JPH11500316A

JPH11500316A - 結核菌の細胞内取り込みをコードするｄｎａ分子およびその利用

Info

Publication number: JPH11500316A
Application number: JP8525764A
Authority: JP
Inventors: ライリー，リー・ダブリュー
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-02-22
Filing date: 1996-02-20
Publication date: 1999-01-12
Also published as: CA2212870A1; WO1996026275A1; BR9607406A; EP0811066A1; US6509151B1; US6214543B1; CN1182454A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する単離ＤＮＡ分子に関する。この遺伝子フラグメントによりコードされるタンパク質は結核菌の感染を予防するワクチンに有用であり、一方、このタンパク質に対する抗体は微生物に既に感染した者を受動免疫するのに用いることができる。これらのタンパク質および抗体は組織および体液中の結核菌を検出する診断検定に用いられる。本発明のタンパク質は、哺乳動物、特にヒトに投与するため、種々の他の治療物質と結合して、これらの物質の細胞による取り込みを達成し得る。

Description

【発明の詳細な説明】結核菌の細胞内取り込みをコードするＤＮＡ分子およびその利用発明の分野本発明は、結核菌の取り込みをコードするＤＮＡ分子、および薬剤、ワクチンおよび診断試験におけるその利用に関する。発明の背景結核は世界における主要な死因であって、毎年９００万人の新しい結核患者の発生と２９０万人の死亡があると考えられている。米国では、結核の着実な減少傾向が１９８５年に逆転した。この問題は、結核菌の薬剤耐性株の増加によって悪化している。最近の結核の流行は、多数のＨＩＶ感染者が非常に近接した場所（例えば、病院、矯正施設およびホスピスにおけるＡＩＤＳ病棟）に居住することと関連している。ヘルス・ケア従事者への結核の伝染が頻発している。該従事者の１８−５０％に皮膚テストで感染が認められている。参照 F.Laraque et al.，“ＨＩＶ感染患者における結核”The AIDS Reader(September/October 1992)、（参考によりここに合体する）。結核菌の感染後には、２つの基本的な臨床パターンがある。多数の症例において、吸入された結核菌は、食細胞肺胞マクロファージに取り込まれて、すぐに殺されるか、または結核結節と呼ばれる病変部において限られた程度に細胞内で生育する。稀に、小児または免疫無防御状態者において、小粟粒（キビ様）病変または生命の危険性がある髓膜炎を伴う早期の血行性撒布がおきる。通常は、感染２−６週間後、細胞性免疫が生じ、免疫リンパ球および活性マクロファージの病変部への浸潤によって、大部分の菌は殺され、初期感染は壁で隔離されてしまう。しばしば、感染者は症状に気付かないことがある。ツベルクリンの精製タンパク質誘導体に対する皮膚反応試験および、ある場合には治癒し石灰化した病変部のＸ線写真が感染の唯一の証拠となる。しかし、未知の程度で、休眠中であるが生育し得る結核菌が存在し続ける。第２のパターンは、感染の活発な病気への進行である。結核菌に感染した者の１０％で病気へ進行する生涯的危険がある。いずれの場合も、結核菌は、肺の初期感染部位からリンパ管または血液を通して体の他の部位（肺尖およびリンパ結節が好適部位である）に拡がる。胸膜、リンパ管、骨、生殖泌尿器系、髓膜、腹膜および皮膚などの肺以外の結核は、結核患者の約１５％で起きる。多くの菌は殺されるが、大きな割合で浸潤食細胞および肺の実質的細胞も死に、特徴的な固形乾酪性（チーズ様）壊死が生じ、その中で菌は、繁茂はしないが、生存することができる。保護免疫反応が優勢になると、病変部は捕獲されてしまうが、なお肺や他の組織にいくらか残留する危険性がある。もし壊死反応が拡大し、気管支にまで入り込むと、肺に空洞ができ、多数の菌が外部へ咳に伴って拡散する。最悪の場合、固形壊死、おそらく炎症細胞からの放出ヒドロラーゼの結果が液体化し、おそらくミリリットル当たり１０⁹にも達する菌増殖の富化培地が形成する。病理的および炎症的過程により、特徴的な衰弱、発熱、胸痛、咳、および血管侵食のあるとき、血痰が生じる。発病力および病原論の分子的基礎については、分かっていないことが多い。非発病力株についての分子的根拠の確立、病原体の推定される発病力遺伝子の同定およびクローニング、およびこれらの遺伝子による発病力株の非発病力株への転換を明らかにすることが必要である。結核菌の非発病力株は存在するが、変異の本質は分かっていない。結核の病原論に関連する単一の遺伝子は、先行技術で明確にされていない。宿主細胞の侵襲、細胞内生存、生長、拡散または組織屈動性の分子的基礎も知られていない。現存の薬剤の標的は分子レベルで特徴が明らかにされておらず、いかなる薬剤に対する耐性メカニズムも明確でない。薬剤開発のための新しい結核菌標的は２０年間特徴付けがなされていない。結核に対して多くの規定された処置療法がある。米国公衆衛生局および米国胸部学会の推奨する療法は、２カ月間のイソニアチド、リファンピシンおよびピラジナミドの併用、それに続く４カ月間のイソニアチドおよびリファンピシンの投与である。ＨＩＶ感染者に対しては、イソニアチドおよびリファンピシン処置がさらに７カ月間続けられる。この処置は、短期化学療法と言われて、完全に行った患者において９０％以上の治癒率である。多種薬剤耐性の結核に対する処置では、最初の療法において追加のエタンブトールおよび／またはストレプトマイシン、または２次的薬剤、カナマイシン、アミカシリン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、ＰＡＳおよびクロファジミンなどを必要とする。新しい薬剤、シプロフロキサシンおよびオフロキサシンなども使用できる。通常の結核菌感染で、ＰＰＤ陽性結果である者に対しては、イソニアチドによる化学療法的予防措置が病気を防止するのに約９０％有効である。結核およびこれらの処置の詳細については、B.Bloom et al.,“結核: 再び現れた殺人者について”Scien ce ,257:1055-64(1992);“米国における結核の対処”American Thoracic Society ,146:1623-33(1992); City Health Information，vol.11（1992）（参考によりここに合体する）に記載されている。結核に対して現在用いられている処置は、比較的高レベルの成功を納めているが、この疾患の処置についての成功率を改善する必要性は、なお存している。更に、従来の処置療法に対して抵抗性のある結核菌株がますます増加していることから、新しいタイプの処置法が開発されねばならない。高率の結核発生地域において、米国でも外国でも、かかる耐性菌は増大している。発明の要約本発明は、哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する単離ＤＮＡ分子、およびこれらの単離ＤＮＡ分子によりコードされる単離タンパク質またはポリペプチドに関する。該分子は、該タンパク質およびペプチドを生産する組換えＤＮＡ発現系を形成する発現ベクターにおいて異型ＤＮＡとして挿入され得る。同様に、異型ＤＮＡは、組換えＤＮＡ発現系を形成する発現ベクターに常に挿入され、この目的を達成するために細胞内に合体され得る。本発明の単離タンパク質またはポリペプチドは、薬学的に許容される担体と組み合わされてワクチンを形成し、または単独で、哺乳動物、特にヒトに投与されて、結核菌の感染を防止するために使用される。別に、本発明のタンパク質またはポリペプチドの各々は、抗体またはその結合部分をつくるために用いることができる。抗体またはその結合部分は、単独で、または薬学的に許容される担体と共に、すでに結核菌と接触した哺乳動物、特にヒトを処置し、疾患の発病を防止する受動免疫を誘発するために用いることができる。本発明のタンパク質またはポリペプチド、またはそれらに対する抗体またはその結合部分は、組織または体液サンプル中の結核菌の検出方法にも用いることができる。タンパク質またはポリペプチドを用いたときは、これらは抗原として提供される。抗原または抗体とのいかなる反応もサンプル中の結核菌の存在を表示する検定系を用いて検出される。他方、哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する遺伝子のヌクレオチド配列またはそのフラグメントをプローブとして、核酸ハイブリダイゼンション検定または遺伝子増幅検定法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）において、提供することにより、該サンプル中の結核菌が検出される。プローブとのいかなる反応も検定されて、サンプル中の結核菌の存在が明らかになる。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、結核菌の処置または検定と関係しない目的にも用いることができる。詳細には、哺乳動物の細胞に入る能力を結核菌に付与するこれらのタンパク質およびポリペプチドの効力を、かかる細胞が他の物質を取り込むように、利用することができる。これは、哺乳動物により取り込むための物質を含有する産物およびその物質に関連する本発明のタンパク質またはポリペプチドでもって達成される。本発明のＤＮＡ分子の単離は、該菌の処置および検定に顕著な進歩をもたらす。これは、結核菌の感染を予防するワクチンおよび結核菌に接触した者の受動免疫のための薬剤についての基を提供する。ワクチンに使用されるタンパク質、または薬剤を形成するタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を用いて高レベルで生産され得る。診断的利用において、本発明のタンパク質およびポリペプチド、およびこれらに対する抗体およびその結合部分は、特定の個人が結核菌に感染しているかどうかを迅速に決定することを可能にする。さらに、かかる検定は、抗体反応で調べられる個人を診察することなしに実施し得る。結核菌についての処置および診断手段とは別に、哺乳動物中にかかる生物体の入り込む能力を付与する本発明は、細胞内、特にマクロファージ内に物質を導入することを必要とする治療的処置において顕著な有用性を有する。本発明のタンパク質またはポリペプチドを薬剤と結びつけることにより、かかる薬剤はその治療を必要とする細胞内に迅速に導入され得る。該薬剤の細胞への取り込みが高められることは、その用量を減少し、従って毒性と費用を低下せしめる。例えば、従来の癌治療において、薬剤の毒性は大量投与の必要性から重要な問題である。本発明は、かかる高用量を減少でき、細胞内で同等または高い薬剤レベルの分布を可能とする潜在力を有している。