または間接的ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ
ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット解析等を含む多くの方法で実施し得ることは当
業者に明らかであろう。さらに、様々なアルツハイマー病抗原および／またはそ
の前駆体または関連タンパク質のいずれかを、単独でまたは組合せて用いる競合
アッセイは、アルツハイマー病の診断となる自己抗体の検出を補助し得ることが
理解されるだろう。

【００３６】 本発明に記載のこれらのアッセイで、望ましくは、アルツハイマー病抗原に対
して指向された抗体を使用できる。これらの抗体は、モノクローナル抗体（例え
ば、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６／２０２１８号に記載のような）並びに血
清自己抗体を含む。特定の好ましいモノクローナル抗体は、以下の実施例に記載
する。しかし、１つの特に好ましい抗体は、ＶＡ州２０１１０−２２０９マナッ
サス、ユニバーシティ通り１０８０１所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに１９８６年９月１７日にブダペスト条約の下で寄託された、ハイ
ブリドーマ番号ＨＢ９２０５により分泌されるＡＬＺ−５０である。ＡＬＺ−５
０は、この分野でアルツハイマー病の存在を検出する標準的な試薬となった（例
えば、Ｗｏｏｄら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２１、第１
１号、６５９〜６６２項（１９８９）；Ｉｔａｇａｋｉら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２６、第５号、６８５〜６８９項（１９８９）；Ｂｅａ
ｃｈら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５０１、第１号、１７１〜１７５項（
１９８９）；Ｌｏｖｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４７、第４号、
３９３〜４０５項（１９８８）；Ｎｕｋｉｎａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、８７、第３号、２４０〜２４６項（１９８８）；およびＨｙｍ
ａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４５０、３９２〜３９７項（１９８８
）参照）。

【００３７】 本明細書に記載のアッセイ法において、本発明のアッセイに使用した試料は、
好ましくは、存命中または死亡後の脳組織、脳脊髄液、尿および血液からなる群
から選択する。好ましい実施形態において、試料は血清を含む。血清を使用する
本明細書に記載の方法は、ＣＳＦおよび尿にも適用できる。以下の別の試験手順
は、アルツハイマー病を有するヒトの血液または他の体液中の、アルツハイマー
抗原に対する自己抗体の存在を検出するのに適切であると考えられる。手順は、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、７６、
１７１〜１８３項（１９８５）にＪ．Ｓ．ＭｃＤｏｕｇａｌらによる、「感染性
ヒトレトロウイルスのリンパ節腫脹関連ウイルス（ＬＡＶ）の検出および定量の
ためのイムノアッセイ」に開示されたようなＨＴＬＶ−ＩＩＩの検出に使用され
た手順に類似している。好ましくは、約０．１μｌから約１００μｌの血清を使
用し、より好ましくは０．２５μｌから１０μｌの血清を使用する。

【００３８】 従って、アルツハイマー病に存在する自己抗体の検出のためのウェスタンブロ
ットに関連して、本発明は、最適には、 （ａ）本発明に記載のＡ６８精製タンパク質調製物および前記自己抗体の存在に
ついて試験する試料を得； （ｂ）ゲル上で前記タンパク質調製物を電気泳動し； （ｃ）前記タンパク質調製物を膜（例えばニトロセルロース）に転写し； （ｄ）前記の電気泳動した膜を、自己抗体の存在について試験する試料と接触さ
せ、よって抗原−自己抗体複合体が形成でき；そして （ｅ）前記複合体の形成により前記自己抗体を検出することを含む、方法を提供
する。

【００３９】 同様に、本発明において、試料中の、アルツハイマー病に特異的な自己抗体の
存在を決定し、よって、アルツハイマー病を診断する方法を提供する。この方法
は、所望により、アルツハイマー病を有することが疑われる個体からの試料を、
本発明に記載の精製Ａ６８抗原調製物と接触させることを含む。サンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイ（例えば実施例に記載）に関連して、この接触は、最適には、
サンプルをプロテインＡ／Ｇ（これは好ましくはビーズ、プレート、ニトロセル
ロース、固定細菌、パンソルビン等に固定されている）に結合させた後に実施す
る。この接触は、最適には、自己抗体が、溶液中で遊離し、抗原に接触した後に
固定されるように実施する。その後（例えば洗浄後）、混合物を、望ましくは、
アルツハイマー抗原上の抗原性決定基に特異的で（例えばＡＬＺ−５０またはＡ
６８に特異的なモノクローナルＴＧ５）、結合して複合体を産生できる抗体と接
触させる。本発明により、「抗体」は、抗体の一部でもよい（例えば、Ｆａｂ断
片等）。次いで、得られた複合体は、所望により、試料から分離し回収するが、
好ましくは、適切な手段、例えば化学発光手段等により検出する。

【００４０】 所望により、Ａ６８を、ビオチンまたは放射性マーカーで、標準的なプロトコ
ルにより標識し、複合体を、望ましくは、その標識の検出により測定する。これ
は、例えば、ビオチン標識Ａ６８の場合、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコ
ンジュゲートしたストレプトアビジンなどの試薬を用いて、または、複合体の捕
獲およびその複合体の放射能の検出により実行される。標識手段および標識を検
出する手段は、当業者には公知である。

【００４１】 従って、本発明はさらに、アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する方
法を提供し、これは （ａ）本発明に記載の精製Ａ６８タンパク質調製物を獲得し； （ｂ）前記タンパク質調製物を、自己抗体の存在について試験する試料と接触さ
せ、よって、抗原−自己抗体複合体が形成でき；そして （ｃ）前記複合体の形成により前記自己抗体を検出することを含む。

【００４２】 以前に記載のように、この方法は、望ましくは、自己抗体の存在が複合体の存
在により決定される（すなわち定量試験）場合に実施できる。所望により、この
方法は、複合体の量が測定され、自己抗体の量が、複合体の量により決定される
（すなわち定量試験）場合に実施できる。

【００４３】 さらに、この方法は、所望により、複合体を、自己抗体またはタンパク質調製
物上に見出される抗原性決定基と免疫的に反応性である抗体と接触させ、よって
、抗原−抗体または抗体−自己抗体複合体が形成されるさらなる段階を含むこと
ができる。

【００４４】 本発明の方法に使用した抗体は、最適には、同定可能な標識をその抗体に付着
することにより検出可能とできる。抗体は、好ましくは、適切な基質にコンジュ
ゲートした酵素（これは次いで検出可能な反応を触媒する）に付着させることに
より検出可能となる。酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼまたはアルカリホスファターゼであり得る。抗体を検出する他の手段は
、蛍光物質、化学発光物質または放射標識を抗体に付着することを含む。別に、
抗体は、抗体に指向する別の抗体の使用により検出でき、他の抗体は標識されて
いるか、または抗体に結合した酵素基質を有する。検出可能な抗体の存在（例え
ば、複合体の指示薬として）は、公知の技術を使用して容易に検出し得る。従っ
て、検出可能な抗体を酵素に連結し、適切な基質に導入する場合、検出可能な結
合抗体の光学密度は、量子分光計を使用して決定する。検出可能な抗体が蛍光標
識されている場合、蛍光発光を、蛍光光度計技術を使用して測定または検出し得
る。同じように、検出可能な抗体が放射標識されている場合、結合抗体は、放射
能検出技術を使用して検出し得る。試験試料について上記の方法を使用して得ら
れた結果を、対照試料について前記方法を使用して得られた結果と比較すること
により、アルツハイマー病に特異的な精製Ａ６８タンパク質調製物／自己抗体の
存在を決定し得る。アルツハイマー病に特異的な精製Ａ６８タンパク質調製物／
自己抗体の量の増加が、それによって検出され、所望により定量し得る。

【００４５】 アルツハイマー病の抗原／自己抗体複合体を定性的または定量的に決定する方
法を、アルツハイマー病の診断に使用し得る。本発明の方法の使用は、本発明が
、アルツハイマーの抗原／自己抗体複合体を検出する簡単で、感度の高く、非常
に特異的な方法を提供するために、従来技術より利点がある。アルツハイマーの
抗原は、サンドイッチイムノアッセイ複合体形成によく適している。なぜなら、
それは凝集形で存在し、よって多エピトープ性であるからである。これは、可溶
性で、通常１つのタンパク質に１つのエピトープを含む、交差反応性タンパク質
とは対照的である。

【００４６】 自己抗体および自己抗原の検出におけるこれらおよび他の標準的な方法の変形
が当業者には明らかであり、本発明により考えられる。

【００４７】 自己抗体を検出するためにアルツハイマー病抗原を製造する方法 本発明はまた、アルツハイマー病に罹患している患者に存在する自己抗体に結
合できるタンパク質を製造する方法を提供する。これらの方法は、リン酸化組換
えタウまたはその誘導体を含み得る。典型的には、これらの方法は、アルツハイ
マー病のアッセイに使用するに十分な程度では、かかる自己抗体に結合できない
、タウまたは組換えタウなどのタンパク質を使用するがこれに限定されない。従
って、これらの方法に使用できるタウまたはその誘導体は、所望によりリン酸化
されている。通常、これらのリン酸化タンパク質は、最小限にしかリン酸化され
ておらず、アルツハイマー病に罹患している患者に存在する自己抗体に結合でき
ない。しかし、かかる自己抗体にすでに結合できるリン酸化タンパク質は、これ
らの方法に使用できる。リン酸化タンパク質のリン酸化を含むこの方法は、一般
に、タンパク質が自己抗体に結合する能力を増加させ、自己抗体を検出する能力
を増加させるだろう。

【００４８】 アルツハイマー病に罹患している患者に存在する自己抗体に結合できるタンパ
ク質を製造する方法は、 （ａ）タンパク質（群）、好ましくは所望の自己抗体（群）に結合できないタン
パク質を、ヒペリシン、またはカルフォスチンＣまたは類似物で処理するか； （ｂ）タンパク質（群）、好ましくは所望の自己抗体（群）に結合できないタン
パク質を、遊離脂肪酸で処理するか； （ｃ）タンパク質（群）、好ましくは所望の自己抗体（群）に結合できないタン
パク質を、ヒドロキシノネナールまたは他の進んだ糖化最終生成物で処理するか
；または （ｄ）上記の組合せを含む。

【００４９】 得られた抗原調製物は、所望により、本発明の実質的に純粋なＡ６８調製物の
代わりに（またはそれに加えて）使用できる。

【００５０】 １つのかかる方法は、抗原をリン酸化することを含む。好ましくは、リン酸化
は、所望によりオカダ酸などのホスファターゼ阻害剤で処理しておいた、中枢神
経系（ＣＮＳ）細胞系、例えば神経芽細胞（特にＭＳＮ神経芽細胞）から調製し
た細胞抽出物を使用して実施する。また、望ましくは、リン酸化は、文献でタウ
リン酸化に関連している、精製または部分精製キナーゼを使用して実施する。本
発明の内容で使用できるキナーゼは、ＰＫＡ、ＧＳＫ、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５、
カゼインキナーゼＩおよびＩＩ、ＭＡＰキナーゼ、およびＰＨＦキナーゼを含む
がこれに限定されない。

