JPH11500315A

JPH11500315A - キメラアデノウイルスファイバータンパク質およびその使用方法

Info

Publication number: JPH11500315A
Application number: JP8525732A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ウィッカム、トーマス; ファルク−ペダーセン、エリック; ダヴリュー．ロエルヴィンク、ペトラス; ティー．ブルーダー、ジョセフ; ゴール、ジェイソン; コウヴェスディ、イムリ
Original assignee: ジェンベク、インコーポレイティッド; コーネルリサーチファウンデーション、インコーポレイティッド
Priority date: 1995-02-21
Filing date: 1996-02-13
Publication date: 1999-01-12
Also published as: DE69637545D1; EP0811069A1; CA2213343C; US20030166286A1; AU4980496A; US6576456B2; US20020099024A1; CA2213343A1; AU698254B2; EP0811069B1; WO1996026281A1; US5770442A; ATE397075T1

Abstract

(57)【要約】キメラファイバータンパク質および治療遺伝しを含む組換えアデノウイルス、このようなアデノウイルスの使用を含む遺伝子治療方法およびこのような組換えアデノウイルスを生成するためのアデノウイルス運搬ベクターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】キメラアデノウイルスファイバータンパク質およびその使用方法発明の属する技術分野本発明はキメラアデノウイルスファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスおよび遺伝子治療におけるキメラアデノウイルスファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスの使用に関する。発明の背景アデノウイルスは、２つの属、すなわち、マストアデノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられるアデノウイルス科に属する。アデノウイルスは、エンベロープのない、直径６５〜８０ｎｍの正二十面体である（Horne ら，J ．Mol .Biol., 1, 84-86(1959)）。キャプシドは２５２個のキャプソマー（そのうちの２４０個はヘキソンであり、１２個がペントンである）より構成される（Ginsbe rgら，Virology，28，782-783(1966)）。ヘキソンおよびペントンは３つの異なるウイルスポリペプチドに由来する（Maizelら，Virology，36，115-125(1968); Weber ら，Virology，76，709-724(1977)）。ヘキソンはそれぞれ９６７のアミノ酸からなる３つの同一のポリペプチド、すなわち、ポリペプチド11を含む（Ro berts ら，Science, 232, 1148-1151（1986））。ペントンはキャプシドに結合したペントンベースと、ペントンベースに非共有結合し且つそこから突き出したファイバーを含む。ファイバータンパク質はそれぞれ５８２のアミノ酸からなる３つの同一のポリペプチド、すなわち、ポリペプチドIVを含む。Ａｄ２ベントンベースタンパク質は、それぞれ５７１のアミノ酸からなる５つの同一のタンパクサブユニット、すなわち、ポリペプチドIII より構成される８×９ｎｍの環状の複合体である（Boudinら，Virology，92，125-138(1979)）。タンパク質IX，VI およびIIIaもまた、アデノウイルスコート中に存在し、ウイルスキャプシドを安定化させると考えられている（Stewart ら，Cell，67，145-154(1991); Stew art ら，EMBO J.，12(7)，2589-2599(1993)）。一旦細胞に接着すると、アデノウイルスは受容体を介して細胞のクラスリンで被覆されたエンドサイトーシス小胞へと内部移行される（Svenssonら，J ．Virol .，51 ，687-694(1984); Chardonnetら，Virology，40，462-477(1970)）。細胞に侵入するビリオンは、多くのウイルス構造タンパク質の殻を脱ぎ捨てながら段階的に分解される（Greberら，Cell，75，477-486(1993)）。