さらに、本発明のタンパク質またはポリペプチドのＤＮＡフラグメントとの結合を遺伝子治療に関連して用いることができる。特に、マクロファージへの取り込みを高める本発明のＤＮＡ分子のコード産物の能力は、特異的にマクロファージへ遺伝子を伝達する機会を提供する。かかる系は、体液性免疫のみでなく、細胞性免疫をも誘発するのに用いることができる。図面の簡単な説明図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ２５１７７）（図１Ａ）および侵襲組換え株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）（図１Ｂおよび１Ｃ）を含む結核菌株感染のＨｅＬａ細胞の薄片電子顕微鏡写真である。電子− 透明域が結核菌体を取り囲んでいる（図１Ａの矢印）。細胞は、図１Ａの結核菌株と共に７２時間、図１Ｂおよび１ＣのＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）と共に７．５時間インキュベートされた。図１Ｃで多様生物体がみられ、食作用胞中の細菌増殖を示唆している。黒横棒は０.５μｍの長さを表す。図２は、元のベクターｐＺＸ７から単一方向性欠失サブクローン（ｐＺＸ７. ３，ｐＺＸ７.４，ｐＺＸ７.５ａｎｄｐＺＸ７.６）およびＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ（ｐＺＸ７.１），ＰｓｔＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ（ｐＺＸ７.２）、およびＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ（ｐＺＸ７.７）サブクローンの構築を示す。黒棒は結核菌ＤＮＡ配列を表し、白棒はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列を表す。サブクローン・ベクターはＥ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅに転移され、次いでそれらの形質転換株と共に６時間、ＨｅＬａ細胞単層でインキュベートされた。図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、組換えＥ.ｃｏｌｉクローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）に３時間（図３Ａ）および２４時間（図３Ｂ）さらしたヒトマクロファージおよび比較の非病原性Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）に２４時間さらした細胞（図３Ｃ）の薄片電子顕微鏡写真である。細菌は、区画化され、マクロファージの内側の膜層で囲まれている（図３Ｂ）。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にさらしたマクロファージにおいては、２４時間後に細菌が、電子顕微鏡で認められない。黒横棒は１μｍの長さを表す。図４は、細菌細胞の超音波処理物のアセトン沈降溶解性フラクションのＳＤＳ −ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動を示す。ポリペプチドは９％ゲルで分析された（左側）。分子の大きさ標準（１枠）、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニング部位間に非関連結核菌ＤＮＡフラグメントを含有するベクター（ｐＺＮ７）を有するＥ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（２枠）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）（３枠）。８％ゲル中での分析（右側）：ｐＺＸ７におけるＢａｍＨＩクローニング部位から１２塩基上流に導入された２− 塩基クレームシフトを有するベクターを含むＸＬ１−Ｂｌｕｅ（１枠）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）（２枠）。分子の大きさは最も右に表示する。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）の可溶性タンパク質フラクション中に５２−ＫＤポリペプチドを検出した（矢印）。約５０ＫＤのタンパク質はｐＺＸ７.８を含むＸＬ１−Ｂｌｕｅで発現される。５２−ＫＤタンパク質の発現は常に組換えＥ.ｃｏｌｉクローンのＨｅＬａ細胞相互作用と関連している。図５は、枠１に低分子量マーカーを有する組換えＥ.ｃｏｌｉ溶解生成物、枠２にＥ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）、枠３にＥ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ）、枠４に未誘発Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）、枠５に誘発Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ− ＯＲＦ１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。図６ＡおよびＢは、結核菌侵襲−関連組換えタンパク質でコートしたラテックス・ビードのＨｅＬａ細胞との結合についての透過電子顕微鏡写真を示す。図６Ａは、組換えタンパク質でコートしたビードを示す（矢印）。図６Ｂは、コントロールＥ.ｃｏｌｉ溶解生成物タンパク質でコートしたビードを示す（矢印）。発明の詳細な説明本発明の１つは、哺乳動物細胞に入る能力およびマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する単離ＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子は、次のように、配列番号１に対応するヌクレオチド配列を含む。上記ＤＮＡ分子は、約５０−５５キロダルトン、望ましくは５２キロダルトンの分子量を有するポリペプチドをコードする。アミノ酸配列は、配列番号１に対応するヌクレオチド配列から演繹され、カルボキシ末端に疎水領域を有する高親水性タンパク質である。これは、生物体の外膜に接するカルボキシ末端を有する分泌タンパク質、細胞質タンパク質または表面タンパク質であり得る。このタンパク質またはポリペプチドは、次のように配列番号２に対応する演繹アミノ酸配列を有していると考えられる。上記のタンパク質において、Ｘａａは終止コドンを意味する。この単離タンパク質またはポリペプチドの産生は、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて実施される。タンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞に入る能力およびマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する１以上の抗原決定基を有すると考えられる。上記配列番号１および２における終止コドンの存在から教示されるように、これらの配列は、いくつかの開放読み枠を構成し、またそれによりコードされる。最初の開放読み枠は、配列番号１のヌクレオチド配列の１８１番−８０７番に及んでいる。この配列は、哺乳動物細胞に入る能力を付与するものであり、次のヌクレオチド配列を有する（配列番号３）。配列番号３に対応するヌクレオチド配列は、次のアミノ酸配列をコードする（配列番号４）。このアミノ酸配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞に入る能力を結核菌に付与する１以上の抗原決定基を有する。このタンパク質またはポリペプチドは２２−２８キロダルトン、望ましく２５キロダルトンの分子量を有する。配列番号１および２に対応する配列は、マクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与すると考えられる追加の開放読み枠を含むかまたはそれによりコードされる。この開放読み枠に対応するヌクレオチド配列は、次の通りである（配列番号５）。配列番号５に対応するヌクレオチド配列は、次のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする（配列番号６）。マクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する演繹タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも２１キロダルトンの推定分子量を有する。天然において、このタンパク質またはポリペプチドは、配列番号６がその末端に終止コドンを有さないＤＮＡ分子によってコードされることから、配列番号６の２１キロダルトンよりも大きい分子量を有すると予測される。従って、天然において、マクロファージ内の生存を付与するタンパク質またはポリペプチドは、さらに長いと考えられる。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、望ましくは純粋な形で従来技術により生産される。例えば、下記実施例５−６参照。タンパク質を単離するために、組換えプラスミドを有するＥ.ｃｏｌｉ宿主細胞を繁殖させ、ホモゲナイズし、ホモゲネートを遠心分離して細菌片を除去する。上澄み液を段階硫酸アンモニウム沈降にかける。本発明のタンパク質を含有するフラクションを適当な大きさのデキストリンまたはポリアクリルアミド・コラム中でゲル濾過にかけ、タンパク質を分離する。必要に応じて、タンパク質フラクションをさらにＨＰＬＣで精製する。哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与するＤＮＡ分子の一つを細胞に、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて合体することができる。一般的に、選択したＤＮＡ分子をそれが異型となる（すなわち通常は存在しない）発現系に挿入する。異型ＤＮＡ分子は、適当な方向および正しい読み枠で発現系すなわちベクターに挿入される。ベクターは、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有している。 Cohen and Boyerの米国特許第４,２３７,２２４（参考によりここに合体する）は、制限酵素解裂およびＤＮＡリガーゼによる連結反応を用いる組換えプラスミドの形態における発現系の生産について記載している。これらの組換えプラスミドを形質転換の手段により導入し、原核生物を含む単−細胞培養物および組織培養で成育した真核細胞中で複製する。