【００５１】 本発明はさらに、アルツハイマー病抗原が、アルツハイマー病に存在する自己
抗体を検出する能力を増加させる方法を提供し、好ましくはここでの抗原は、ヒ
トを含む様々な種から単離されたタウ、または組換えヒトタウ、またはリン酸化
組換えヒトタウ（Ｐタウ）またはリン酸化単離タウであり、前記方法は、所望に
より、ヒペリシンで抗原を処理することを含む。

【００５２】 同様に、本発明は、望ましくは、アルツハイマー病抗原が、アルツハイマー病
に存在する自己抗体を検出する能力を増加させる方法を提供し、ここでの抗原は
、ヒトを含む様々な種から単離されたタウ、または組換えヒトタウ（ｒｈｔ）、
またはリン酸化組換えヒトタウ（ホスホ−ｒｈｔ）またはリン酸化単離タウであ
り、前記方法は、遊離脂肪酸で抗原を処理することを含む。好ましくは、脂肪酸
は、不飽和脂肪酸、特にオレイン酸またはリノール酸、最も好ましくはアラキド
ン酸である。

【００５３】 さらに、本発明はまた、アルツハイマー病抗原が、アルツハイマー病に存在す
る自己抗体を検出する能力を増加させる方法を提供し、ここでの抗原は、ヒトを
含む様々な種から単離されたタウ、または組換えヒトタウ、またはリン酸化組換
えヒトタウ（ホスホ−ｒｈｔ）またはリン酸化単離タウであり、前記方法は、所
望により、進行した糖化最終生成物で抗原を処理することを含み、特にここで進
行した糖化最終生成物は、脂質過酸化生成物の４−ヒドロキシ−２−ノネナール
（ＨＮＥ）である。

【００５４】 抗イディオタイプ抗体 本発明はさらに、アミノ酸差異を認識する抗体であり、従って、特定の免疫グ
ロブリンに特異的に指向される、いわゆる「抗イディオタイプ抗体」を獲得する
手段を提供する。特に、本発明は、好ましくは、Ａ６８に対するモノクローナル
抗体またはＡ６８に対するヒト血清自己抗体から出発して、Ａ６８アルツハイマ
ー病抗原反応性免疫グロブリンに対する抗イディオタイプ抗体を同定する手段を
提供する。これらの抗イディオタイプ抗体は、望ましくは、アルツハイマー病を
アッセイするための、本発明の方法に使用される。

【００５５】 従って、本発明は、望ましくは、Ａ６８抗原に対して指向される抗体（例えば
、特にモノクローナル抗体、またはヒト血清自己抗体）と免疫的に反応性である
、抗体（例えば特にモノクローナル抗体）を提供する。かかる抗イディオタイプ
抗体、特にＡ６８抗原に対して指向されるモノクローナル抗体またはヒト血清自
己抗体と免疫的に反応性である抗体は、望ましくは、 （ａ）高力価の抗Ａ６８自己抗体を有する個体から血清を獲得し、合わせてプー
ルを創製し、前記プールから抗体を単離するか、 または、Ａ６８抗原に対する単離モノクローナル抗体を獲得し； （ｂ）マウスを、前記単離抗体で免疫化し； （ｃ）前記マウスから血清を獲得し（すなわち、抗体が産生されるのに十分な時
間の後および十分な条件下で）；そして （ｄ）前記血清を試験して、Ａ６８抗原に対して指向された抗体（例えば、モノ
クローナル抗体またはヒト血清自己抗体）と免疫的に反応性である、高レベルの
抗体を有するマウスを同定することを含む。

【００５６】 以下のさらなる段階を含む方法を、所望により、実施できる： （ａ）Ａ６８抗原に対して指向されたモノクローナル抗体またはヒト血清自己抗
体と免疫的に反応性である、高レベルの抗体を有する前記マウスの脾臓を獲得し
； （ｂ）前記脾臓を骨髄細胞と融合し、組織培養プレートにプレーティングし； （ｃ）ＨＡＴ耐性により融合細胞を選択し；そして （ｄ）前記融合細胞を、Ａ６８抗原に対して指向された抗体（例えば、モノクロ
ーナル抗体またはヒト血清自己抗体）と免疫的に反応性である、抗体の産生につ
いて試験する。最適には、この方法はさらに、Ａ６８抗原に対して指向されてい
ない抗体と免疫的に反応性ではない、抗体の産生について、融合細胞を試験する
ことを含む。適切なこれらの方法の変形は当業者には明らかであろう。

【００５７】 ウシタウ（ＭＡＰｆ）調製物およびアッセイ 本発明はさらに、望ましくは、例えば血清のウェスタンブロット解析において
、Ａ６８と共に、ウシ微小管結合タンパク質調製物（すなわちＭＡＰｆ）を使用
することを提供する。ウシＭＡＰｆは、とりわけ、７０％のＭＡＰ１＆２、２０
％の他のＭＡＰ、および１０％のタウＭＡＰアイソフォームを含む。本明細書に
記載したような本発明は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で４０〜６５
ｋＤの範囲に移動する、６つのタウＭＡＰアイソフォームを使用する。結合した
自己抗体の電気泳動、ウェスタン転写、血清インキュベート、および検出の方法
は、当業者には公知である。

【００５８】 従って、望ましくは本発明により、個々を、Ａ６８とＭＡＰｆのレーンを交互
にして電気泳動に使用できる。ＭＡＰｆは、好ましくは、１．５μｇの総タンパ
ク質／レーンの濃度で使用する。電気泳動後、タンパク質を、適切な支持体、例
えばニトロセルロースまたは他の膜に転写する。望ましくは、患者の血清を、精
製Ａ６８タンパク質調製物を含むニトロセルロース片およびＭＡＰｆを含むニト
ロセルロース片と共にインキュベートし、次いで、結合した自己抗体を以前に記
載したように可視化する。これらの条件下で、精製Ａ６８タンパク質調製物およ
びＭＡＰｆ中のタウアイソフォームに結合した自己抗体が得られる。

【００５９】 従って、本発明はまた、望ましくは、アルツハイマー病に存在する自己抗体を
検出する方法を提供し、これは、 （ａ）以前に記載したような精製Ａ６８タンパク質調製物、ウシ微小管結合タン
パク質調製物、および前記自己抗体の存在について試験する試料を獲得し； （ｂ）前記精製Ａ６８タンパク質調製物および前記ウシ微小管結合タンパク質調
製物を、ゲル上の別々のレーンで電気泳動し； （ｃ）前記の電気泳動した精製Ａ６８タンパク質調製物および前記ウシ微小管結
合タンパク質調製物を、膜に転写し； （ｄ）前記膜を、前記自己抗体の存在について試験する試料と接触させ、よって
、自己抗体複合体は、前記精製Ａ６８タンパク質調製物中に存在する抗原および
／または前記ウシ微小管結合タンパク質調製物中に存在する抗原を用いて形成で
き；そして （ｅ）前記自己抗体を、前記複合体（群）の形成により検出する段階を含む。

【００６０】 ２つの解析法を好ましくは使用して、診断を、試験した各血清に割当てる。第
一の方法では、精製Ａ６８タンパク質調製物の総光学密度（ＯＤ）×ｍｍシグナ
ルを、タウアイソフォームの総ＯＤ×ｍｍシグナルで割る。一般に、試料に、こ
の比に基づいて、ＡＤまたは非ＡＤの診断を割当てる。光学密度は、例えば、実
施例１１に記載したように計算できる。

【００６１】 第二の方法は、最適には、光学密度測定だけでなく、特定の血清により同定さ
れたＭＡＰｆタウアイソフォームの数も考慮する。この解析法では、ウシＭＡＰ
ｆタウシグナルが、精製Ａ６８タンパク質調製物と共に存在する場合、望ましく
は、タウシグナルが３つ未満のアイソフォームを含む場合にはＡＤの診断を割当
て、サンプルが３つ以上のタウのアイソフォームを同定する場合には非ＡＤの診
断を割当てる。さらに、好ましくは、試料は、タウバンドの数に関わらず、それ
が精製Ａ６８タンパク質調製物シグナルを欠失している場合には、非ＡＤとして
分類する。この場合のＭＡＰｆタウシグナルの定量は式（合計ＯＤ×（ｎ−２）
）を用いる。この式で、「合計ＯＤ」は、全てのタウアイソフォームのＯＤの合
計×ｍｍ測定値であり、「ｎ」は、６つのタウＭＡＰｆアイソフォームを示すバ
ンドの総数である。従って、この方法により、精製Ａ６８タンパク質調製物シグ
ナルを与え、実質的にタウシグナルのない試料をＡＤと称し、他の全ての組合せ
（Ａ６８シグナル＋タウシグナル、タウシグナルのみ、または両方のシグナルが
存在しない）は、非ＡＤと診断する。

【００６２】 好ましくは、タウアイソフォームの使用は、ＭＡＰｆに見出されるウシタウア
イソフォームの使用に限定されない。単一分子としてまたはタウアイソフォーム
の混合物としての、脳から精製したタウおよび組換えタウを含むがこれに限定さ
れない、他の形のタウタンパク質も望ましくは使用する。さらに、本発明は、ウ
シ種のタウに限定されない。ヒト、げっ歯類、または他の哺乳動物源などの、他
の種の脳または培養細胞由来の精製タウまたはＭＡＰ、並びに、トリおよび爬虫
類由来の調製物も使用し得る。

【００６３】 同様に、精製Ａ６８タンパク質調製物およびウシタウと反応性を示す自己抗体
も、間接的ＥＬＩＳＡアッセイで検出し得、ここでの抗原は、マイクロタイター
プレートに固定され、各ウェルの底にはニトロセルロースがある。この支持体に
より、抗原を、ポリスチレン支持体よりもウェスタンブロットに近似した様式で
提示することが可能となる。ミリポアＭＨＡＢプレートを、１分間ＢＢＳで予め
湿らせ、次いで緩衝液を真空下でフィルターを通して吸引する。抗原を、１ウェ
ルあたりＢＢＳ中０．０１から１０μｌ（０．３から３００ｎｇ）でウェルに適
用し、３時間２４℃で結合させる。これらの実験では、抗原は、精製Ａ６８タン
パク質調製物、ウシタウ（ＭＡＰｆ）、または精製Ａ６８タンパク質調製物類似
体、例えばリン酸化ｒｈｔであり得る。抗原溶液を、真空下でフィルターを通し
て吸引し、フィルターを、１．５時間２４℃で、ＢＢＳ中５％無脂肪乾燥ミルク
で遮断する。続いて、全てのインキュベート溶液を、プレート洗浄器（Ｎｕｎｃ
）により除去し、真空下で膜を吸引することによるのではなく、ＴＢＳ（前記に
定義）中０．１％ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。１％血清を、ウェルの１００μｌ
の１％無脂肪乾燥ミルク、５％の正常ヤギ血清、ＢＢＳ中に加え、１６時間４℃
でインキュベートする。結合したヒトＩｇを、２時間２４℃で、１％カゼイン／
ＴＢＳ中のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇを添加し、次いで９０μｌのＬ
ｕｍｉＧｌｏ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社）化学発光基質を
添加して検出する。化学発光は、実施例５に記載のように測定する。