脱被覆過程の間、ウイルス粒子はｐＨ依存的なメカニズムによって細胞のエンドソームの破壊を引き起こすが（Fitzgeraldら，Cell，32，607-617(1983)）、これについてはまだあまり理解されていない。次いで、ウイルス粒子は細胞の核孔複合体へと輸送され（Dales ら，Virology，56，465-483(1973)）、そこでウイルスゲノムが核に侵入し、そうして感染を開始する。アデノウイルスは２つの別個の細胞受容体を使用するが、効率よく細胞に接着して感染するには、その両方が存在しなければならない（Wickham ら，Cell，73 ，309-319(1993)）。まず、Ａｄ２ファイバータンパク質が、今のところまだ同定されていない受容体に結合することによって、ウイルスを細胞に接着させる。次いで、ペントンベースがα_Vインテグリンに結合する。インテグリンは細胞外マトリックス分子であるフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよびコラーゲン、並びに他の分子への細胞の接着を媒介するヘテロダイマーの細胞表面受容体のファミリーであり（Hynes，Cell，69，11-25(1992)）、カルシウム流動化作用、タンパク質のリン酸化および細胞骨格の相互作用を含む細胞シグナル伝達過程に重要な役割を果たしている（Hynes，上述）。ファイバータンパク質はテール（tail）、シャフト(shaft)およびノブ（knob ）からなる三量体である(Devauxら，J ．Molec．Biol., 215, 567-588(1990))。ファイバーシャフト領域は、２つの交互にあるｂ鎖およびｂベンドを形成すると信じられている１５アミノ酸モチーフの繰り返しより構成される（Green ら，EM BO J., 2, 1357-1365(1983)）。ファイバーシャフト領域の全長および１５アミノ酸繰り返し配列（repeat）の数はアデノウイルスの血清型間で異なる。例えば、Ａｄ２ファイバーシャフトは長さ３７ｎｍで２２個の繰り返しを含むが、一方、Ａｄ３ファイバーは長さ１１ｎｍで６個の繰り返しを含む。ファイバータンパク質の受容体結合ドメインは該タンパク質の最後の２００アミノ酸によってコードされるノブ領域に局在する（Henry ら，J ．of Virology，68(8), 5239-5246 (1984)）。三量体化に必要な領域もまた該タンパク質のノブ領域に位置している（Henry ら(1994)，上述）。最後の４０アミノ酸を欠く欠失変異体は三量体化せず、またペントンベースに結合しない（Novelli ら，Virology，185 ，365-376( 1991)）。したがって、ペントンベースの結合にはファイバータンパク質の三量体化が必要である。細胞質で合成された後、ウイルス粒子を形成するために該タンパク質を核に方向づける核局在化シグナルは該タンパク質のＮ末端領域に位置する（Novelli ら(1991)，上述）。ヘキソンとともに、ファイバーはウイルスの主要な抗原決定基であり、またウイルスの血清型特異性を決定する（Watsonら，J ．Gen．Virol. ，69，525-535(1988)）。ファイバータンパク質は単一のＮ−アセチルグルコサミン残基でグリコシル化されているが、グリコシル化の機能的意義は未だ不明のままである(Caillet-Boudin ら，Eur.J.Biochem.，184, 205-211 (1989))。血清型の異なるアデノウイルスから１０を越えるファイバータンパク質の配列が決定されているが、他のアデノウイルスタンパク質におけるよりも配列の多様性が大きいことが明らかになっているにすぎない。例えば、非常に近縁なＡｄ２とＡｄ５血清型由来のファイバータンパク質のノブ領域はアミノ酸レベルで６３％しか類似していないのに対し(Chroboczek ら，Virology，186, 280-285(1992) 、それらのペントンベース配列は９９％同一である。しかしながら、Ａｄ２およびＡｄ５ファイバータンパク質は、細胞受容体への結合をお互いに交叉、妨害するので、どちらも同じ細胞受容体に結合するらしい。対照的に、Ａｄ２とＡｄ３ファイバーとは２０％しか同一でなく(Signas ら，J ．of Virology，53，672-67 8(1985))、それぞれお互いの結合を交叉妨害できないので(Deferら，J ．of Viro logy ，64(8)，3661-3673(1990)）、おそらく異なる受容体に結合するのであろう。Ａｄ３ファイバーはその受容体としてシアリル酸を利用するが、Ａｄ２ファイバーはこれを利用しない。細胞をノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸塩で前処理するとＡｄ３は結合しなくなるが、Ａｄ２はそうはならない。