組換え遺伝子は、ワクシニアウイルスなどのウイルス中にも導入できる。組換えウイルスは、ウイルスに感染せしめた細胞中にプラスミドをトランスフェクトすることによりつくられる。適当なベクターには、限定するわけでないが、次のウイルス・ベクターが含まれる。ラムダ・ベクター系、ｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ.ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４など、およびプラスミド・ベクター、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＬＧ３３９，ｐＲ２９０，ｐＫＣ３７，ｐＫＣ１０１，ＳＶ４０，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ+/- ｏｒＫＳ+/-（参照“ストラタジーン・クローニング系 ”カタログ(1993)Ｓtratagene社，Ｌa Ｊolla，Ｃalif、参考によりここに合体する）、ｐＱＥ，ｐＩＨ８２１，ｐＧＥＸ，ｐＥＴ系（参照Ｆ.Ｗ.Ｓtudier et al.，“クローン化遺伝子の直接発現へのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの利用”Ｇe ne Ｅxpression Ｔechnology vol．185（1990）、参考によりここに合体する）およびこれらの誘導体である。組換え分子は細胞中に、形質転換、特にトランスフェクション、接合、動態化または電気穿孔によって導入される。ＤＮＡ配列は、Ｍaniatis et al.,分子クローニング：研究マニュアル,Ｃold Ｓpring Ｌabor atory,Ｃold Ｓprings Ｈarbor,Ｎew Ｙork（1982）（参考によりここに合体する）などに記載の公知の標準的クローニング手法によって、ベクター中にクローン化される。種々の宿主ベクター系がタンパク質コード配列を発現するために用いられる。まず、ベクター系は、用いられる宿主細胞と和合性でなければならない。宿主ベクター系には、限定するわけではないが、次のものが含まれる。バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌、イースト・ベクターを含むイーストなどの微生物、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）で感染した昆虫細胞系がある。用いる宿主ベクター系に従って、多くの適当な複製および翻訳要素の一つを使用できる。相違する遺伝子シグナルおよび進行過程が多くの遺伝子発現レベル（例えばＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳）を調整する。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に依存する。原核細胞プロモーターのＤＮＡ配列は、真核細胞プロモーターのものと異なる。さらに、真核細胞プロモーターおよび伴う遺伝子シグナルは、原核細胞系では、認められないか、または機能できない。また、原核細胞プロモーターは、真核細胞では認められないか、または機能できない。同様に、原核細胞中のｍＲＮＡの翻訳は、真核細胞とは異なる適当な原核細胞シグナルの存在に依存している。原核細胞中の効率的なｍＲＮＡの翻訳は、ｍＲＮＡ上にＳhine−Ｄalgarno（ＳＤ）配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする開始コドン、通常はＡＵＧ、の前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は、１６ＳｒＲＮＡ（リポソームＲＮＡ）の３'末に相補的であり、ｒＲＮＡで二重鎖にすることによりｍＲＮＡのリポソームへの結合をおそらく促進して、リポソームの正しい位置付けを可能にする。最大遺伝子発現の総説についてＲoberts and Ｌauer，Ｍethods in Ｅnzymology，68:473(1979)（参考によりここに合体する）を参照。プロモーターはその“長さ”（すなわち転写を促進する能力）が様々である。クローン化遺伝子を発現する目的には、高レベルの転写および遺伝子発現を得るために強力なプロモーターを用いるのが望ましい。用いた宿主細胞系に従って、多くの適当なプロモーターの一つを用いることができる。例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ、そのバクテリアファージ、またはプラスミド沖でクローニングするとき、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージｌａｍｂａのＰ_RおよびＰ_L プロモーターおよびその他のプロモーター、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐを含み、これに限定されない、プロモーターが隣接ＤＮＡセグメントの直接高レベル転写に用いられる。さらに、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは組換えＤＮＡまたは他の合成ＤＮＡ技術より製造される他のＥ.ｃｏｌｉプロモーターが挿入遺伝子の転写のために使用される。細菌宿主細胞株および発現ベクターは、特別に誘発しない限りプロモーターの作用を阻止するものが選ばれる。あるオペロンにおいては、特別の誘発物質の追加が挿入ＤＮＡの効率的な転写に必要である。例えば、ｌａｃオペロンはラクトーゼまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の添加により誘発される。多くの他のオペロン、ｔｒｐ、ｐｒｏなどは、異なる調節の下にある。特別の開始シグナルも原核細胞における効率的な遺伝子転写および翻訳に必要である。これらの転写および翻訳開始シグナルは夫々、遺伝子特異メッセンジャーＲＮＡおよび合成タンパク質の量で測定される“強さ”が違っている。プロモーターを含有するＤＮＡ発現ベクターは、種々の“強い”転写および／または翻訳開始シグナルの組み合わせも含む。例えば、Ｅ.ｃｏｌｉにおける効率的な翻訳には、リボソーム結合部位を提供するために５'−開始コドン（ＡＴＧ）へ約７−９塩基のＳhine−Ｄalgarno（ＳＤ）配列を必要とする。宿主細胞リボソームにより利用されるＳＤ−ＡＴＧ組み合わせが採用される。さらに組換えＤＮＡまたは合成ヌクレオチドの合体に関する他の技術により製造されるＳＤ−ＡＴＧ組み合わせも用いることができる。哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する希望の単離ＤＮＡ分子が発現系にクローン化されると、宿主細胞に合体される準備が整う。かかる合体は、ベクター／宿主細胞系に従って、上記の種々の形質転換によって実施し得る。適当な宿主細胞には、制限ではなく、細菌、ウイルス、イースト、哺乳動物細胞などが含まれる。一般に、ヒト免疫系は、細菌表面の特殊なタンパク質または炭水化物に結合する抗体を産生して、病原細菌の感染に応答する。抗体は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを有するマクロファージへの結合を促進する。補体と呼ばれる他の血清タンパク質は、外因粒子を覆い、マクロファージ上で特殊な表面レセプターとの結合によりその摂取を促進する。一旦粒子がマクロファージの表面に結合すると、摂取の段階的過程が粒子表面への細胞質膜のセグメントの継続的並置によって始まる。膜上の表面レセプターは、粒子表面に均一に分布しているリガンドと相互作用し、その表面に結合する。粒子を包むマクロファージは、粒子が摂取されるリポソームに送られる。ある種の微生物はマクロファージに摂取されるが（すなわちundergo uptake）、死ぬことはない。その中に結核菌がある。結果として、かかる微生物はマクロファージの内部で無期限的に生存することができ、マクロファージから出たときに、活性結核を起こす。哺乳動物細胞に入る能力を結核菌に付与するヌクレオチド配列に関する本発明による確定から、結核菌の取り込みについての分子的基礎が示唆される。この情報および上記の組換えＤＮＡ技術でもって、結核菌を処置または検出できる広範な治療的または予防的薬剤および診断的手法を開発し得る。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドの効果量を単独または薬学的に許容できる担体と共に、ヒトにワクチンとして結核菌の感染を予防するために、投与できる。一方、結核菌にさらされた者に、受動免疫としてタンパク質またはポリペプチドに対する抗体またはその結合部分の効果量を投与することもできる。かかる抗体またはその結合部分は、単独または薬学的に許容される担体と共に投与して、最近に結核菌にさらされたかもしれない者の処置を短縮できる。受動免疫を誘導するのに用いられるのに適した抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルである。モノクローナル抗体の産生は公知の技術によってなされる。基本的には、最初に、哺乳動物（例えばマウス）の脾臓から免疫細胞（リンパ球）を得る。動物は前もって希望する抗原（例えば、本発明のタンパク質またはペプチド）によりインビボまたはインビトロで免疫しておく。抗体分泌リンパ球は（マウス）ミエローマ細胞または形質転換細胞と融合し、これは細胞培養物中で無期限的に複製することができ、よって、不死の免疫グロブリン分泌細胞系をつくる。得られた融合細胞すなわちハイブリドーマは培養されて、得られたコロニーが希望するモノクローナル抗体の産生のためにスクリーニングされる。かかる抗体を産生するコロニーは、インビトロまたはインビボでクローン化され、そして生長して、大量の抗体を生産する。かかる細胞の融合については、理論的基礎および実際的な方法についてＫohler and Ｍilstein，Ｎature 256:495(1975)（参考によりここに合体する）に記載されている。哺乳動物のリンパ球の免疫は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの一つでもって動物（例えばマウス）のインビボ免疫によりなされる。かかる免疫は、抗体の充分な力価を得るために７週間まで定期的に実施される。ウイルスは適当な溶液またはアジュバント中に保持される。最後の抗原強化後に、動物は殺されて、脾臓細胞が取り出される。細胞培養における哺乳動物ミエローマ細胞または無期限的に複製できる他の融合パートナーとの融合は、標準的既知技術、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の融合剤を用いて実施される（参照、Ｍilstein and Ｋohler,Ｅ ur. Ｊ．Ｉmmunol .6:511(1976)、参考によりここに合体する）。