【００６４】 （実施例） 本発明は、以下の実施例によりさらに説明され、これは、実施例に記載した特
定の化合物または手順に、本発明の範囲または精神を限定するものとは、または
、いかなる場合にも本発明の範囲を限定するものとは捉えない。

【００６５】 実施例１：部分精製Ａ６８抗原調製物の単離 本実施例は、部分精製Ａ６８抗原調製物の単離を記載する。

【００６６】 Ａ６８抗原は、凍結したヒト脳試料（典型的にはアルツハイマー病患者の大脳
皮質）から、標準的なプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む、トリス
緩衝食塩水（ＴＢＳ）などの５容量の緩衝水中でホモジナイズすることにより単
離した。ホモジネートは、２７，０００×ｇで６０分間４℃で遠心分離すること
により分画し、上清を収集し、１６時間４℃でＭＣ１アフィニティーカラムに繰
返し通した。ＭＣ１カラムは、製造業者の指示に従って、Ａ６８と特異的に反応
する精製マウスモノクローナル抗体を（ＭＣ１、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９
６／２０２１８号に記載され、その源としての、分泌ハイブリドーマＡＴＣＣ番
号１１７３６が、１９９４年１０月２６日にメリーランド州ロックビル所在のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された）、Ａｆｆｉｇｅｌ
−１０（バイオラッド・ラボラトリーズ）にカップリングすることにより調製し
た。Ａ６８は、ＭＣ１カラムマトリックスにより、上清から特異的に取り出され
る。ＴＢＳで徹底的に洗浄した後、Ａ６８を、ＭＣ１カラムから、３Ｍ ＫＳＣ
Ｎを使用して溶出した。続いて、ＴＢＳに対して透析し、−８０℃で保存した。
部分精製Ａ６８抗原調製物を単離する他の手段は（これは、いくつかの場合にお
いて、上記と同一ではなくても類似している）、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９
６／２０２１８号に記載されている。

【００６７】 得られた調製物は、Ａ６８が高度に濃縮されているが、他のタンパク質の量も
含む。Ａ６８中のヒトＩｇの量が、間接的ＥＬＩＳＡにより確認され、ここでの
Ａ６８は、ＥＬＩＳＡプレート上に覆膜され、ヒトＩｇと特異的に反応性を示す
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたヤギ抗体でプ
ローブされている。他のウェル中の精製ヒトＩｇの標準的な量を覆膜し、標準と
して使用する。結合ＨＲＰコンジュゲート抗体を、化学発光ＨＲＰ基質を使用し
て定量し、標準的なヒトＩｇとＡ６８調製物の間の量を比較する。驚くべきこと
に、Ａ６８濃縮調製物は、総タンパク質の約１〜５％を含む内因性ヒト免疫グロ
ブリンを含むことが判明した。これは、驚くべきことである。なぜなら、かかる
免疫グロブリンは、アフィニティークロマトグラフィー中に除去されると期待さ
れたからである。以下の実施例により確認されたように、この意外に高いレベル
の免疫グロブリンは、調製物が、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより、
Ａ６８に対する血清自己抗体を検出する能力に干渉する。

【００６８】 実施例２：精製Ａ６８調製物のプロテインＡ／Ｇ処理 本実施例は、例えば、実施例１に記載したように得られたＡ６８抗原調製物の
プロテインＡ／Ｇを使用した、さらなる精製を記載する。特記しない限り、この
研究の全ての化学物質および以下の実施例の化学物質は、シグマ社（ＭＯ州セン
トルイス）から購入した。

【００６９】 血清自己抗体を解析する前に、混入Ｉｇを除去するために、Ａ６８調製物を、
アガロースビーズ上に固定した、プロテインＡおよびプロテインＧの両方と共に
（イミュノピュア・イモビライズド・プロテインＡ、イミュノピュア・イモビラ
イズド・プロテインＧ；ＩＬ州ロックフォード所在ピアス社）インキュベートし
た。簡潔には、１ｍｌのＡ６８を、７５μｌのプロテインＡ充填ビーズおよび７
５μｌのプロテインＧ充填ビーズに加えた。試料を、８時間４℃の回転器に入れ
た。インキュベート後、ビーズを、１４，０００×ｇで微量遠心機で３分間回転
して溶液を出した。次いで、Ａ６８上清を、各プロテインＡおよびプロテインＧ
充填ビーズ７５μｌを含む新しい管に移し、さらに１６時間４℃の回転器でイン
キュベートした。続いて、プロテインＡおよびＧビーズを、１４，０００×ｇで
微量遠心機を３分間使用してペレット化し、次いで、Ａ６８上清を、−８０℃で
２５０μｌのアリコートで保存した。プロテインＡ／Ｇで処理したＡ６８のＩｇ
Ｇ含量の決定は、実施例１に記載のように、精製ヒトＩｇＧ（ＭＯ州セントルイ
ス所在シグマ社）を、標準として使用して、化学発光による間接的なＥＬＩＳＡ
により実施した。調製物は、内因性ＩｇＧを実質的に含まず、試料の総タンパク
質の０．０５％以下の量のＩｇＧを有することが判明した。

【００７０】 実施例３：ウェスタンブロット解析 本実施例は、先行実施例に記載したような、プロテインＡ／Ｇでの処理により
実質的に免疫グロブリンを含まないまで精製しておいた、精製Ａ６８抗原調製物
（すなわち「プロテインＡ／Ｇ処理Ａ６８）のウェスタンブロット解析を記載す
る。

【００７１】 ゲル電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０〜６８５項
（１９７０））の方法を使用して、約１．５ｍｍの厚さの１０％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドミニゲルを使用して実施した。試料緩衝液中、約１００〜１０００
ｎｇの総タンパク質／レーンのプロテインＡ／Ｇ処理Ａ６８をのせた。

【００７２】 ウェスタン転写は、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、７６、４３５０〜４３５４項（１９７９））の方法に従って、０．４
５μｍまたは０．２μｍのニトロセルロース（ＭＡ州ウェストボロ所在Ｍｉｃｒ
ｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を使用して実施した。転写後、ニトロセルロ
ースブロットを取り出し、ホウ酸緩衝食塩水（ＢＢＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１
００ｍＭ Ｈ_３ＢＯ_３、２５ｍＭ Ｂ_４Ｎａ_２Ｏ_７：１０Ｈ_２Ｏ）中５％無脂肪
乾燥ミルクからなる遮断緩衝液に約２時間室温で入れた。次いで、ニトロセルロ
ースを、タンパク質の個々のレーンを分離するように切断した。ニトロセルロー
ス片を、ＢＢＳ中１％無脂肪乾燥ミルク＋５％正常ヤギ血清中、約１６時間４℃
で、１：１００から１：１２００の希釈度の患者の血清と共に、振盪器でインキ
ュベートした。続いて、片を２回、各回５分間、ＢＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ−
２０で洗浄し、次いで、ＢＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で最後に４５分間洗浄した。
洗浄は、周囲温度で振盪器で実施した。

【００７３】 次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＡＬ州バーミンガム所在Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、製造番号２０４
０−５０）を、ＢＢＳ中１％無脂肪乾燥ミルク中、約０．１μｇ／ｍｌで片に加
え、片を、約１．５時間、振盪器で周囲温度でインキュベートした。次いで、ニ
トロセルロース片を、４回、各回５分間、ＢＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
で洗浄した。次いで、片を５分間、ＥＣＬ（ＬｕｍｉＧＬＯ、ＭＡ州ゲーサーズ
バーグ所在Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社、製造番号５０−５９
−００）に浸漬した。過剰のＬｕｍｉＧＬＯを片から流し、これを次いでプラス
チックのページホルダーに置いた。次いで、片を、予めフラッシング処理したＸ
線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、ＩＬ州アーリントンハイト所在アマシャム社
）にのせた。Ｘ線フィルムの予めのフラッシング処理は、製造業者により規定さ
れるようなアマシャム・センシタイズ・ユニットを使用して実施した。次いで、
Ｘ線フィルムを、標準的な方法により現像して、Ａ６８シグナルを可視化した。

【００７４】 ウェスタン解析の陽性および陰性対照に関して、血清を、１：１００から１：
１２００の範囲の数個の希釈度で実施した。血清を、サンプル緩衝液にプロテイ
ンＡ／Ｇ処理Ａ６８を、または試料緩衝液のみを含む、ニトロセルロース片（す
なわちゲルレーンに対応する）と共にインキュベートした。さらに、プロテイン
Ａ／Ｇ Ａ６８のレーンは、記載のように加工し、ただし、ヒト血清は、第一イ
ンキュベート段階で除外した（すなわちレーンを、ヤギ抗血清ＩｇＧ−ＨＲＰ抗
体のみでプローブした）。これらの両方の測定値は陰性対照として作用する。陽
性対照として、プロテインＡ／Ｇ処理Ａ６８の１つのレーンを、Ａ６８に対する
モノクローナル抗体、例えばＡｌｚ５０またはＴＧ５でプローブした（すなわち
、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６／２０２１８号、およびＴＧ５は、以下でさ
らに考察する）。血清が、ウェスタンブロットで約６０〜７０ｋＤの範囲にＡ６
８バンドの陽性染色を示した場合、陽性と評価したが、その他では、試料緩衝液
のみを含むレーンでは陰性であった。血清は、約６０〜７０ｋＤの範囲に可視バ
ンドがなければ、陰性として評価した。

【００７５】 これらの研究の結果は図１および２に示す。図１から分かるように、Ａ６８に
対する自己抗体は、アルツハイマー病の個体には存在したが（レーン２および４
）、正常対照にはＡ６８タンパク質との反応性はなかった（レーン３および５）
。