また、シアリル酸の可溶性類縁体はＡｄ３の結合を妨害するが、Ａｄ２の結合は妨害しない。しかしながら、Ａｄ２およびＡｄ３ファイバー遺伝子の配列を比較すると際だって保存された領域があることがわかる。これらの領域のほとんどは他のヒトアデノウイルスのファイバー遺伝子においても保存されている。非ヒトアデノウイルスファイバー遺伝子はヒト血清型とは相同性は低いが、それでも三量体化する。非ヒト血清型が使用する受容体は知られていない。１またはそれ以上の組換え遺伝子を、治療を必要とする罹病細胞または組織に細胞をターゲッティングして送達するのに、組換えアデノウイルスベクターが用いられている。このようなベクターは、アデノウイルスタンパク質を発現するために宿主細胞の増殖を必要としないという利点により特徴づけられ(Horwitzら，In Virology, Raven Press，New York，vol．2，pp．1679-1721(1990); および Berkner, BioTechniques，6, 616(1988))、また、もしも体細胞遺伝子治療の標的組織が肺であれば、これらのベクターは通常、気道上皮の活動に影響を与えるというさらなる利点を有する(Straus，In Adenoviruses，Plenan Press，New Yo rk，pp．451-496(1984))。ヒト遺伝子治療のための、可能性のあるベクターとしてのアデノウイルスの他の利点は以下の通りである： (i)組換えがまれである；（ii）ヒトのアデノウイルス感染はありふれているにもかかわらず、アデノウイルス感染とヒト悪性腫瘍との関連性は知られていない；(iii)アデノウイルスゲノム（それは直鎖状の二本鎖ＤＮＡであるが）はかなりサイズが変動する外来遺伝子を収容するのに操作できる；（iv）アデノウイルスベクターは細胞の染色体中にそのＤＮＡを挿入しないので、その効果は永久的ではなく、おそらく細胞の通常の機能を妨げることはない；(v)アデノウイルスは脳や肺の細胞のような非分裂細胞または最終分化した細胞に感染し得る；および (vi)本質的な特徴として複製能力を有する生のアデノウイルスが、ヒトワクチンとして安全に使用されている(Horwitzら（1990），上述；Berkner ら(1988)，上述；Strausら（1984），上述；Chanock ら，JAMA，195, 151(1966);Haj-Ahmadら，J ．Virol., 57，267(1986)；およびBallayら，EMBO，4, 3861(1985))。アデノウイルスを介した遺伝子治療の欠点は、ベクター投与から２週間後には遺伝子発現の著しい減少が観察されることである。多くの治療上の適用において、発現の減少が起こるとそれを克服するためにウイルスベクターの再投与が必要となる。しかしながら、ウイルスベクターの投与後、ファイバーおよびヘキソンタンパク質の両方に対する中和抗体が生じる(Wohlfart，J ．Virology，62, 2321 -2328(1988); Wohlfart ら，J ．Virology, 56，896-903(1985))。この抗体はウイルスに応答し、それからウイルスベクターの効果的な再投与を妨げるかもしれない。したがって、このような中和抗体を避けることができ、遺伝子治療の状況においてくり返しアデノウイルスベクターを投与することができる組換えアデノウイルスベクターは、現在の遺伝子治療の方法論において意義深い進歩を意味するだろう。遺伝子治療において組換えアデノウイルスを使用することのもう１つの欠点は、治療的処置を必要とする細胞だけでなく、アデノウイルスが細胞に接着し感染するのに使用する前述の２つの受容体を発現するすべての細胞が、投与される遺伝子を内部に移行させることである。同様に、リンパ球のようにα_Vインテグリンアデノウイルス受容体を欠く細胞ではアデノウイルスの取り込みが損なわれて (Silver ら，Virology，165, 377-387(1988); Horvathら，J ．of Virology，62( 1), 341-345(1988))、アデノウイルスを介した遺伝子送達をたやすく受けない。したがって、特定の細胞または組織へのアデノウイルスの侵入を制限すること、および／またはアデノウイルスを介した遺伝子治療に従順な細胞の範囲を拡大することは現在の技術を越える意義ある進歩となるであろう。ターゲッティングされたアデノウイルス遺伝子の送達は、遺伝子治療に従順な細胞を拡大し、標的細胞で遺伝子を発現させるために必要なアデノウイルスベクターの量を減少させ、また、炎症や正常な健康細胞のトランスフェクションのようなアデノウイルス投与量の増加に伴う副作用や合併症を減少させるはずである。