この不死の細胞系は、望ましくはネズミのものであるが、ラットおよびヒトなどの他の哺乳動物の細胞からも誘導され、速い生長ができ、かつ優れた融合能を有するために、ある種の栄養の利用に必要な酵素を欠いて、選択される。多くのかかる細胞系は当業者によく知られており、また定期的に発表されている。ポリクローナル抗体を得る方法もよく知られている。典型的には、かかる抗体は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの一つをニュージーランド白色兎に皮下注することにより産生される。兎はプレ免疫血清を得るために最初に採血されている。抗原は、異なる６部位に各部位につき全量１００μｌ注入できる。各注入物質は、合成界面活性剤アジュバント・プルロニク（pluronic）ポリオールまたはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後にタンパク質またはポリペプチド含有粉砕アクリルアミドゲルを含む。最初の注入２週間後に採血し、そして同じ抗原で６週間毎３回定期的に強化する。各注入１０日後にサンプルの血清を採取する。ポリクローナル抗体は、抗体を捕獲するための対応抗原を用いてアフィニティ・クロマトグラフィーにより血清から得る。最後に兎をペントバルビタール１５０ｍｇ／ｋｇ静注により安楽死せしめる。ポリクローナル抗原を産生する、このまたは他の方法は、Ｅ.Ｈarlow，et al.,編集、抗体：研究マニュアル（1988）（参考によりここに合体する）に開示されている。例えば、下記実施例９参照。全抗体を用いるのに加えて、本発明の方法には、各抗体の結合部分の利用も含まれる。かかる抗体フラグメントは、通常の方法、例えば、Ｊ.Ｇoding,モノクローナル抗体：原理と手法 ,pp.98-118(Ｎ.Ｙ.Ａcademic press 1983)（参考によりここに合体する）記載のタンパク質融解フラグメンテーション法によってつくられる。本発明のワクチンおよび受動免疫剤は、経口投与、非経口投与、例えば皮下、静脈、筋肉、腹腔、鼻腔注入または粘膜への適用、例えば鼻、喉、気管支の粘膜などへの適用がなされる。単独または適当な薬学的担体と共に投与される。形態は固体または液体であり、例えば錠、カプセル、粉末、溶液、懸濁液またはエマルションである。固体の単位用量形態は通常のものである。それには、本発明のタンパク質またはポリペプチドあるいは抗体またはその結合部分、および担体、例えば潤滑剤およびラクトース、スクロースまたはトウモロコシデンプンなどの活性のない充填剤、を含む通常のゼラチンタイプなどのカプセルがある。他の実施態様には、錠剤があり、通常の錠剤用の基剤ラクトース、スクロースまたはトウモロコシデンプンを、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ポテトデンプン、アルギン酸などの崩壊剤およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムなどの潤沢剤と組み合わせて製造される。本発明のタンパク質またはポリペプチド、または本発明の抗体またはその結合部分は、薬学的担体と共に生理的に許容される希釈剤中のこれらの物質の溶液または懸濁液として注射可能な用量で投与され得る。かかる担体には、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントを加えてまたは加えずに、無菌の水剤または油剤がある。油剤としては、鉱物、動物、植物または合成油があり、例えばピーナッツ油、大豆油または鉱物油である。一般に、水、塩類水、水性デキストランおよび関連糖溶液、およびポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどのグリコール類が特に注射用溶液として望ましい液体担体である。エアゾールとしての使用について、溶液または懸濁液中の本発明のタンパク質またはポリペプチド、または本発明の抗体またはその結合部分は、適当な推進剤、例えば、プロパン、ブタン、イソブタンなどの炭化水素推進剤および通常のアジュバントと共に加圧エアゾール容器に包装される。本発明の物質は、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態でも投与される。本発明の他の点において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、結核菌体液の検出のための診断検定法における抗原として用いられる。他方、この菌の検出は、該抗原から生じる抗体およびその結合部分を用いて診断検定法で達成される。かかる技法により下記の組織または体液のサンプル中の結核菌を検出することが可能になる：血液、髄液、喀痰、胸膜液、尿、気管支肺胞洗浄液、リンパ腺、骨髄または他の生検材料。一つの実施態様において、検定系はサンドウィッチ法または競合法である。適当な検定法の例として、酵素結合免疫吸収法、放射免疫検定法、ゲル拡散沈降検定法、免疫拡散検定法、凝集反応検定法、蛍光免疫検定法、タンパク質Ａ免疫検定法または免疫電気泳動法がある。本発明の他の診断上の実施態様において、本発明の単離ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、種々の患者体液中の結核菌の検出のために核酸ハイブリダイゼイション検定法においてプローブとして用いられる。本発明のヌクレオチド配列は、下記のような公知の核酸ハイブリダイゼイション検定法において（これらに限定はされない）使用される。Ｓouthern blots(Ｓouthern，Ｊ.Ｍol.Ｂiol.,98:508 (1975));Ｎorthern blots(Ｔhomas et al.,Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,77 :5201-05(1980));Ｃolony blots(Ｇrunstein et al.,Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ ,72:3961-65(1975))（参考によりここに合体する）。他方、本発明の単離ＤＮＡ分子は、遺伝子増幅検定法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）において用いられる。参照Ｈ.Ａ.Ｅrlich et al.,“ポリメラーゼ連鎖反応についての最近の進歩”,Ｓcience 252:1643-51(1991)（参考によりここに合体する）。より一般的に、結核菌による取り込み現象の分子基礎は、他の物質の哺乳動物細胞への取り込みを効果的にするために用いられる。これは、細胞内取り込みを効果的に行う本発明のタンパク質またはポリペプチド（すなわち、配列番号２および４のアミノ酸に対応するタンパク質またはポリペプチド）を、哺乳動物細胞に取り込みたい物質と併用することにより達成される。この取り込みは、非常に様々な物質、例えば抗生物質、ＤＮＡフラグメント、抗癌剤およびこれらの混合を該細胞に導入するのに利用することができる。抗生物質を直接細胞に導入し得ることは、抗生物質は細胞内の結核菌を殺すことができるので実質的な利点である。かかる取り込みを達成するための１つの方法は、抗生物質で中心体（microsphere）を透浸し、次いで中心体を本発明の細胞内取り込みタンパク質またはポリペプチドでコートする。別法として、抗生物質を運ぶ中心体を用いる代わりに、抗生物質を本発明の細胞内取り込みタンパク質またはプロモーターと化学的に結合せしめることができる。この技法は、細胞内病原菌による広範な疾患の処置に用いられる。結核の処置については、細胞への浸透はよくないが、インビトロ試験で細胞外の結核菌に高い活性を有する多くの抗生物質が本発明の細胞内取り込みタンパク質またはポリペプチドと接合して用いられる。癌の処置において、抗癌剤の細胞内への運送を、本発明の細胞内取り込みタンパク質またはポリペプチドと結合せしめることにより、非常に高めることができる。これは該薬剤の用量低下を可能にし、その毒性の低下につながる。本発明の他の点は、本発明の細胞内取り込みタンパク質またはポリペプチドを遺伝子療法また遺伝子ワクチンにおいて利用することである。治療的または予防的に有用なＤＮＡは、そのチミン残基においてリンカー・アームを通して本発明のタンパク質またポリペプチドと結合する。結果として、遺伝子物質は、細胞に導入されて、遺伝子的欠陥を矯正したり、あるいは免疫原として働く所望の特性また産物を生み出したりする。実施例実施例１．ＨｅＬａ細胞侵襲クローンの調製およびスクリーニング哺乳動物細胞導入をコードする結核菌ＤＮＡ配列を同定するために、組換え侵襲クローンを次のように構築した。結核菌Ｈ３７Ｒａ株（ＡＴＣＣ２５１７７）ゲノムを制限酵素Ｓａｕ３Ａ１およびＥｃｏＲ１で切断し、フラグメントをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１制限部位にリゲートした。組換えベクターをＥ.ｃｏｌｉＥＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に電気穿穴により導入した。Ｒ.Ｒ.Ｉsberg and Ｓ.Ｆalkow，Ｎature 317,262(1987 )（参考によりここに合体する）記載の方法に準じて、ＨｅＬａ細胞侵襲クローンのための組換え株をスクリーニングした。Ｅ.ｃｏｌｉ形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素部位に１５３５塩基挿入体を含有するプラスミド（ｐＺＸ７）を保持し、ＨｅＬａ細胞と密接に関連するスクリーニング法によって見つけ出された。このクローンがＨｅＬａ細胞に入っていることは移行電子顕微鏡により確認された（図１）。図１Ａは、結核菌株Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ２５１７７）に感染したＨｅＬａ細胞を示し、図１Ｂおよび１Ｃは侵襲組換え株Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）を示す。これらの細胞は、図１Ａでは結核菌と共に７２時間、図１Ｂおよび１ＣではＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）と共に７.５時間、インキュベートされた。ＨｅＬａ細胞によるこれらクローンの内部移行は、感染３.５時間後に可視の細胞内生物体を有し、時間依存的であり（図１Ｂ）、いくつかの食作用胞は多種の生物体を含有し（図１Ｃ）、これは細胞内で細菌が増殖していることを示唆した。いくつかの内部移行細菌は、鮮明なＥＴＺに囲まれ、ＨｅＬａ細胞内の結核菌を囲む明確な領域の様子に似ていた（図１Ａ、矢印）。この領域は他の病原細胞内微生物のまわりにしばしば見られるＥＴＺを表しているのか（参照Ｐ.Ｄraper and Ｒ.Ｊ.Ｗ.Ｒ ess,Ｎature 228,860(1970);Ｎ.