【００７６】 次に、ウェスタンブロットにより、アルツハイマー病の血清自己抗体を検出す
るためにｎ、Ａ６８調製物のプロテインＡ／Ｇによる処理の必要性が確認され、
図２に提示する。２ロットの処理していない、すなわち部分精製した、実施例１
に記載のように調製したＡ６８（ロットＡ、レーン１〜３およびロットＢ、レー
ン４〜６）および実施例２に記載したような１ロットのプロテインＡ／Ｇ処理Ａ
６８（レーン７〜９）を、１０％ポリアクリルアミドゲル上に流し、ニトロセル
ロース膜に転写した。のせた総タンパク質は約１７５ｎｇ／レーンであった。片
を、２名のアルツハイマー病患者由来の血清（患者１、レーン２、５、８または
患者２、レーン３、６、９）、次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰでプローブする
か、または片を、ヤギ抗ヒトＩｇＧＨＲＰ抗体のみを使用して（レーン１、４、
７）Ａ６８調製物に内因性のＩｇＧについてプローブした。結果により、ＩｇＧ
の重鎖を示す５５ｋＤバンドが判明する（図２に矢印で示す）。さらに、部分精
製Ａ６８は、ヒト血清中の自己抗体と弱く反応したかまたは全く反応しなかった
。プロテインＡ／Ｇ処理Ａ６８は、内因性ＩｇＧ反応性がないが、顕著なＡ６８
バンドにより証明されるように、Ａ６８に対する血清自己抗体により強く認識さ
れた（図２の矢印頭部で示す）。プロテインＡ／Ｇ処理は、内因性ＩｇＧを消失
しただけでなく、Ａ６８を濃縮し、その結果、自己抗体反応性は増強した。

【００７７】 本実施例は、プロテインＡ／Ｇでの処理（実施例２に記載のように）により実
質的に免疫グロブリンを含まないまでに精製しておいたＡ６８抗原調製物（この
追加の精製レベルを受けていないＡ６８調製物ではなく）を使用した、ウェスタ
ンブロットアッセイを、アルツハイマー病自己抗体の検出に使用できる。

【００７８】 実施例４：化学発光サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ 本実施例は、Ａ６８に対する自己抗体の検出のための、化学発光サンドイッチ
ＥＬＩＳＡアッセイを記載する。

【００７９】 これらの研究のために、ＤｙｎｅｘマイクロタイタープレートＭｉｃｒｏｌｉ
ｔｅ１型を、５μｇ／ｍｌのピアスプロテインＡ／Ｇで、３時間２４℃で、２５
ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、
２ｍＭ ＮａＮ_３（覆膜緩衝液）中で覆膜し、続いて、１％カゼイン、１０ｍＭ
トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＮａＮ_３ からなる希釈剤（カゼイン／ＴＢＳ）で１時間２４℃で遮断した。標準的な慣例
に従って収集および調製したヒト血清または血漿を、カゼイン／ＴＢＳ中１％溶
液としてウェル中でインキュベートし、約３時間２４℃で結合させた。プロテイ
ンＡ／Ｇ精製Ａ６８を、次いで、カゼイン／ＴＢＳ中７０ｎｇ／ｍｌで加え、ウ
ェル中で９０時間４℃でインキュベートした。

【００８０】 Ａ６８に高度に選択的であるマウスモノクローナルＩｇＧであるＴＧ５（ＰＣ
Ｔ国際特許出願番号ＷＯ９６／２０２１８号に記載され、その源としての、分泌
ハイブリドーマＡＴＣＣ番号１１７４６が、１９９４年１０月２６日にメリーラ
ンド州ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
された）を加工して、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、下記参照）と
コンジュゲートしたＦ（ａｂ’）_２断片を生成した。このコンジュゲートを、カ
ゼイン／ＴＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌの２４℃のヒト血清または血漿で３時間、
前処理して、自己抗体により捕獲されていたＡ６８と反応させた、同じプレート
のウェル中でインキュベートした。次いで、結合したＴＧ５−ＨＲＰを、ルミノ
ールをベースとした化学発光基質（すなわち、Ｌｉｍｉｇｌｏ、Ｋｉｒｋｅｇａ
ａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社）を使用して検出した。発光を、５秒／ウェルの
解読時間を使用して高速に、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓルミノメーターで定量した。
全てのインキュベート液は、２８８μｌである遮断段階および８８μｌであるル
ミノールを除き、１００μｌであった。各段階の間に、マイクロタイターウェル
を、５回、１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＮａＮ_３（ＴＢＳ）中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０の溶液で洗浄して、非結合
物質を除去した。

【００８１】 ＴＧ５を、以下のようにこれらの研究のために調製した。ＴＧ５は、固定した
プロテインＡ上の組織培養上清から精製した。それを、５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度
で、５０ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ８．１）に透析した。製造業者の指示に従って
（ピアス）固定フィシンを用いてＦ（ａｂ’）_２に消化した。Ｆ（ａｂ’）_２断
片を、消化物をプロテインＡカラムに通すことにより、Ｆｃ断片および残りの無
傷ＩｇＧから取り出した。Ｆａｂ’を作成するために、ＴＧ５を、０．１Ｍ Ｎ
ａＰＯ_４（ｐＨ６．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析し、６ｍｇ／ｍｌのメ
ルカプト−エチルアミンで９０分間３７℃で還元した。緩衝液は、セファデック
スカラムＧ２５カラム上で脱塩することにより、０．１Ｍ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７
．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡに変化し、Ｆａｂ’含有画分をプールし、１ｍｇ／ｍ
ｌ以上濃縮した。ＴＧ５：ＨＲＰが１：２の質量比のピアス社マレイミド−ＨＲ
Ｐを加え、１時間２４℃で反応させ、次いでさらに１６時間４℃で反応させた。
得られたコンジュゲートをさらに加工することなく使用した。

【００８２】 ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準によりアルツハイマー病を有すると臨床的に診
断された患者から得られた３つの血清試料を、上記のプロトコルを使用して解析
した。これらの試験の結果を表１に示す。

【００８３】

【表１】 ３つの各試料について、表１の相対的光単位で表現したシグナルから分かるよ
うに、自己抗体が検出された。

【００８４】 本実施例により、Ａ６８抗原調製物を使用した化学発光サンドイッチＥＬＩＳ
Ａアッセイを使用して、アルツハイマー病自己抗体を検出できることが確認され
る。

【００８５】 実施例５：化学発光による間接的ＥＬＩＳＡ 本実施例は、Ａ６８に対する自己抗体を検出するための、化学発光による間接
的ＥＬＩＳＡアッセイを記載する。

【００８６】 これらの研究のために、プロテインＡ／Ｇ処理Ａ６８を、１μｇ／ｍｌの濃度
で、重炭酸覆膜緩衝液（３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐ
Ｈ９．６５、０．２μｍ滅菌ろ過）に加え、１００μｌ／ウェルを、ＭＩＣＲＯ
ＬＩＴＥ２マイクロタイタープレート（ＶＡ州シャンティイー所在Ｄｙｎｅｘ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に加えた。Ａ６８を、２時間２５℃で、または１
６時間４℃でウェルに吸着させた。バックグラウンドを決定するために、対応す
るウェルを、重炭酸緩衝液のみで覆膜した。次いで、ウェルを、３回、洗浄緩衝
液（１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で、１２ウェル洗浄器（デンマー
クＮｕｎｃ所在Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ１２）を使用して洗浄した。続いて、ウ
ェルを、２時間２５℃で、３００μｌ／ウェルの１％カゼイン／ＴＢＳ（１％カ
ゼイン（ナトリウム塩）、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％チメロサール、ｐＨ７．５で遮断し、６時
間１０ワットでＶｉｂｒｉｏセル・ソニケーター（ＣＴ州ダンベリー所在Ｓｏｎ
ｉｃｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社）を用いて２５℃で超音波処理し、次いで０．４
５μｍのＳＦＣＡ膜を通してろ過した。次いで、ウェルを３回洗浄緩衝液で洗浄
した。

【００８７】 ５％正常ヤギ血清を含む１％カゼイン／ＴＢＳ中１：５００から１：１０００
に希釈した血清を、ウェル（１００μｌ／ウェル）に加え、２５℃で２時間イン
キュベートした。次いで、ウェルを８回、洗浄緩衝液で洗浄した。続いて、１０
０μｌの０．１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＡＬ州バーミンガム所
在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）の
１％カゼイン／ＴＢＳ溶液をウェルに加え、１．５時間２５℃でインキュベート
した。このインキュベート後、ウェルをさらに８回、洗浄緩衝液で洗浄した。８
８μｌのＥＣＬ（ＬｕｍｉＧＬＯ、ＭＡ州ゲーサーズバーグ所在Ｋｉｒｋｅｇａ
ａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社）をウェルに加え、ウェルを各２秒間２１℃で積
分モードで、Ｌｕｍｉｏｎｓｋａｎ ＲＳルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ
ｓ、フィンランド）を使用して計測した。特記しない限り、全ての化学物質はシ
グマ（ＭＯ州セントルイス所在）から購入した。

【００８８】 血清試料の絶対値を決定するために、重炭酸緩衝液のみのウェル中の血清由来
の相対的な光単位（ＲＬＵ）シグナルを、Ａ６８覆膜ウェル中の血清由来のＲＬ
Ｕシグナルから差し引いた。プレート毎および日にち毎の変動を、２５ｎｇ／ウ
ェルから倍化希釈して０．１ｎｇ／ウェルまでの範囲の、Ａ６８標準曲線を使用
することにより修正した。標準曲線におけるＡ６８の検出は、Ａ６８特異的モノ
クローナル抗体ＭＣ１５（１μｇ／ｍｌ、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６／２
０２１８号に記載され、その源としての、分泌ハイブリドーマＡＴＣＣ番号１１
７３９が、１９９４年１０月２６日にメリーランド州ロックビル所在のアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された）および二次ヤギ抗マウス
ＩｇＭ−ＨＲＰ（０．１μｇ／ｍｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（両方共、１％カゼイン／ＴＢＳで希釈してい
る）を使用することにより行なわれた。

【００８９】 このアッセイの結果を表２に示す。

【００９０】

【表２】 表２から分かるように、自己抗体が、５名全員のＡＤ患者の間接的ＥＬＩＳＡ
により検出され、これは、相対的光単位として表現されたシグナルにより確認さ
れた。

【００９１】 本実施例により、本発明に従って精製されたＡ６８抗原調製物を使用した化学
発光による間接的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、アルツハイマー病自己抗体
を検出できることが確認される。

【００９２】 実施例６：ＡＤの自己抗体の検出 本実施例は、アルツハイマー病の自己抗体を検出するための、抗イディオタイ
プ抗体の産生および使用を記載する。

【００９３】 Ａ６８に対するモノクローナル抗体および／またはＡ６８に対するヒト血清抗
体を使用して、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生する。次いで、抗イ
ディオタイプ抗体を、抗原として、間接的ＥＬＩＳＡに使用して、アルツハイマ
ー病を有することが疑われる個体由来の血清中の抗Ａ６８自己抗体についてスク
リーニングする。かかる抗イディオタイプ抗体の使用は、アルツハイマー病の血
清試験の基礎を形成する。