アデノウイルスのファイバータンパク質を抗体で立体的に妨害したり、ウイルス粒子に組織特異的抗体を化学的に結合させたりすることにより、特定の細胞へウイルスをターゲッティングする試みがなされてきている(Cotton ら，Proc ．Na tl．Acad．Sci．USA ，89，6094-6098(1992))。この研究方法はターゲッティングされた遺伝子送達の可能性を実証したが、この方法の複雑さと再現性は臨床試験への応用を妨げる重大な障害となっている。ウイルスをこれらの方法によりターゲッティングする際にこれまで直面した困難さとしては、必要とされる合成方法、すなわち、ウイルス粒子の精製に続いてウイルス粒子中に大きな変化をなす方法がある。このような変化にはポリリジン、受容体リガンドおよび抗体のような巨大分子をウイルスに共有結合させる付加的工程がいる(Cotten(1992)，上述；W agnerら，PNAS USA，89，6099-6103(1992))。ターゲッティングされる粒子複合体は構造的に均一でなく、その効率は使用されるウイルス粒子、連結する分子およびターゲッティングさせる分子の相対比に鋭敏に反応する。本発明は組換えアデノウイルス遺伝子治療の前記した問題点の少なくともいくつかを克服せんとするものである。本発明の目的は、繰り返し投与する際の中和抗体を避けることができる組換えアデノウイルスベクターを提供し、それによって治療上有効なレベルでの組換え遺伝子の発現を維持することである。本発明の別の目的は、選ばれた細胞／組織に遺伝子治療をターゲッティングするための細胞特異的／組織特異的組換えアデノウイルスを提供し、それによって投与される組換えアデノウイルスベクターの量およびあらゆる副作用／合併症を減少させることである。本発明のさらなる目的は、遺伝子発現のレベルでウイルス粒子を修飾する手段を提供し、以てウイルス粒子が慣用の技術により精製できるようにすることである。本発明の別の目的は、ソラレン不活化や付加的分子のウイルスへの共有結合を可能にする分子のウイルスへの付加といったウイルス粒子の付加的化学修飾を必要とすることなく、このような均一なアデノウイルスを使用することを含む遺伝子治療方法を提供することである。本発明のこれらの、そして他の目的および本発明の利点、並びに本発明の付加的な特徴は、後記の詳細な説明から明確になるであろう。発明の簡単な要約本発明は、非天然のアミノ酸配列の導入によって天然（野生型）のファイバータンパク質とは異なるキメラファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスを提供する。非天然のアミノ酸配列は、受容体や二重または多重特異的タンパク質（それは該非天然アミノ酸配列および標的受容体との結合に特異的である）のようなタンパク質との間の直接的な結合を容易にすることで、アデノウイルスが該タンパク質、すなわち受容体または二重／多重特異的タンパク質にターゲッティングされるようにする。あるいは、非天然のアミノ酸配列はキメラファイバータンパク質のタンパク質分解的除去を促進して、ペントンベースのような別のアデノウイルスコートタンパク質によるアデノウイルスのターゲッティングを可能にする。本発明はまた、数ある中で、キメラファイバータンパク質を生成するための組換えファイバー遺伝子配列を含有するアデノウイルス運搬ベクター、および所定の受容体または二重／多重特異的タンパク質に特異的で且つ治療用遺伝子を含有するタンパク質特異的組換えアデノウイルスの遺伝子治療における使用方法を提供する。図面の簡単な説明図１はペントン複合体の図である。図２はベクターpGBS.59-100 の部分的な制限地図である。図３はベクターp193 Ad5 Nde I/Sal I の部分的な制限地図である。図４はベクターpAcSG2の部分的な制限地図である。図５はベクターp193 Ad5 FC(F-)の部分的な制限地図である。図６はベクターp193 FC(F2)の部分的な制限地図である。図７はベクターpGBS.59-100(F2)の部分的な制限地図である。図８はベクターpAcSG2（F2）の部分的な制限地図である。図９はベクターp193 FC(F3)の部分的な制限地図である。図１０はベクターpGBS.59-100(F3)の部分的な制限地図である。図１１はベクターpAcSG2（F3）の部分的な制限地図である。図１２はベクターp193 FC（HSF:RGD）の部分的な制限地図である。図１３はベクターpGBS.59-100（HSF:RGD）の部分的な制限地図である。図１４はベクターpAcSG2(HSF:RGD)の部分的な制限地図である。図１５はベクターpAd70-100dlE3.fiber7の構築図である。