Ｒastogi,Ｒes.Ｍicrobiol.141,217(1990);Ｔ. Ｙamamoto,Ｍ.Ｎishimura,Ｎ.Ｈarada,Ｔ.Ｉmaeda,Ｉnt.Ｊ.Ｌepr.26,111(1958)、参考によりここに合体する）、調製による加工物なのか、明らかでない。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたは他のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ誘導組換えベクター（ｐＺＮ７）を含有する非病原性株Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅは、７.５時間後にＨｅＬａ細胞との結合を示さなかった。侵襲表現型がクローン結核菌ＤＮＡフラグメントによりコードされたことを示すために、他の病原性Ｅ.ｃｏｌｉ株、特にＨＢ１０１、ＤＨ５αおよびＮＭ５２２をｐＺＸ７で形質転換した。構築体ＨＢ１０１（ｐＺＸ７）、ＤＨ５α（ｐＺＸ７）およびＮＭ５２２（ｐＺＸ７）はＨｅＬａ細胞に侵襲的であった。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）の長い保存におけるｐＺＸ７の自然損失は侵襲表現型の損失と関連している。４種のｐＺＸ７のエクソヌクレアーゼIII単一方向性欠失サブクローンおよびサブクローンＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ（ｐＺＸ７.１）、Ｐｓｔ−Ｉ−ＨｉｎＤＩＩＩ（ｐＺＸ７.２）、およびＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ（［Ｚｘ７.７）をＨｅＬａ細胞結合に用いた。ｐＺＸ７の単一方向性欠失サブクローンは、製造業者の説明書(Ｅrase−a−Ｂase Ｓystem,Ｐromega,Ｍadison,ＷＩ)に従ってエクソヌクレアーゼIIIを用いて生成せしめた。プラスミドｐＺＸ７は、ＢａｍＨＩ− ＥｃｏＲＩＤＮＡ挿入体のＥｃｏＲＩ部位からの上流でＨｉｎＤ IIIおよびｋｐｎＩ制限酵素でもって二重消化されて、ＥｘｏIII消化からそれを保護するために、挿入体近接５'−突出末端、挿入体近接４塩基３'突出を生じせしめる。消化プラスミドをＥｘｏIIIの３００Ｕと３７℃で混合し、３０秒毎ＥｘｏIII消化の２.５μｌ分液をＳ１ヌクレアーゼ含有のチューブに移して、残る単鎖ティルを除去した。Ｓ１ヌクレアーゼを中和によって不活化し、７０℃で１０分間加熱した。ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼを加えて、欠失含有ベクターを円形にするためにリゲートされた鈍い末端をつくった。連絡反応の混合物は、電気穿孔により能力のあるＥ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換するのに用いた。これらの形質転換株はＨｅＬａ細胞単層と共に６時間インキュベートした。この工程の結果を図２に示す。黒棒は結核菌ＤＮＡ配列を、白棒はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列を表す。ｐＺＸ７.３、ｐＺＸ７.４ｏｒｐＺＸ７.５を保持するＥ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ株は、Ｅ.ｃｏｌｉＺＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）と類似したパターンでＨｅＬａ細胞と結合する。一方、他のサブクローンは結合しない。実施例２．ヒト・マクロファージの感染実施例１のＥ.ｃｏｌｉ組換えクローンで感染したマクロファージ単層は、ポリスチレン壁底のグラス・カバー・スリップ上で確認された。これらはマクロファージにつき１０以上の一夜生長菌で１または２時間、最初に感染され、次いでリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）で洗い、さらに１、６または２２時間インキュベートした。培養は３７℃でＰＲＭ１−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）でゲンタマイシン含有の２％ＡＢ加熱不活化ヒト血清（１０μｇ／ｍｌ）でおこなわれた。ゲンタマイシンは細胞外菌を殺すために入れられた。マクロファージ単層は再度洗い、次いで無菌蒸留水に溶かした。溶解液をトリプチカーゼ醤油寒天培地に播き、コロニーを得た。顕微鏡検査のために、マクロファージ単層を１００％メタノールで固定し、１０％ギームサ染色液で染色し、光学顕微鏡または電子顕微鏡で調べた。１時間で感染した単層のみ水洗い、固定、染色をした後、直ちに光学顕微鏡で調べた。マクロファージ溶解物培養および光学顕微鏡の結果は表１に示す。感染マクロファージの％は、カバー・スリップ単層上の１００−２００マクロファージ当たりの感染マクロファージの数から算出した。各Ｅ.ｃｏｌｉ株は、各時点で４−６回調べ、Ｅ.ｃｏｌｉ組換えクローン、対照株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７.３）で感染した細胞の平均％をＳｔｕｄｅｎｔＴ検定で比較した。侵襲組換えＥ.ｃｏｌｉクローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）に３時間（図３Ａ）および２４時間（図３Ｂ）さらしたヒト・マクロファージの薄セクション電子マイクログラフを示す。図３Ｃは、非病原性Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）に２４時間さらしたヒト・マクロファージの薄セクション・マイクログラフを示す。２４時間後、細菌は細胞内部でより多数であり、区画化され、宿主起源の仮定膜の多層に囲まれていた（図３Ｂ）。Ｅ.ｃｏｌｉ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）に感染したマクロファージ内部に２４時間後で細菌は認められなかった（図３Ｃ）。表１は、ＨｅＬａ細胞侵襲Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）、サブクローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ(ｐＺＸ７.３)、および非侵襲ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐ. Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）で感染したヒト・マクロファージ単層細胞の光学顕微鏡および培養研究からの結果を示す。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は細胞培養溶解物のミリリットルにつき測定した。感染１時間後、組換えクローンにより感染した細胞の％（８２±８％）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）により感染した細胞より５倍以上であった（１５±６％、Ｐ＜０.００１）。この結果は、クローン化結核菌ＤＮＡ配列がマクロファージ細胞のバックグランド食細胞活性上の量での細菌取り込みを容易にすることを示唆している。感染２４時間後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にさらしたマクロファージの１２％（±１０％）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）にさらした細胞の６０％が感染した（Ｐ＜０.００１）。表１が表すように、２４時間感染せしめたマクロファージの溶解物の培養は、細胞内Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）株が有望であることを示した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）およびＨｅＬａ細胞侵襲欠失誘導Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７. ３）の能力の比較において、１時間の感染で表１のマクロファージを感染さすために、Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７.３）の侵襲能はＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）よりも４倍大きかったが（Ｐ＜０.００１）、２４時間では、相違は長く現れなかった。このようにＨｅＬａ細胞侵襲に関連したＤＮＡ配列は、マクロファージによる取り込みの増大に寄与し、マクロファージ内で生存を付与する配列は、哺乳動物細胞内導入に必要な配列の下流に位置する。実施例３．相同性解析ＢａｍＨｉ−ＥｃｏＲｉＤＮＡフラグメントはＦ.Ｓanger,et al.,“鎖終末インヒビターを有するＤＮＡ配列”Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.,74:5463-67（参考によりここに合体する）記載の鎖終末法により配列が解析され、１５３５塩基対を有することが分かった［Ｅuropean Ｍolecular Ｂiology Ｌaboratory（ＥＭＢＬ）accession number Ｘ７０９０１］。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｒ７２.０）またはＥＭＢＬ（Ｒ３１.０）のデータベースのいずれのＤＮＡ配列とも相同性を示さなかった。明白な原核プロモーターコンセンサス配列を認め得なかった。結核菌が普通の原核終了コドン配列を使用すると仮定すると、アミノ酸配列相同性を同定できる。１つの有力な開放読み枠の演繹配列のＮＨ₂末端近くの領域は、（ｉ）哺乳動物細胞内導入に関連するＬisteria単球遺伝子によりコードされるタンパク質であるインターナリン（Ａ.Ｂ.Ｈartman,Ｍ.Ｖenkatesan,Ｅ .Ｖ.Ｏaks,Ｊ.Ｍ.Ｂuysse,Ｊ.Ｂacteriol,172,1905(1990)、参考によりここに合体する）の８０残基ＮＨ₂−端末領域と２７％の相同性を、（ii）Ｓhigella の侵襲性プラスミドのＩｐａＨ遺伝子産物（Ｂ.Ｅ.Ａnderson,Ｇ.Ａ.ＭcＤonald, Ｄ.Ｃ.Ｊones,Ｒ.Ｌ.Ｒegnery,Ｉnfect.Ｉmmun.58,2760(1990)（参考によりここに合体する））の１４５残基領域と２０％の相同性を、（iii）受容体仲介エンドサイト−シスをつかさどるコートされた小胞中の受容体にクラスリンを結合せしめる細胞質膜タンパク質であるアダプチン（Ｓ.Ｐonnambalam,Ｍ.Ｓ.Ｒobinso n,Ａ.Ｐ.Ｊackson,Ｌ.