【００９４】 アルツハイマー病を有する個体由来のヒト血清を、Ａ６８に対してウェスタン
ブロットすることによりスクリーニングする。高力価の抗Ａ６８自己抗体を有す
ることが示された個体由来の血清をプールする。ヒト抗体を、アガロースビーズ
上に固定したプロテインＡ／Ｇと主にバッチインキュベートすることにより、プ
ールした血清から単離する。別に、Ａ６８を使用したイムノアフィニティーカラ
ムを使用して、Ａ６８自己抗体を濃縮でき、これを続いてカラムから溶出する。
次いで、溶出した抗体を上記のように、プロテインＡ／Ｇビーズを使用して捕獲
する。典型的には、１ｍｌのプロテインＡ／Ｇが６〜８ｍｇのＩｇＧに結合する
。血清からヒトＩｇＧを単離するために、血清を、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５
）で１：１に希釈し、２時間４℃で１ｍｌのプロテインＡ／Ｇビーズと共にイン
キュベートする。組織培養液中のイムノアフィニティー精製Ａ６８自己抗体また
はモノクローナル抗体のために、プロテインＡ／Ｇビーズを、ＩｇＧ含量に比例
する濃度で抗体溶液に直接加える（すなわち、６〜８ｍｇのＩｇＧあたり、約１
ｍｌのプロテインＡ／Ｇビーズ）。

【００９５】 抗イディオタイプモノクローナル抗体は標準的な方法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅおよ
びＬａｎｅ，Ｄ、抗体：実験マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラト
リープレス（１９８８）参照）を使用して産生する。簡潔には、Ｂａｌｂ／ｃマ
ウスを、フロイント完全アジュバント中の上記したような血清由来の抗Ａ６８自
己抗体を添加した、１０〜１５μｌのプロテインＡ／Ｇビーズ（Ａ／ＧＡ６８抗
体／ビーズ）からなる腹腔内注射液により免疫化する。その後のブースター投与
を、フロイント不完全アジュバント中の抗Ａ６８自己抗体を添加したプロテイン
Ａ／Ｇビーズ（Ａ／Ｇ−Ａ６８−抗体−ビーズ）を用いて、１４および２１日目
に実施する。３１日目に、マウスの尾を出血させ、血清を、Ａ６８（下記）を使
用した競合ＥＬＩＳＡにより、抗イディオタイプ抗体の存在について試験する。
高力価の抗イディオタイプ抗体を示すマウスの脾臓を、ＳＰ２／０−Ａｇ８骨髄
腫細胞と融合し、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングする。融合細胞
を、ＨＡＴ耐性により選択し、得られたクローン調製物を、Ａ６８自己抗体に対
する抗イディオタイプ抗体の存在について、間接的ＥＬＩＳＡによりスクリーニ
ングする。抗イディオタイプ抗体について試験で陽性のクローン調製物を、さら
に、標準的な技術によりサブクローニングし、モノクローナルハイブリドーマ調
製物を産生する。

【００９６】 Ａ６８自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体について初期およびその後のク
ローンを、間接的ＥＬＩＳＡを使用して同定する。以下のプロトコルを使用して
、Ａ６８に対して生じた抗イディオタイプ抗体を同定し；９６ウェルＥＬＩＳＡ
プレートを、重炭酸緩衝液中（３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ _３ 、ｐＨ９．６５、０．２μｍ滅菌ろ過）１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ
Ｆｃ特異的抗体１００μｌ／ウェルで２時間２５℃で覆膜する。ウェルを、３回
、洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、続いて２時
間２５℃で３００μｌ／ウェルの１％カゼイン／ＴＢＳで遮断する。

【００９７】 ウェルを、３回、洗浄緩衝液で洗浄する。次いで、試験するハイブリドーマウ
ェルからの組織培養培地を、１％カゼイン／ＴＢＳ中、１：１００の希釈度で、
マイクロタイタープレートに加え、２時間２５℃でインキュベートする。ウェル
を、３回、洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、最初の免疫原として使用したアルツハ
イマー病患者からプールしたヒト血清を、１％カゼイン／ＴＢＳ中、１：１００
の希釈度で、ウェルに加える。２時間２５℃でインキュベートした後、ウェルを
、８回、洗浄緩衝液で洗浄する。続いて、１％カゼイン／ＴＢＳ中の、１００μ
ｌの０．１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＡＬ州バーミンガム所在Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）をウェ
ルに加え、１．５時間２５℃でインキュベートする。このインキュベート後、ウ
ェルを、さらに８回、洗浄緩衝液で洗浄する。８８μｌのＥＣＬ（ＬｕｍｉＧＬ
Ｏ、ＭＡ州ゲーサースバーグ所在Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社
）をウェルに加え、相対的光単位（ＲＬＵ）を、各１秒間２１℃で積分モードで
個々のウェルを、ＬｕｍｉｏｎｓｋａｎＲＳルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅ
ｍｓ、フィンランド）を使用して計測することにより記録する。

【００９８】 ２通りのプレートを、平行して組立て、この場合、血清を、Ａ６８に対する自
己抗体を欠失している正常個体から得ることを除いて同じように処理する。目的
の抗イディオタイプ抗体のみを含む、陽性クローンは、Ａ６８に対する自己抗体
を含む血清と反応するが、これらの自己抗体を欠失した正常個体由来の血清とは
反応しないだろう。最初の抗原としてモノクローナル抗体を使用して産生したク
ローンをスクリーニングするために、直接的ＥＬＩＳＡを使用する以外は実質的
に同じ戦略を使用する。この場合、免疫原として使用したモノクローナル抗体を
修飾してＦ（ａｂ’）_２断片とし、ＨＲＰにコンジュゲートする。この方法は、
抗イディオタイプ抗体の検出に使用したモノクローナル抗体が、プレート上の抗
マウスＦｃ抗体により捕獲されないので必要である。

【００９９】 抗イディオタイプモノクローナル抗体のさらなる特徴づけは、Ａ６８を用いた
競合アッセイの使用により達成される。これらのアッセイは、抗イディオタイプ
抗体を、上記したようなプレートに加えることにより実施する。次いで、検出抗
体（ヒト血清抗体またはモノクローナルＦ（ａｂ’）_２ＨＲＰコンジュゲート抗
体）を、様々な濃度のＡ６８と共に加える。Ａ６８は、検出抗体上の抗原認識部
位について、抗イディオタイプ抗体と競合し、よって、シグナルは減弱する。

【０１００】 上記のアッセイのいくつかの変形があり、これも抗イディオタイプ抗体のスク
リーニングに使用できることを注記すべきである。これらのアッセイは、当業者
には明らかである。

【０１０１】 実施例７：リン酸化組換えタウおよびヒペリシンでの処理 本実施例は、組換えヒトタウ（ｒｈｔ）をリン酸化し、所望によりヒペリシン
で処理して、アルツハイマー病自己抗体との反応性を増加することのできる手段
を記載する。

【０１０２】 これらの研究で、ＭＳＮ抽出物を、５％ＣＯ_２雰囲気の加湿インキュベーター
中、Ｔ２２５フラスコで、（１５％胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、
１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した）ＲＰＭＩ１６４０中で、ＭＳ
Ｎ細胞（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７６：
３７５〜３８７項、１９８６）を培養することにより調製した。細胞を、８０％
の集密度となったらかき取って、５０ｍｌの円錐試験管に移した。細胞を、２，
０００×Ｇで５分間２１℃で遠心分離することによりペレット化し、細胞ペレッ
トをＴＢＳで洗浄した。次いで、２容量のＰ２緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
ｐＨ７．２、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、各２．５μｇ／ｍ
ｌのロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、１０μｇ／ｍｌのａＰＭＳＦ
、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、細胞ペレットを氷上でガラス−テフロン（登 録商標）ダウンスホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ホモジネートを 、８，０００×ｇで１０分間４℃で沈降させ、上清を、１００，０００×ｇで６ ０分間４℃で再沈降させた。得られたペレットを再懸濁して、Ｐ２緩衝液中５ｍ ｇ／ｍｌとした。

【０１０３】 ｒｈｔは、そのまま使用したか、または所望によりリン酸化してホスホ−ｒｈ
ｔを得た。ホスホ−ｒｈｔは、ｒｈｔを、２０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエチレンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．２、４ｍＭ
ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭエチレ
ンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、各２．５μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイ
ペプチン、およびペプスタチン、１０μｇ／ｍｌの４−アミジノ−フェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ａＰＭＳＦ）、１μＭオカダ酸、２ｍＭ ＡＴＰ、１
ｍＭエチレングリコールビス（ｂ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’−
テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、１０ｍＭホスホクレアチン、および２０μｇ／ｍｌク
レアチンホスホキナーゼ中、各１５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＭＳＮ抽出物（上記
のように調製）と合わせることにより得られた。サイクリックＡＭＰ依存性キナ
ーゼ触媒サブユニット（ピアス）を、１０μｌあたり、１．６７単位で含め得る
。反応は、ＡＴＰの添加により開始し、３０℃で１６時間撹拌しながら進行する
。反応は、２容量の５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ２−グリセロールホスフェート
、ＢＢＳ中２０％グリセロール、ｐＨ８．３の添加により停止する。リン酸化ｒ
ｈｔは、そのまま使用しても、１０分間煮沸し、１５，０００×ｇで１０分間４
℃で遠心分離し、上記のようなＮｉ−ニトリル酢酸アガロースカラムでクロマト
グラフィーにかけることにより再精製してもよい。

【０１０４】 ヒペリシン原液は、ＤＭＳＯ中２０ｍＭで調製し、−２０℃で保存した。処理
するｒｈｔまたはホスホ−ｒｈｔ調製物を、２０ｍＭ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７、１００
ｍＭ Ｈ_３ＢＯ_３、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３（ＢＢＳ）中で、所望のア
ッセイ濃度の２倍に希釈し、ＢＢＳ中６μＭヒペリシンと１：１で１時間以上、
２１℃で光の下で（ヒペリシンは光感受性である）混合した。２から５μＭのカ
ルフォスチンＣで置換しても、ｒｈｔおよびホスホ−ｒｈｔ免疫反応性に対して
類似の効果が示される。

【０１０５】 ｒｈｔおよびホスホ−ｒｈｔの両方を、ヒペリシンで処理し、前記のサンドイ
ッチアッセイでヒト自己抗体との反応性について解析した。ｒｈｔおよびホスホ
−ｒｈｔの両方が、ヒペリシン処理をしなくても、アルツハイマー病および対照
血清と反応性を示したが、ヒペリシンは、ｒｈｔについては２から４倍、ホスホ
−ｒｈｔについては約１００倍シグナル強度を増加させた（表３参照）。このシ
グナル増幅により、ヒト自己抗体の特徴づけおよび定量のために、十分に定義さ
れた抗原として、これらの精製タンパク質を使用することができる。Ａ６８はま
た、これらの同じ血清と反応性を示した。

【０１０６】

【表３】 表３に示した結果により、ｒｈｔまたはリン酸化ｒｈｔの、Ａ６８自己抗体と
のそのそれぞれの反応性の増加を引き起こす、物質の発見が確認される。これら
は、ＡＤのヒト自己抗体の検出を増強するための有用な抗原である。