発明の詳細な説明本発明は、とりわけ、キメラファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスを提供する。該キメラファイバータンパク質は、天然（生来）のファイバーアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに非天然のアミノ酸配列を含み、該非天然アミノ酸配列により、アデノウイルスはタンパク質、例えば、天然のファイバーが結合する受容体以外のここで「標的受容体」と称する受容体、あるいは抗体もしくはその断片（例えば該非天然アミノ酸配列および標的受容体に対する結合特異性を掛るドメイン）のような二重／多重特異的タンパク質、に結合できるようになる。天然またはキメラファイバータンパク質の三量体化を可能にする天然のファイバーアミノ酸配列がない場合は、該非天然アミノ酸配列はキメラファイバータンパク質の三量体化を可能にする１またはそれ以上の配列を含み、それらは前記の異なるタンパク質、例えば標的受容体または二重もしくは多重特異的タンパク質に特異性を有する配列のすぐ隣りにないことが好ましい。あるいは、キメラファイバータンパク質は、天然のファイバーアミノ酸配列に加えて、あるいはそれのかわりに、プロテアーゼによって認識、切断され、該キメラファイバータンパク質が効果的に除去されて、それによってペントンベースのような別のアデノウイルスコートタンパク質によるアデノウイルスのターゲッティングを可能にする非天然のアミノ酸配列を含む。「非天然のアミノ酸配列」とは、既知のアデノウイルス血清型の天然ファイバーにおいて見出されておらず、しかも遺伝子発現のレベルでファイバータンパク質に導入されるあらゆるアミノ酸配列を意味する。「非天然のアミノ酸配列」には、キメラファイバータンパク質を有するアデノウイルス血清型以外のアデノウイルス血清型由来のアミノ酸配列も含まれる（例えば、Ａｄ５キメラファイバータンパク質中で、またはＡｄ５ファイバータンパク質の代わりに発現したＡｄ３ファイバーアミノ酸配列またはＡｄ３ファイバー全体はそれぞれ「非天然のアミノ酸配列」である）。「タンパク質特異的アミノ酸配列」とは、別のタンパク質またはその断片が特異的に結合するタンパク質、タンパク質のドメインまたはペプチドをコードするあらゆる非天然のアミノ酸配列を意味し、標的受容体または標的受容体のクラス、好ましくは細胞特異的もしくは組織特異的受容体に直接結合する能力をキメラファイバーに与えるアミノ酸配列、および抗体もしくはその断片、例えば標的受容体に結合するドメインのような二重または多重特異的タンパク質に直接結合する能力をキメラファイバーに与えるアミノ酸配列を含むことを意味する。「受容体」とは、ホルモン、抗体および酵素のような生物学的に活性な物質に対して特異的親和性を有する膜結合型または可溶性タンパク質を含むタンパク質を意味する。「キメラファイバータンパク質」とは、タンパク質に結合する配列を含む天然のファイバーアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、タンパク質に結合する配列またはプロテアーゼを認識する配列のいずれかを含む非天然のアミノ酸配列を含むファイバータンパク質を意味する。「キメラファイバータンパク質」には、それが発現するアデノウイルス血清型とは異なる血清型のファイバータンパク質も含まれるものとする。すなわちこの場合、天然のファイバー配列全体が非天然のファイバー配列全体で置換される。タンパク質特異的アミノ酸配列をキメラファイバー分子に組み込むことにより、化学的またはそれ以外の結合で二重または多重特異的タンパク質を作る２またはそれ以上の別々のタンパク質を通してターゲッティングすることができる。二重または多重特異的タンパク質の１つの成分がファイバーキメラに結合する。二重または多重特異的タンパク質の第二の成分またはさらなる成分が１つまたはそれ以上のさらなる標的受容体を認識する。例えば、二重または多重特異的タンパク質として、ひとつのドメインがキメラファイバータンパク質上のエピトープを特異的に結合させ、もう一方のドメインが標的受容体を特異的に結合させる二重特異的な多鎖または一本鎖抗体(Cook ら，J ．Immunol．Methods，171，227-237(19 94); Spooner ら，Human Pathol. ，25, 606-614(1994))が挙げられる。二重特異的抗体は、該二重特異的抗体の標的受容体特異的ドメインが標的受容体との結合に利用できる状態で、組換えアデノウイルス中のキメラフアイバータンパク質に結合する。