Ｐeiper,Ｐ.Ｐarham,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.265,4814(1990)and Ｊ.Ｌ.Ｇoldstein,Ｍ.Ｓ.Ｂrown,Ｒ.Ｇ.Ｗ.Ａnderson,Ｄ.Ｗ.Ｒussell,Ｗ.Ｊ.Ｓ chneider,Ａnnu.Ｒev.Ｃell Ｂiol.1,1(1985)（参考によりここに合体する））の１７６−残基領域と１８％の相同性を有することが分かった。Ｙersinia pseu dotuberculosis の侵襲タンパク質に対して整列するとき、細胞内導入に関連する領域は、侵襲ＣＯＯＨ−端末近くの１００残基領域と１９％類似であった（Ｒ .Ｒ.Ｉsberg,Ｄ.Ｌ.Ｖoorhis,Ｓ.Ｆalkow,Ｃell 50,769(1987)（参考によりここに合体する））これらの平衡整列の機能的意義は不明である。実施例４．５２ｋＤポリペプチドの機能上の解析ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析されたタンパク質フラクションは次のようにして調製された。アンピシリン含有トリプチカーゼ醤油ブロス中（１００μｇ／ｍｌ）の菌の一夜生育液５ｍｌ（光学密度６００で５５０ｎｍでの吸収に調整）を遠心分離で採取した。５ｍＭのＭｇＣｌ₂含有の１０ｍＭドリス−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８.０）１.５ｍｌ中細菌ペレットを超音波処理した。この処理物を２５分間１２,０００ｒｐｍでマイクロ遠心分離器（Ｅppendorf model ５４１５Ｃ）により４℃で遠心分離した。アセトンを新鮮マイクロ遠心分離チューブ中の上澄み液（６０％ｖ／ｖ）６００μｌに加え、混合物を２５分間１４,０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。ペレットを蒸留水２０μｌおよびＬaemmli煮沸緩衝液２０μｌに再懸濁し、５分間沸騰水上で加熱し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。最初の遠心分離後の外膜フラクション含有の細菌片を水１００μｌおよび７.５ｍＭのＭｇＣｌ₂および３％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００含有１５ｍＭトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８. ０）１００μｌに再懸濁し、２５分間１４,０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを水２５μｌおよび煮沸緩衝液２５μｌに再懸濁し、沸騰し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプル分液２０μｌを解析した。アセトンでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（すなわちＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）は、細菌細胞超音波処理物の溶解フラクションを沈降する。ポリペプチドは９％ゲルにおいて分析した（左側）：分子の大きい標準（枠１）、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニング部位の間の非関連結核菌ＤＮＡフラグメント含有ベクター（ｐＺＮ）を有するＥ.ｃｏｌｉＸＬ１− ＢＢｌｕｅ（枠２）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）（枠３）。８％ゲルでの分析（右側）：ｐＺＸ７においてＢａｍＨＩクローニング部位から１２塩基上流に導入された２塩基フレームシフトを有するベクター（ｐＺＸ７.８）含有ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（枠１）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＰＺＸ７）（枠２）。分子の大きさは右下方に示す。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）の可溶タンパク質フラクションに５２−ｋＤポリペプチドを検出した（矢印）。約５０ｋＤのタンパク質をｐＺＸ７.８含有ＸＬ１−Ｂｌｕｅにより発現した。５２−ｋＤタンパク質の発現は組換えＥ.ｃｏｌｉクローンのＨｅＬａ細胞相互作用と常に関連していた。図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）の細菌細胞超音波処理物の可溶性フラクションは、非関連結核菌ＤＮＡフラグメントを保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ誘導ベクター（ｐＺＮ７）を有するＸＬ１−Ｂｌｕｅの可溶性フラクションでは検出されない５２−ｋＤポリペプチドを含むと、結論される。２塩基フレームシフトは、ｐＺＸ７中のＢａｍＨＩクローニング部位から１２塩基上流のＸｂａＩ部位でＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで５' 突出末端が充填された後に鈍い末端連結反応により導入されるものであり、これは、このプラスミド含有Ｅ.ｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅのＨｅＬａ細胞との関連損失をもたらす。このクローンは５２ｋＤタンパク質を発現しないが、低級分子マスの新ポリペプチドが可溶フラクションに検出された。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）の長期保存の後にＨｅＬａ細胞に関連の能力の自然的損失は５２−ｋＤタンパク質の損失を伴った。この５２−ｋＤタンパク質は、クローン化結核菌ＤＮＡフラグメントにより発現された産物のようである。細菌外膜ポリペプチドフラクションにおいて検出できるような相違はなかった。実施例５．結核菌の哺乳細胞内導入を仲介するタンパク質をコードする開放読み枠（ＯＲＦ−１）のサブクローニング配列番号３（すなわちＯＲＦ−１）に対応するヌクレオチド配列をｐＥＴベクター（ＮovagenからのｐＥＴ２３ａ、ｂ、ｃ）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤIII エンドヌクレアーゼ部位にサブクローンした。これは、ＯＲＦ−１フラグメントのＰＣＲ増幅産物をサブクローンして、なされた。ＯＲＦ−１の増幅に用いられたプライマーは次の通りである：ＥｃｏＲＩ−ｐｒｉｍｅｒ：５'−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡ（配列番号７）；ＨｉｎＤＩＩＩ−ｐｒｉｍｅｒ：５'−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＴＣ（配列番号８）。結核菌株Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ２５１７７）からの抽出ＤＮＡを次のＰＣＲ条件を用いて３０サイクル増幅した：変性９４ ℃１分間、プライマーアニーリング５６℃２分間およびプライマー伸長７２℃１分間である。増幅されたＤＮＡは１.８％アガロース・ゲル中で電気泳動により再溶解し、ＵＶ照射で可視化した後、増幅ＤＮＡをＱＩＡＥＸを用いたゲルから、製造書の説明に従って、除去した。ＤＮＡは同じ消化緩衝液中のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩで消化した。ｐＥＴベクターもＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩエンドヌクレアーゼで消化し、１％アガロースに溶解し、線化されたベクターをゲルから除去し、連結反応のためにＰＣＲ−増幅ＯＲＦ−１ＤＮＡフラグメントのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎＤＩＩＩ消化物と混合した。連結反応は次のように行われた。消化ＰＣＲ−増幅ＤＮＡ産物５μｌおよびベクターＤＮＡ消化物３μｌ含有の混合物に、１０ＸＴ４リガーゼ緩衝液（Ｎew Ｅngland ＢioＬabs）１μｌおよびＴ４リガーゼ（１５Ｕ）を加えた。混合物を室温で４時間インキュベートした。連結反応混合物の分取液１.５μｌをＥ.ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に電気穿孔し、このＥ.ｃｏｌｉを３７℃の一夜インキュベーション用のアンピシリン含有（２００μｇ／ｍｌ）寒天平板上でインキュベートした。ｐＥＴ２３構築物（ｐＥＴ２３ａ−ＯＲＦ１、ｐＥＴ２３ｂ−ＯＲＦ１、ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）の各々からの代表的コロニーにつき、別記するようにＨｅＬａ細胞との、その結合を調べた。株は、ＩＰＴＧにより誘発し、またはせずに調べた。実施例６．ＯＲＦ−１により発現されたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分析ＯＲＦ−１によりコードされたタンパク質を発現するために、ｐＥＴ２３組換えＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ.ｃｏｌｉ株を最初にアンピシリン含有トリプチカーゼ醤油ブロス（ＴＳＢ）培地５ｍｌ中で一夜生育せしめた。翌日、サンプル５００ μｌを採取し、アンピシリン含有ＴＳＢ（２００μｇ／ｍｌ）５ｍｌに再懸濁し、３時間インキュベートした。次いでＩＰＴＧ（４０ｍＭ）５０μｌを生育物に加え、さらに２時間３７℃でインキュベートした。細菌懸濁液（Ａｂｓ₆₀₀でＯＤ＝５００）１ｍｌを採取し、ペレットを水５０μｌおよびＬａｅｍｍｌｉ煮沸緩衝液に最懸濁して、５分間沸騰した。沸騰サンプルの分取液１５μｌを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルにかけ、電気泳動で分解した。ＰＥＴベクター含有ＢＬ２１（ＤＥ３）は、これらの実験において対照として同様に処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）により発現された２５−２８ＫＤａの周りの位置するタンパク質を表し、これは他のｐＥＴ２３構築物または対照ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ）株のいずれによっても発現されなかった。ＩＰＴＧによる誘発なしでも、タンパク質のなんらかの発現は明らかであった（図５）。