【０１０７】 実施例８：アルツハイマー病抗原の成分の反応性の増加 本実施例は、物質（すなわち、これはアルツハイマー病抗原の成分を構成する
、例えばタウ、リン酸化タウ等）を処理する方法を記載し、よって、かかる処理
後のその状態は、最適には、実質的に免疫グロブリンＧを含まない本発明に記載
のＡ６８抗原調製物に存在している状態を反映する。従って、かかる処理は、こ
れらの物質が、アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する能力を増加する
方法を提供する。

【０１０８】 例えば、好ましくは本発明により、アルツハイマー病抗原と同じように機能す
るように処理しておいた、アルツハイマー病自己抗体組換えヒトタウ（ｒｈｔ）
の検出のために使用することが可能である。１つのかかる方法は、望ましくは、
細胞の抽出物がｒｈｔを超リン酸化する能力を増加させる、オカダ酸（ＯＫＡ）
で所望により処理しておいた、神経芽細胞（例えばＭＳＮ神経芽細胞）から調製
した細胞抽出物を使用することによる、ｒｈｔのリン酸化を含む。超リン酸化タ
ウは、プロテインＡ／Ｇ処理Ａ６８の主な成分である。かかる処理により産生さ
れた超リン酸化ｒｈｔはまた、アルツハイマー病抗原として使用して、血清中の
ヒト自己抗体を検出することができる。

【０１０９】 同様に、ｒｈｔおよび／またはリン酸化ｒｈｔ（上に詳述）は、最適には、ヒ
ペリシン（またはカルフォスチンＣ）で処理して、アルツハイマー病の診断とな
る自己抗体を検出するのに適したアルツハイマー病抗原を産生できる。従って、
ヒペリシン（またはカルフォスチンＣ）処理ｒｈｔは、望ましくは、アルツハイ
マー病の診断となる自己抗体の検出に使用できる、適切なアルツハイマー病抗原
として、本発明に従って使用できる。

【０１１０】 また、ｒｈｔは、所望により、ＷｉｌｓｏｎおよびＢｉｎｄｅｒ（Ａｍ．Ｊ．
Ｐａｔｈ．１５０、（６）、２１８１〜９５項（１９９７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０、（４１）、２４３０６〜１４項、（１９９５））に従って、遊
離脂肪酸（ＦＦＡ）で処理できる。好ましくは不飽和脂肪酸（例えば、オレイン
酸またはリノール酸、最も好ましくはアラキドン酸を含むがこれに限定されない
）を使用したかかる処理により、ｒｈｔは重合し、この重合も、プロテインＡ／
Ｇ処理Ａ６８の特徴である。従って、ＦＦＡ処理ｒｈｔは、アルツハイマー病の
診断となる自己抗体の検出に使用できる、適切なアルツハイマー病抗原である。

【０１１１】 さらに、文献でタウリン酸化に関連していた、精製または部分精製キナーゼを
単独または組合せて使用することにより、アルツハイマー病の診断となる自己抗
体を検出するためのアルツハイマー病抗原として適切な、超リン酸化ｒｈｔまた
は超リン酸化単離正常タウを産生できることは当業者には明らかであろう。かか
るキナーゼは、ＰＫＡ、ＧＳＫ、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５、カゼインキナーゼＩお
よびＩＩ、ＭＡＰキナーゼ、およびＰＨＦキナーゼを含むがこれに限定されない
。

【０１１２】 本発明のさらに別の表明において、Ｓｍｉｔｈ、Ｓａｙｅｒ、Ｍｏｎｎｉｅｒ
、Ｐｅｒｒｙら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８、（４
）、１７２〜６項（１９９５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、９１、５７１０〜１４（１９９４）；Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７
３８、４４７〜５４項（１９９４））により、進んだ糖化最終生成物（ＡＧＥ）
により、メイラード反応およびアマドリ転位によるタウの架橋が生じることが記
載されている。神経原線維濃縮体に、この架橋したタウが存在する証拠があり、
これは、以前に指摘されたように、Ａ６８／超リン酸化タウからなる。従って、
好ましくは脂質過酸化生成物の４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）また
は他のＡＧＥを、単独でまたは組合せて使用して、ｒｈｔを処理することにより
、アルツハイマー病の診断となる自己抗体の検出に適したアルツハイマー病抗原
が産生される。

【０１１３】 従って、これらの方法を使用して、アルツハイマー病抗原（すなわち、抗原の
単離成分）が、アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する能力を増加でき
る。

【０１１４】 実施例９：ウシタウの精製 本実施例は、ウシタウの精製を記載する。

【０１１５】 ウシ脳は、屠殺後できるだけ直ちに得、氷水に入れる。全てのその後の段階は
、特記しない限り４℃で実施する。大きな血塊を、６００ｇの大脳皮質から除去
する。重層している髄膜も同様に除去し得る。２−メルカプトエタノールおよび
ＰＭＳＦを、９００ｍｌの０．１Ｍの１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（
ＰＩＰＥＳ）−ＮａＯＨ、ｐＨ６．６、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４ （ＰＥＭ）に、最終濃度が各１ｍＭとなるまで加え、脳をそれに入れる。脳を、
低速で４秒間、次いで中程度の速度で４秒間、ワーリングブレンダーを使用して
ホモジナイズする。ホモジネートを、２３，０００×ｇで９０分間２℃で遠心分
離にかけ、上清を注意して収集する。ＧＴＰを、最終濃度が１．０ｍＭとなるま
で上清に加える。別に、ＧＴＰを０．１ｍＭとなるまで加えることができ、ＡＴ
Ｐを２．５ｍＭとなるまで加えることができる。穏やかに回旋しながら３７℃で
のインキュベートを、３０分間、大きなフラスコで実施し、微小管を会合する。
次いで、上清を、１ｍＭのＧＴＰを含むＰＥＭ中１０％スクロース２０ｍｌを底
に敷いた遠心瓶に移し、３７℃で４５分間２３，０００×ｇでの遠心分離にかけ
る。上清を廃棄し、ペレットを、０℃の１ｍＭ ＧＴＰを含む７５ｍｌ ＰＥＭ
に再懸濁し、テフロン／ガラスホモジナイザー（２０００ｒｐｍで２回）でホモ
ジナイズし、氷上で３０分間インキュベートし、微小管を解離する。次いで、混
合物を３８，０００×ｇで３０分間２℃で遠心分離にかける。上清を、予め秤量
した遠心管にデカントし、３７℃で１５分間インキュベートし、微小管を再重合
する。次いで、管を、３８，０００×ｇで３７℃で３０分間遠心分離にかける。
このペレットは、精製形のＭＡＰおよびチューブリンを含む。ＭＡＰをチューブ
リンから分離するために、ペレットを、０℃の１ｍＭ ＧＴＰ、１Ｍ ＮａＣｌ
を含む１／３容量のＰＥＭに再懸濁し、液化したペレットを、１ｍＭ ＧＴＰ、
０．２５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＥＭ中で平衡化しておいた、ペレット１ｍｌあた
り１ｍｌ床容量の、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ａ−５０、ファルマシア）に、
０．５ｍｌ／分で添加する。非結合画分中のＭＡＰ溶出液をＭＡＰｆと称する。
続いて、ウシタウを、ホスホセルロース上でＭＡＰｆからさらに精製する。

【０１１６】 タウタンパク質の別の調製法は、上記した最初の上清を使用するが、微小管を
会合する代わりに、上清を、５分間９０℃まで加熱する。次いで、２３，０００
×ｇで９０分間４℃で遠心分離にかける。タウタンパク質を続いて濃縮し、ＰＥ
Ｍ中で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ホワットマンＤＥ５２）上のアニオン
交換クロマトグラフィーにより部分精製する。タウタンパク質を、線形０〜１Ｍ
ＮａＣｌ塩勾配で溶出し、−８０℃で保存する。

【０１１７】 実施例１０：Ａ６８およびウシタウの逆ＥＬＩＳＡサンドイッチ法 本実施例は、Ａ６８およびウシタウの逆サンドイッチ法を記載する。

【０１１８】 Ａ６８およびウシタウに反応性を示す自己抗体はまた、抗原が固定されたサン
ドイッチ方でも検出できる。これは、Ｄｙｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ １ プ
レートを、覆膜緩衝液中３μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇ（Ｆｃ）で３時間２４
℃で覆膜し、続いて、ＢＢＳ中５％無脂肪乾燥ミルク２８８μｌで１時間２４℃
で遮断することにより達成される。Ａ６８捕獲のために、カゼイン／ＴＢＳ中１
μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＰＨＦ１を加える。ウシタウ捕獲のために、カ
ゼイン／ＴＢＳ中１μｇ／ｍｌのタウ１（Ｒｏｃｈｅ）を加える。両方を２時間
２４℃でインキュベートする。１μｌのＡ６８（約３０ｎｇ）または１μｌのＭ
ＡＰｆ（約１００ｎｇのウシタウ）を、ＢＢＳ中５％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏ
ｎｅ）に２０時間４℃で加える。別の抗原（例えばリン酸化ｒｈｔ＋／−ヒペリ
シン）も使用し得る。自己抗体について試験すべき血清を、１％無脂肪乾燥ミル
ク、５％正常ヤギ血清（シグマ）、ＢＢＳ中で１：１００の希釈度でウェルに加
え、１６時間４℃でインキュベートする。結合した自己抗体を、カゼイン／ＴＢ
Ｓ中０．２７μｇ／ｍｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートし
たヤギ抗ヒトＩｇを用いて、２時間２４℃で、次いで、９０μｌのＬｕｍｉＧｌ
ｏ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社）化学発光基質の添加により
検出する。

【０１１９】 化学発光は、上記のように測定する。各段階の間に、ウェルを、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０、ｔｂｓで洗浄する。全てのインキュベート液は、指摘されない限
り１００μｌである。

【０１２０】 実施例１１：ウェスタンブロット解析においてＡ６８と共にウシＭＡＰｆおよ
びタウを使用 本実施例は、血清のウェスタンブロット解析において、Ａ６８と共にウシＭＡ
Ｐｆを使用することを記載する。

【０１２１】 ウシＭＡＰｆは、とりわけ、７０％ＭＡＰ１＆２、２０％の他のＭＡＰ、およ
び１０％のタウＭＡＰアイソフォームを含む。本明細書で記載したような本発明
は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で４０〜６５ｋＤの範囲に移動する
、６つのタウＭＡＰアイソフォームを使用する。電気泳動、ウェスタン転写、血
清インキュベート、および結合した自己抗体の検出の方法は、実施例３で前記し
た方法と同じである。本実施例における例外は、電気泳動にＡ６８とＭＡＰｆが
交互であるレーンを使用することである。ＭＡＰｆは、１．５μｇの総タンパク
質／レーンの濃度を使用する。患者の血清を、精製Ａ６８タンパク質調製物を含
むニトロセルロース片およびＭＡＰｆを含むニトロセルロース片と共にインキュ
ベートし、次いで、結合した自己抗体を、前記したように可視化する。次いで、
精製Ａ６８タンパク質調製物およびＭＡＰｆ中のタウアイソフォームに結合した
自己抗体を、透過デンシトメーター（バイオラッドＧＳ−６７０）およびモレキ
ュラー・アナリスト・イメージ・アナリシス・ソフトウェア（バイオラッドバー
ジョン１．１．１）を使用して定量する。デンシトメーターを使用してウェスタ
ンブロットの像を獲得した後、ソフトウェアプログラムを使用して、精製Ａ６８
タンパク質調製物およびＭＡＰｆのタウアイソフォーム上の血清により生じたバ
ンドパターンの１次元プロフィルを創製する。次いで、プロフィルからバックグ
ラウンドを差し引く。得られたプロフィルは、バンドの幅、並びに、結合自己抗
体の光学密度（ＯＤ）の両方を示すピークを含む。ピーク下の面積の積分により
、ＯＤ×ｍｍの単位で、結合自己抗体の数字による測定値が提供される。