同じ組換え株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）は、ＨｅＬａ細胞との強い結合を示した。このようにＯＲＦ− １の発現産生物はＨｅＬａ細胞結合を付与するのに充分である。実施例７．組換えＯＲＦ−１タンパク質のＮ−端末分析ＩＰＴＧ処置ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）株がＳＤＳ−ＰＡＧＥについて上記したように調製された。７レーンが同じ細菌溶解質で充填され、１レーンが対照のＥ.ｃｏｌｉ溶解質で充填された。電気泳動後、分解タンパク質は、電気ブロッティング器（ＩＤＥＡＳcientific Ｃompany）を用いて、１つのＰＶＤＦ膜（Ｉmmobilon，Ｍillipore）に移された。膜をＣoomassie Ｂlue で２分間着色し、移行タンパク質バンドが見えるようになるまで脱色した。組換えＥ.ｃｏｌｉレーンの２５−２８ＫＤａのタンパク質フラクション（対照のＥ.ｃｏｌｉレーンには存在していない）を切り出し、Ｎ−端末の配列を調べるためにスタンフォード大学のタンパク質・ヌクレオチド研究施設に送った。Ｎ −端末は、ｐＥＴベクターのＴ７標識アミノ酸配列（１−１５位）を、次いでＶａｌ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｓｐ，Ｉｌｅを含み、これはＯＲＦ−１のヌクレオチド配列から演繹されるＮ−末アミノ酸配列であった。実施例８．ビードのＨｅＬａ細胞結合を検査するための組換えタンパク質によるラテックス・ビードのコーティングＯＲＦ−１によりコードされた２５−２８ｋＤａタンパク質の粗調製はＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）から次のように得られた。タンパク質は上記のようにＩＰＴＧ誘発により発現された。誘発後、細菌懸濁液を、１００ｍＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有のトリス緩衝液に最終濃度１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように混合した。リソチームを溶液に最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加え、細胞を室温で２０分間インキュベートした。次いで細胞を５０００ｇ１０分間遠心分離し、上清液を除去した。ペレットを氷に移し、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０.１％デオキシコール酸ナトリウム含有の氷冷５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）５ｍｌ中に再懸濁した。ＭｇＣｌ₂ およびＤＮＡｓｅＩを夫々の最終濃度８ｍＭおよび１０μｇ／ｍｌまで加えた。インキュベーションを氷上で粘性がなくなるまで行った。懸濁液で物質を構成している封入体を１０,０００ｇ１０分、遠心分離で除去した。得たペレットを１％ＮＰ−４０、１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡ含有の５０ｍＭトリス緩衝液５ｍｌ中に再懸濁することにより洗浄し、次いでＮＰ−４０を含有しない同じ緩衝液で洗った。ペレット物質の分取液を組換えタンパク質の存在につきＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。ペレットの残りを、１００ｍＭＫＣｌ、０.１ｍＭＥＤＴＡ、１２５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０％グリセロールおよび０.１％ＮＰ−４０（ＨＥＭＧＮ緩衝液）を含有する２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.６）中の６Ｍグアニジウム−ＨＣＬ（ＧｕＨＣｌ）２ｍｌに溶解した。これはプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭＤＴＴ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、０.１ｍＭＰＭＳＦ、および０.１ｍＭＮａ−メタベスルフィート）を含む。可溶化したタンパク質を２日間以上４℃で６ＭＧｕＨＣｌを欠くＨＥＭＧＮ緩衝液に対する継続透析にかけた。対照として、同じ操作をＥ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ）細胞について行った。タンパク質濃度はＢＡＣプロトコルにより測定した。０.３μｍポリスチレン・ラテックス・ビード（Ｓigma）の１０％水性懸濁液のサンプル２μｌをＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌタンパク質溶液（ｐＨ７.５）１ｍｌに加えた。ビードをタンパク質溶液と共に一夜３７℃で常に振りながらインキュベートし、凝集塊を拡散さすために短い超音波処理を行った。ビード懸濁液１００μｌを２４ウェル組織培養プレートにおける円いガラスのカバースリップ上でＭＥＭ（１０％牛胎児血清含有）中で生育したＨｅＬａ細胞単層に加えた。対照には、ＰＢＳのみ中でインキュベートしたビード、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中でインキュベートしたビードおよび上記の対照Ｅ.ｃｏｌｉ株から調製のタンパク質でコートされたビードが含まれる。ウェルにつきＭＥＭ２ｍｌ中のＨｅＬａ細胞単層は５時間３７℃でインキュベートし、次いでＰＢＳで５回洗い、１００％メタノールで３０分間固定した。細胞は１０％Ｇiemsa で２０分間着色し、光学顕微鏡で調べた。ＨｅＬａ細胞は透過電子顕微鏡で調べるためにも調製した。５時間インキュベーション後のＨｅＬａ細胞単層を２％ＰＢＳ中グルテアルデヒド（ｐＨ７.５）で３時間固定し、次いでこすり落とし、同じグルテアルデヒド緩衝液に再懸濁した。細胞を緩やかにペレットし、ペレットを透過電子顕微鏡のための標準プロトコールによる切片として調製した。一つの結果を図６に示す。実施例９．組換えタンパク質に対するポリクローン・抗血清の作製２５−２８ｋＤａタンパク質を発現するＥ.ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２３ｃ−ＯＲＦ１）の溶解質を多ウェル中１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、タンパク質をゲルから切取した。タンパク質を含むアクリルアミド・ゲルを乳鉢と乳棒で粉砕し、無菌ＰＢＳ（ｐＨ７.５）２ｍｌに再懸濁した。およそのタンパク質濃度をＢＣＡ法により測定した。６カ月令ＮＺＷ雌ウサギの皮下７ −８カ所に１カ所につき約２０μｇの抗原懸濁液を注射した。最初の注射から４週および６週後に同量の抗原を家兎に注射した。最後の注射から２週後に血液から血清を採取した。組換えタンパク質に対するその反応性をウエスタン・ブロッティングにより調べた。免疫抗血清・希釈１：１０,０００はニトロセルロース膜に結合したタンパク質１μｇ以下を検出できた。実施例４の５２ｋＤａタンパク質および実施例７の２３−２８ｋＤａポリペプチドの両方ともこれらの抗体により認識された。実施例１０．ＩＳ６１１０の存在についての解析結核菌株Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ２５１７７）のゲノムＤＮＡ部分的消化体をＳａｕ３ＡＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素でもって調製した。Ｈ３７Ｒａ株は、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，ｅｔａｌ．の米国特許第５,１８３,７３７に記載されているＩＳ６１１０の多重コピーを含有し、かつＩＳ６１１０はＥｃｏＲＩ部位を有していないので、消化体はＩＳ６１１０を含有するいくつかのＤＮＡフラグメントを含むであろう。ＤＮＡフラグメントはベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限部位中にリゲートされ、組換えライブラリーを作製した。組換えベクターはＥ.ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅに電気穿孔された。これらの組換えＥ.ｃｏｌｉ株は、本出願の他の箇所に記載した方法により侵襲クローンのためにスクリーニングされた。ＨｅＬａ細胞を用いた最初のスクリーニングの後、１５Ｅ.ｃｏｌｉコロニーを得た。これらのうち一つのみが継続的にＨｅＬａ細胞と結合を示した。これは前に記載した株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＺＸ７）である。他のコロニーについては、何回も試験したが、ＨｅＬａ細胞との結合は弱いかまたは認められなかった。これらの他の株はＩＳ６１１０の存在につき、次のプライマーを用いて、ＩＳ６１１０内の２４５−ｂｐ領域のＰＣＲ増幅から生成したプローブにより試験した。ＩＮＳ１：５'−ＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣ（配列番号９）およびＩＮＳ２：５'−ＧＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡ（配列番号１０）。いずれもＩＳ６１１０配列を含んでいなかった。さらに、ＨｅＬａ細胞との他のクローンの持続的かつ強力な結合を欠くことは、ｐＺＸ７内に含まれる配列が、哺乳動物細胞内導入をコードするこのゲノム・ライブラリー中のＤＮＡフラグメントにおける唯一の配列であることを示唆している。本発明を説明のために詳細に記載したが、かかる詳細はその目的のためにのみ理解されるべきであり、その変更または別法は、下記の請求項に定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなしに当業者によりなされ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/35 Ｃ０７Ｋ 14/35 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する単離ＤＮＡ分子。２．該ＤＮＡ分子が配列番号１に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１の単離ＤＮＡ分子。３．該ＤＮＡ分子が分子量約５０−５５キロダルトンを有するポリペプチドをコードする、請求項１の単離ＤＮＡ分子。４．該ＤＮＡ分子が哺乳動物細胞に入る能力を結核菌に付与する、請求項１の単離ＤＮＡ分子。５．該ＤＮＡ分子が配列番号３に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項４の単離ＤＮＡ分子。６．該ＤＮＡ分子が分子量約２２−２８キロダルトンを有するポリペプチドをコードする、請求項４の単離ＤＮＡ分子。７．該ＤＮＡ分子がマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号５に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１の単離ＤＮＡ分子。８．哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する請求項１のＤＮＡ分子によってコードされる単離タンパク質またはポリペプチド。９．該ＤＮＡ分子が配列番号１に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項８の単離タンパク質またはポリペプチド。１０．該タンパク質またはポリペプチドが配列番号２に対応するアミノ酸配列を含む、請求項８の単離タンパク質またはポリペプチド。１１．該タンパク質またはポリペプチドが分子量約５０−５５キロダルトンを有する、請求項８の単離タンパク質またはポリペプチド。１２．該ＤＮＡ分子が哺乳動物細胞に入る能力を結核菌に付与する、請求項８の単離タンパク質またはポリペプチド。１３．該ＤＮＡ分子が配列番号３に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１２の単離タンパク質またはポリペプチド。１４．該タンパク質またはポリペプチドが配列番号４に対応するアミノ酸配列を有する、請求項１２の単離タンパク質またはポリペプチド。１５．該タンパク質またはポリペプチドが分子量約２２−２８キロダルトンを有する、請求項１２の単離タンパク質またはポリペプチド。１６．該タンパク質またはポリペプチドが組換え体である、請求項１２の単離タンパク質またはポリペプチド。１７．該タンパク質またはポリペプチドが精製されている、請求項１２の単離タンパク質またはポリペプチド。１８．該タンパク質またはポリペプチドが哺乳動物細胞に入る能力を結核菌に付与する１以上の抗原決定基を有する、請求項１２の単離タンパク質またはポリペプチド。１９．該ＤＮＡ分子がマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号６に対応するアミノ酸配列を有する、請求項８の単離タンパク質またはポリペプチド。２０．請求項８の単離タンパク質またはポリペプチドの効果量を哺乳動物に投与することを含む、結核菌感染に対して哺乳動物を免疫する方法。２１．該投与が経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または鼻内である、請求項２０の方法。２２．哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する請求項１の異型ＤＮＡを挿入し発現ベクターを含む、組換えＤＮＡ発現系。２３．該異型ＤＮＡが哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号１に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２２の組換えＤＮＡ発現系。２４．該異型ベクターが哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号３に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２２の組換えＤＮＡ発現系。２５．該異型ベクターがマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号５に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２２の組換えＤＮＡ発現系。２６．該異型ＤＮＡが該ベクター中に適当な方向および正しい読み枠でもって挿入される、請求項２２の組換えＤＮＡ発現系。２７．請求項１の異型ＤＮＡを合体する宿主細胞。２８．該異型ＤＮＡが哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号１に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２７の宿主細胞。２９．該異型ベクターが哺乳動物細胞に入る能力を結核菌に付与し、かつ配列番号３に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２７の宿主細胞。３０．該異型ベクターがマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与し、かつ配列番号５に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２７の宿主細胞。３１．該異型ＤＮＡが発現ベクターを含む組換えＤＮＡ発現系に挿入される、請求項２７の宿主。３２．請求項８の単離タンパク質またはポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、結核菌による哺乳動物の感染および疾患を予防するワクチン。３３．該タンパク質またはポリペプチドが精製されている、請求項３２のワクチン。３４．請求項３２のワクチンの効果量を哺乳動物に投与することを含む結核菌による感染に対して哺乳動物を免疫する方法。３５．該投与が経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または鼻内である、請求項３４の方法。３６．請求項８のタンパク質またはポリペプチドに対する単離抗体またはその結合部分。３７．該抗体がモノクローナルまたはポリクローナルである、請求項３６の単離抗体またはその結合部分。３８．該抗体が哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する遺伝子フラグメントによりコードされる該タンパク質またはポリペプチドの抗原決定基に特異的である、請求項３６の単離抗体またはその結合部分。３９．請求項３６の該抗体またはその結合部分の効果量を結核菌に感染した哺乳動物に投与することよりなる、結核菌感染哺乳動物を受動免疫する方法。４０．該投与が経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または鼻内である、請求項３９の方法。４１．請求項３６の単離抗体またはその結合部分および薬学的に許容される担体を含む、結核菌感染哺乳動物を受動免疫するための組成物。４２．該抗体がモノクローナルまたはポリクローナルである、請求項４１の組成物。４３．該抗体が哺乳動物細胞に入る能力および／またはマクロファージ内で生存する能力を結核菌に付与する遺伝子フラグメントによりコードされる該タンパク質またはポリペプチドの抗原決定基に特異的である、請求項４１の組成物。４４．請求項４１の該組成物の効果量を結核菌に感染した哺乳動物に投与することを含む、結核菌感染哺乳動物を受動免疫する方法。４５．該投与が経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または鼻内である、請求項４４の方法。４６．請求項８のタンパク質またはポリペプチドを抗原として準備し；該抗原をサンプルと接触せしめ；検定系を用いて結核菌がサンプル中に存在することを表す反応を検出することを含む、組織または体液のサンプル中の結核菌を検定する方法。４７．検定系が、酵素結合免疫吸収法、放射免疫検定法、ゲル拡散沈降反応法、免疫拡散検定法、凝集反応検定法、蛍光免疫検定法、タンパク質Ａ免疫検定法および免疫電気泳動法からなる群より選ばれる、請求項４６の方法。４８．請求項３６の抗体またはその結合部分を抗原として準備し；該抗体またはその結合部分をサンプルと接触せしめ；検定系を用いて結核菌がサンプル中に存在することを表す反応を検出することを含む、組織または体液のサンプル中の結核菌を検定する方法。４９．検定系が、酵素結合免疫吸収法、放射免疫検定法、ゲル拡散沈降反応法、免疫拡散検定法、凝集反応検定法、蛍光免疫検定法、タンパク質Ａ免疫検定法および免疫電気泳動法からなる群より選ばれる、請求項４８の方法。５０．請求項１のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を核酸ハイブリダイゼーション検定のプローブとして準備し；該プローブをサンプルと接触せしめ；結核菌がサンプル中に存在することを表す反応を検出することを含む、組織または体液のサンプル中の結核菌を検定する方法。５１．請求項１のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を遺伝子増幅検定方法のプローブとして準備し；該プローブをサンプルと接触せしめ；結核菌がサンプル中に存在することを表す反応を検出することを含む、組織または体液サンプル中の結核菌を検定する方法。５２．哺乳動物細胞により取り込むための物質および；請求項８のタンパク質またはポリペプチド（該タンパク質は該物質と結合している）からなる哺乳動物細胞への物質の取り込みのための産物。５３．該タンパク質またはポリペプチドが分子量約５０−５５キロダルトンを有する、請求項５２の産物。５４．該タンパク質またはポリペプチドが配列番号２に対応するアミノ酸配列を有する、請求項５３の産物。５５．該タンパク質またはポリペプチドが分子量２４−２８キロダルトンを有する、請求項５２の産物。５６．該タンパク質またはポリペプチドが配列番号４に対応するアミノ酸配列を有する、請求項５５の産物。５７．該タンパク質またはポリペプチドが精製されている、請求項５５の産物。５８．該物質が抗生物質、ＤＮＡフラグメント、抗癌剤およびその混合物からなる群より選ばれる、請求項５５の産物。５９．物質を哺乳動物細胞に請求項８のタンパク質またはポリペプチドでもって導くことを含む、細胞内取り込み方法。６０．該タンパク質またはポリペプチドが分子量約５０−５５キロダルトンを有する、請求項５９の産物。６１．該タンパク質またはポリペプチドが配列番号２に対応するアミノ酸配列を有する、請求項５９の産物。６２．該タンパク質またはポリペプチドが分子量２４−２８キロダルトンを有する、請求項５９の産物。６３．該タンパク質またはポリペプチドが配列番号４に対応するアミノ酸配列を有する、請求項５９の産物。６４．該タンパク質またはポリペプチドが精製されている、請求項５９の産物。６５．該物質が抗生物質、ＤＮＡフラグメント、抗癌剤およびその混合物からなる群より選ばれる、請求項６２の方法。６６．哺乳動物細胞がマクロファージである、請求項６２の方法。６７．該方法が細胞性免疫を誘発する、請求項６６の方法。６８．哺乳動物細胞により取り込むための物質および；請求項１２のタンパク質またはポリペプチド（該タンパク質は該物質と結合している）からなる哺乳動物細胞への物質の取り込みのための産物。６９．物質を哺乳動物細胞に請求項１２のタンパク質またはポリペプチドでもって導くことを含む、細胞内取り込み方法。