【０１２２】 ２つの解析法が現在、試験する各血清に診断を割当てるのに使用されている。
第一の方法では、精製Ａ６８タンパク質調製物からのＯＤ×ｍｍシグナルを、タ
ウアイソフォームの総ＯＤ×ｍｍシグナルで割る。試料に、この比に基づいて、
ＡＤまたは非ＡＤの診断を割当てる。

【０１２３】 第二の方法は、光学密度測定値だけではく、特定の血清により同定されたＭＡ
Ｐｆタウアイソフォームの数も考慮する。この解析法では、ウシＭＡＰｆタウシ
グナルが、精製Ａ６８タンパク質調製物と共に存在する場合、タウシグナルが３
つ未満のアイソフォームを含む場合には試料にＡＤの診断を割当て、３つ以上の
タウのアイソフォームを同定する場合には、試料に非ＡＤの診断を割当てる。同
様に、試料は、タウバンドの数に関わらず、それが精製Ａ６８タンパク質調製物
シグナルを欠失している場合には、非ＡＤとして分類する。この場合のＭＡＰｆ
タウシグナルの定量は、式（合計ＯＤ×（ｎ−２））を用いる。この式で、「合
計ＯＤ」は、全タウアイソフォームのＯＤの合計×ｍｍ測定値であり、「ｎ」は
、６つのタウＭＡＰｆアイソフォームを示すバンドの総数である。従って、精製
Ａ６８タンパク質調製物シグナルを与え、実質的にタウシグナルを欠失した試料
はＡＤと称し、全ての他の組合せ（Ａ６８シグナル＋タウシグナル、タウシグナ
ルのみ、または両方のシグナルが存在しない）は、非ＡＤと診断する。

【０１２４】 タウアイソフォームの使用は、ここでは、ＭＡＰｆに見出されるウシタウアイ
ソフォームの使用に限定されない。単一分子としてまたはタウアイソフォームの
混合物としての、脳から精製したタウ、組換えタウなどの、他の形のタウタンパ
ク質も使用し得る。さらに、本発明は、ウシタウに限定されない。ヒト、げっ歯
類、または他の哺乳動物源などの、他の種の脳または培養細胞由来の精製タウま
たはＭＡＰ、並びに、トリおよび爬虫類由来の調製物も使用し得る。

【０１２５】 実施例１２：ニトロセルロースプレート上での間接的ＥＬＩＳＡ 本実施例は、ニトロセルロース上での間接的ＥＬＩＳＡを記載する。

【０１２６】 精製Ａ６８タンパク質調製物およびウシタウと反応性を示す自己抗体は、間接
的ＥＬＩＳＡアッセイでも検出され得、ここでの抗原は、マイクロタイタープレ
ートに固定され、各ウェルの底にはニトロセルロースがある。この支持体により
、抗原を、ポリスチレン支持体よりもウェスタンブロットに近似した様式で提示
することが可能となる。ミリポアＭＨＡＢプレートを、１分間ＢＢＳで予め湿ら
せ、次いで緩衝液を真空下でフィルターを通して吸引する。抗原を、１ウェルあ
たりＢＢＳ中０．０１から１０μｌ（０．３から３００ｎｇ）でウェルに適用し
、３時間２４℃で結合させる。これらの実験では、抗原は、精製Ａ６８タンパク
質調製物、ウシタウ（ＭＡＰｆ）、または精製Ａ６８タンパク質調製物類似体、
例えばリン酸化ｒｈｔであり得る。抗原溶液を、真空下でフィルターを通して吸
引し、フィルターを、１．５時間２４℃で、ＢＢＳ中５％無脂肪乾燥ミルクで遮
断する。続いて、全てのインキュベート溶液を、プレート洗浄器（Ｎｕｎｃ）に
より除去し、真空下で膜を吸引することによるのではなく、ＴＢＳ中０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ２０で洗浄する。１％血清を、ウェルの１００μｌの１％無脂肪乾燥ミ
ルク、５％の正常ヤギ血清、ＢＢＳ中に加え、１６時間４℃でインキュベートす
る。結合したヒトＩｇを、２時間２４℃で、１％カゼイン／ＴＢＳ中のＨＲＰに
コンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇを添加し、次いで９０μｌのＬｕｍｉＧｌｏ
（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ社）化学発光基質を添加すること
により検出する。化学発光は、上記のように測定する。

【０１２７】 本明細書に引用した全ての参考文献は、これにより全体を参考として援用する
。特に、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９６／２０２１８号の全文書および教義を
、これにより参考として援用する。

【０１２８】 本発明は、好ましい実施形態に関して強調して記載したが、好ましい組成物お
よび方法の変形も使用し得、本発明は、本明細書に明記した以外の方法でも実施
し得ることは、当業者には明らかであろう。従って、本発明は、以下の特許請求
の範囲により規定される本発明の精神および範囲内に包含される全ての修飾形を
含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アルツハイマー病患者の抗Ａ６８自己抗体の検出のための、ウェスタ
ンブロットの写真の再現であり、ここで、片を、２名のアルツハイマー病患者（
患者１、レーン２；患者２、レーン４）および２名の正常対照（患者３、レーン
３；患者４、レーン５）由来の血清でプローブした。相対的な分子量を、ブロッ
トの左に列挙する。レーン１により、抗Ａ６８モノクローナル抗体により産生さ
れたＡ６８バンドパターンが実証される。

【図２】 図２は、２ロットの部分精製されたＡ６８調製物（「ロットＡ」、レーン１〜
３、および「ロットＢ」、レーン４〜６）および１ロットのプロテインＡ／Ｇ処
理Ａ６８調製物（レーン７〜９）を使用して、アルツハイマー病患者の抗Ａ６８
自己抗体を検出するための、ウェスタンブロットの写真の再現である。片を、２
名のアルツハイマー病患者（患者１、レーン２、５、８または患者２、レーン３
、６、９）由来の血清、次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰでプローブするか、ま
たは片を、ヤギ抗ヒトＨＲＰ抗体のみを使用して（レーン１、４、７）Ａ６８調
製物に内因性のＩｇＧについてプローブした。記号：約５５ｋＤの矢印は、Ｉｇ
Ｇの重鎖を示す；矢印の頭部は、顕著なＡ６８バンドを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 33/53 27/26 ３１５Ｊ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 コーンケン、 ラッセル エドウィン アメリカ合衆国 イリノイ州 60076 ス コーキー イー． プロールー ロード 8724 (72)発明者 デベルナルディス、 ジョン フランシス アメリカ合衆国 イリノイ州 60046 リ ンデンハースト コロニー アヴェニュー 2100 Ｆターム(参考） 4B064 AG01 AG27 CA10 CA20 CA21 CB27 CC01 CC24 CD07 CD14 CD30 DA01 DA13 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA50 CA40 DA75 DA76 DA86 EA20 EA50 FA52 FA71 FA72 GA01 GA10 GA15 GA26

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０５として同定されたハイブリドーマ
   細胞系により産生されるモノクローナル抗体と免疫的に反応性である抗原から実
   質的になるタンパク質調製物であって、前記調製物は実質的に免疫グロブリンＧ
   を含まない、前記タンパク質調製物。
2. 【請求項２】 前記調製物は、前記調製物の総タンパク質の約０．０５％以
   下の量の免疫グロブリンＧを有する、請求項１に記載のタンパク質調製物。
3. 【請求項３】 前記調製物は、前記調製物の総タンパク質の約０．００１５
   ％以下の量の免疫グロブリンＧを有する、請求項１に記載のタンパク質調製物。
4. 【請求項４】 前記調製物は、前記抗原１μｇあたり、約５００ｐｇ未満の
   免疫グロブリンＧを有する、請求項１に記載のタンパク質調製物。
5. 【請求項５】 前記調製物は、前記抗原１μｇあたり、約１５ｐｇ未満の免
   疫グロブリンＧを有する、請求項１に記載のタンパク質調製物。
6. 【請求項６】 抗原から実質的になるタンパク質調製物であって、前記調製
   物は、アルツハイマー病の診断マーカーであり、前記抗原は、 （ａ）還元形または非還元形で約６の等電点を有し； （ｂ）ａｆｆｉ−Ｂｌｕｅカラムに結合し； （ｃ）ｐＨ６．８の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウムお
   よび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドの溶液に少なくとも５０％可溶
   性であり、４℃の５０％飽和硫酸アンモニウムに沈降し； （ｄ）ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０５として同定されたハイブリドーマ細胞系により
   産生されるモノクローナル抗体と免疫的に反応性であり；そして （ｅ）実質的に免疫グロブリンＧを含まない、 主要なペプチド種を含む、前記タンパク質調製物。
7. 【請求項７】 前記調製物は、前記調製物の総タンパク質の約０．０５％以
   下の量の免疫グロブリンＧを有する、請求項６に記載のタンパク質調製物。
8. 【請求項８】 前記調製物は、前記調製物の総タンパク質の０．００１５％
   以下の量の免疫グロブリンＧを有する、請求項６に記載のタンパク質調製物。
9. 【請求項９】 前記調製物は、前記抗原１μｇあたり、５００ｐｇ未満の免
   疫グロブリンＧを有する、請求項６に記載のタンパク質調製物。
10. 【請求項１０】 前記調製物は、前記抗原１μｇあたり、１５ｐｇ未満の免
    疫グロブリンＧを有する、請求項６に記載のタンパク質調製物。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のタンパク質調製物を獲得するプロセスで
    あって、前記プロセスは、 （ａ）前記抗原を含む皮質脳組織の試料を獲得し； （ｂ）前記試料を緩衝液中でホモジナイズして、ホモジネートを得； （ｃ）前記ホモジネートから粒状物質を取り出し； （ｄ）前記抗原と抗体が抗原−抗体複合体を形成する条件下で、前記ホモジネー
    トを前記抗体と接触させることにより、前記ホモジネートから前記抗原を取り出
    し； （ｅ）前記抗原−抗体複合体から前記抗原を溶出し；そして （ｆ）溶出液から免疫グロブリンＧを除去して、前記タンパク質調製物を獲得す
    ることを含む、前記プロセス。
12. 【請求項１２】 前記免疫グロブリンＧは、前記タンパク質調製物を、（ａ
    ）プロテインＡ；（ｂ）プロテインＧ；（ｃ）プロテインＡおよびプロテインＧ
    の両方；または（ｄ）実質的に（ｃ）に等価である免疫グロブリンＧ除去法を用
    いて、インキュベートすることにより除去する、請求項１１に記載のプロセス。
13. 【請求項１３】 ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０５として同定されたハイブリドー
    マ細胞系により産生されるモノクローナル抗体と免疫的に反応性である抗原から
    実質的になる調製物を獲得するプロセスにおいて、改良は、抗原調製物から免疫
    グロブリンＧを除去して、実質的に免疫グロブリンＧを含まない調製物を獲得す
    ることを含む、前記プロセス。
14. 【請求項１４】 アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載のタンパク質調製物および前記自己抗体の存在について試
    験する試料を獲得し； （ｂ）ゲル上で前記タンパク質調製物を電気泳動し； （ｃ）前記タンパク質調製物を膜に転写し； （ｄ）前記膜を、自己抗体の存在について試験する試料と接触させ、よって抗原
    −自己抗体複合体が形成でき；そして （ｅ）前記複合体の形成により前記自己抗体を検出することを含む、前記方法。
15. 【請求項１５】 前記試料は、脳脊髄液、脳組織ホモジネート／抽出物、尿
    、および血液からなる群から選択する、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載のタンパク質調製物を獲得し； （ｂ）前記タンパク質調製物を、前記自己抗体の存在について試験する試料と接
    触させ、よって、抗原−自己抗体複合体が形成でき；そして （ｃ）前記複合体の形成により前記自己抗体を検出することを含む、前記方法。
17. 【請求項１７】 前記自己抗体の存在は、前記複合体の存在により決定する
    、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記複合体の量を測定し、前記自己抗体の量は、前記複合
    体の量により決定する、請求項１６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記試料は、脳脊髄液、脳組織ホモジネート／抽出物、尿
    および血液からなる群から選択する、請求項１６に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記自己抗体は、固体マトリックスに付着している、請求
    項１６に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記複合体を、自己抗体またはタンパク質調製物上に見出
    される抗原性決定基と免疫的に反応性である抗体と接触させ、よって、抗原−抗
    体または抗体−自己抗体複合体を形成する段階をさらに含む、請求項１６に記載
    の方法。
22. 【請求項２２】 アルツハイマー病罹患患者に存在する自己抗体に結合でき
    るタンパク質を製造する方法であって、前記方法は、組換えタウまたはその誘導
    体をリン酸化することを含む、前記方法。
23. 【請求項２３】 前記リン酸化は、所望によりホスファターゼ阻害剤で処理
    しておいた中枢神経系細胞から調製した細胞抽出物を使用して実施する、請求項
    ２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記リン酸化は、ＰＫＡ、ＧＳＫ、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５
    、カゼインキナーゼＩおよびＩＩ、ＭＡＰキナーゼおよびＰＨＦキナーゼからな
    る群から選択する、精製または部分精製キナーゼを使用して実施する、請求項２
    ２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 アルツハイマー病罹患患者に存在する自己抗体に結合でき
    るタンパク質を製造する方法であって、前記方法は、 （ａ）前記自己抗体に結合できないタンパク質を、ヒペリシン、カルフォスチン
    Ｃまたは類似物で処理するか；または （ｂ）前記自己抗体に結合できないタンパク質を、遊離脂肪酸で処理するか；ま
    たは （ｃ）前記自己抗体に結合できないタンパク質を、ヒドロキシノネナールまたは
    他の進んだ糖化最終生成物で処理するか；または （ｄ）上記の組合せを含む、前記方法。
26. 【請求項２６】 処理は、不飽和遊離脂肪酸を用いる、請求項２５に記載の
    方法。
27. 【請求項２７】 処理は、進んだ糖化最終生成物を用い、前記の進んだ糖化
    最終生成物は脂質過酸化生成物４−ヒドロキシ−２−ノネナールである、請求項
    ２５に記載の方法。
28. 【請求項２８】 Ａ６８抗原に対して指向された抗体と免疫的に反応性であ
    る、モノクローナル抗体。
29. 【請求項２９】 Ａ６８抗原に対して指向された抗体と免疫的に反応性であ
    る抗体を獲得する方法であって、前記方法は、 （ａ）高力価の抗Ａ６８自己抗体を有する個体から血清を獲得し、合わせてプー
    ルを創製し；前記プールから抗体を単離するか、 または、Ａ６８抗原に対する単離モノクローナル抗体を得； （ｂ）マウスを、前記単離抗体で免疫化し； （ｃ）前記マウスから血清を獲得し；そして （ｄ）前記血清を試験して、Ａ６８抗原に対して指向されたモノクローナル抗体
    または血清自己抗体と免疫的に反応性である、高レベルの抗体を有するマウスを
    同定することを含む、前記方法。
30. 【請求項３０】 （ａ）Ａ６８抗原に対して指向されたモノクローナル抗体
    または血清自己抗体と免疫的に反応性である、高レベルの抗体を有する前記マウ
    スの脾臓を獲得し； （ｂ）前記脾臓を骨髄細胞と融合し、組織培養プレートにプレーティングし； （ｃ）ＨＡＴ耐性により融合細胞を選択し；そして （ｄ）前記融合細胞を、Ａ６８抗原に対して指向されたモノクローナル抗体また
    は血清自己抗体と免疫的に反応性である抗体の産生について試験することをさら
    に含む、請求項２９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記融合細胞を、Ａ６８抗原と反応しないモノクローナル
    抗体または血清自己抗体と免疫的に反応性ではない抗体の産生について試験する
    ことをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載のタンパク質調製物、ウシ微小管結合タンパク質調製物、
    および前記自己抗体の存在について試験する試料を獲得し； （ｂ）前記タンパク質調製物および前記ウシ微小管結合タンパク質調製物を、ゲ
    ル上の別々のレーンで電気泳動し； （ｃ）前記の電気泳動したタンパク質調製物および前記ウシ微小管結合タンパク
    質調製物を、膜に転写し； （ｄ）前記膜を、前記自己抗体の存在について試験する試料と接触させ、よって
    、自己抗体複合体は、前記タンパク質調製物中に存在する抗原および／または前
    記ウシ微小管結合タンパク質調製物中に存在する抗原を用いて形成でき；そして （ｅ）前記自己抗体を、前記複合体（群）の形成により検出することを含む、前
    記方法。
33. 【請求項３３】 アルツハイマー病に存在する自己抗体を検出する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載のタンパク質調製物およびウシ微小管結合タンパク質調製
    物を獲得し； （ｂ）前記タンパク質調製物または前記ウシ微小管結合タンパク質調製物を、自
    己抗体の存在について試験する試料と接触させ、よって抗原−自己抗体複合体を
    形成でき；そして （ｃ）前記自己抗体を、前記複合体の形成により検出することを含む、前記方法
    。
34. 【請求項３４】 前記自己抗体の存在は、前記複合体の存在により決定する
    、請求項３３に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記複合体の量を測定し、前記自己抗体の量は、前記複合
    体の量により決定する、請求項３３に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記試料は、脳脊髄液、脳組織ホモジネート／抽出物、尿
    および血液からなる群から選択する、請求項３３に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記タンパク質調製物またはウシ微小管結合タンパク質調
    製物は、固体マトリックスに付着している、請求項３３に記載の方法。
38. 【請求項３８】 患者の生体試料からアルツハイマー病に存在する自己抗体
    を検出する方法であって、 （ａ）数個のタンパク質の凝集物から実質的になるタンパク質調製物を電気泳動
    し、ここで、前記凝集物の主な種は、還元ＳＤＳゲル上で約６８，０００ダルト
    ンの分子量を有するリン酸化タンパク質であり、前記凝集物は、ＡＴＣＣ番号Ｈ
    Ｂ９２０５として同定されたハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクロー
    ナル抗体と免疫的に反応性であり、前記調製物は、ゲル上で実質的に免疫グロブ
    リンＧを含まず； （ｂ）前記の電気泳動したタンパク質調製物を膜に転写し； （ｃ）前記の膜を、前記自己抗体の存在について試験する生体試料と接触させ、
    よって抗原−自己抗体複合体を形成でき；そして （ｄ）前記自己抗体を、前記複合体の形成により検出することを含む、前記方法
    。
39. 【請求項３９】 患者の生体試料からアルツハイマー病に存在する自己抗体
    を検出する方法であって、 （ａ）数個のタンパク質の凝集物から実質的になる第一タンパク質調製物、ここ
    で、前記凝集物の主な種は、還元ＳＤＳゲル上で約６８，０００ダルトンの分子
    量を有するリン酸化タンパク質であり、前記凝集物は、ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０
    ５として同定されたハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体
    と免疫的に反応性であり、前記調製物は、実質的に免疫グロブリンＧを含まない
    、並びに、ウシ微小管結合タンパク質調製物を含む第二タンパク質調製物を、ゲ
    ル上の別々のレーンで電気泳動し； （ｂ）電気泳動した第一および第二タンパク質調製物を、膜に転写し； （ｃ）前記の膜を、前記自己抗体の存在について試験する試料と接触させ、よっ
    て、自己抗体複合体が、前記の第一および／または第二タンパク質調製物に存在
    する抗原を用いて形成でき；そして （ｄ）前記自己抗体複合体を検出することを含み、ここで、第一タンパク質調製
    物の自己抗体複合体は、第二タンパク質調製物の自己抗体複合体のものとは異な
    り、その差異により患者のアルツハイマー病の存在が示唆される、前記方法。
40. 【請求項４０】 患者の生体試料からアルツハイマー病に存在する自己抗体
    を検出する方法であって、 （ａ）数個のタンパク質の凝集物から実質的になる第一タンパク質調製物、ここ
    での前記凝集物の主な種は、還元ＳＤＳゲル上で約６８，０００ダルトンの分子
    量を有するリン酸化タンパク質であり、前記凝集物は、ＡＴＣＣ番号ＨＢ９２０
    ５として同定されたハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体
    と免疫的に反応性であり、前記調製物は、実質的に免疫グロブリンＧを含まない
    、または、ウシ微小管結合タンパク質調製物を含む第二タンパク質調製物を、生
    体試料と接触させ、よって抗原−自己抗体複合体を形成でき；そして （ｂ）前記自己抗体を、前記複合体の形成により検出することを含み； ここで、自己抗体と第一タンパク質調製物の間に形成された複合体は、自己抗体
    と第二タンパク質調製物の間に形成された複合体とは異なり、その差異により患
    者のアルツハイマー病の存在が示唆される、前記方法。
41. 【請求項４１】 タンパク質は、所望によりリン酸化された正常タウまたは
    所望によりリン酸化された組換えヒトタウである、請求項２５に記載の方法。