好ましくは、天然のファイバータンパク質全体またはファイバータンパク質の天然の受容体結合配列は、ＤＮＡレベルで非天然のタンパク質特異的アミノ酸結合配列に置換されている。あるいは、ファイバー遺伝子中の天然の受容体結合配列が、例えば、挿入突然変異誘発などにより配列を変異させることによってＤＮＡレベルで不活性化されているか、アデノウイルスファイバ−遺伝子配列の中に、またはその隣りにＤＮＡ配列を挿入することなどによって、ファイバ−タンパク質中で立体配座的に接近不能にされている。ここで「遺伝子配列」とは完全なファイバー遺伝子配列はもちろん、機能的なファイバータンパク質として発現させられ得るあらゆるより小さな遺伝子配列にも適用される。挿入突然変異を誘発するには、キメラファイバータンパク質中で天然受容体結合配列が立体配座的に受容体に接近不能で結合できないように天然受容体結合配列をコードする遺伝子配列をファイバー遺伝子配列内で移動させるために、該ＤＮＡ配列を天然受容体結合配列をコードする遺伝子配列の近くに挿入することが好ましい。後者の場合、ファイバータンパク質中で天然受容体結合配列が立体配座的に接近できないようにする挿入非天然遺伝子配列は、標的受容体または二重もしくは多重特異的タンバク質に特異性を有するものであることが好ましい。このような組換えアデノウイルスは、例えば、インビトロまたはインビボでの受容体結合、アデノウイルスの接着およびアデノウイルスの感染を研究するのに用いることができる。本発明の好ましい態様において、上記組換えアデノウイルスはさらにウイルスが接着した細胞またはウイルスが内部移行した細胞で発現し得る１つまたはそれ以上の遺伝子を含み、好ましくは治療上利用可能なもの、例えば矯正ＤＮＡ、すなわち欠損するか損なわれた機能ををコードするＤＮＡ、または、例えば細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするＤＮＡのような慎重な殺傷剤、または、リボザイムやアンチセンス分子をコードするＤＮＡである。したがって、「治療遺伝子」なる術語の使用は、これら、並びに遺伝子治療としてより一般的に言われ、当業者に知られている他のいかなる態様をも包含する。該組換えアデノウイルスは遺伝子治療、またはインビトロもしくはインビボでの所定の細胞または組織における遺伝子発現の効果の研究に使用することができる。キメラファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスおよびさらに特定の細胞中で発現し得る１つまたはそれ以上の遺伝子を含む粗換えアデノウイルスは、本発明にしたがって、ウイルス運搬ベクター、好ましくはアデノウイルス運澱ベクターを使用することにより生成することができる。ウイルス運搬ベクター、好ましくはアデノウイルス運搬ベクターはキメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列を含有する。該キメラファイバー遺伝子配列は、欠失された受容体結合配列をコードする天然のファイバー遺伝子配列の代わりに、あるいは上記のように変異するか、発現したキメラファイバータンパク質中で立体配座的に接近不能になった天然の受容体結合配列に加えて、非天然の遺伝子配列を含む。該非天然配列は、上記のようにアデノウイルスをタンパク質、例えば受容体または二重もしくは多重特異的タンパク質へ特異的に結合させ、天然の三量体化配列を欠く場合はキメラタンパク質を三量体化させ得る配列を含む。あるいは、該非天然配列は異なる血清型のアデノウイルス由来のファイバー配列全体を含み、所定のアデノウイルス上の天然のファイバーの代わりに、あるいはそれとともに発現する。言い換えれば、所定のキメラ血清型上のすべてのファイバーまたはいくつかのファイバーは天然の血清型のものであり、その他は非天然の血清型のものである。別の選択肢は、非天然配列がプロテアーゼによって切断される１つまたはそれ以上のプロテアーゼ認識配列を含み、それによってキメラファイバーが効果的に除去されてペントンベースや他のコートタンパク質（ペントン複合体の図として図１を参照）により組換えアデノウイルスがターゲッティングされるというものである。アデノウイルスの４１を越えるヒト血清型のファイバー分子間の高度な構造的類似性に基づいて、ヒトまたは非ヒトアデノウイルスのいかなる血清型もファイバー遺伝子の源として使用し得るものと予測される。しかしながら、ファイバー遺伝子が配列決定されている血清型のものを用いることが好ましい。制限部位がファイバー遺伝子配列に導入される。好ましくは、このような制限部位はＰＣＲ変異誘発のような好適な方法によりファイバー遺伝子配列の天然の受容体結合配列の中または隣りに導入される。これらの制限部位はファイバー遺伝子にすでに存在するものでないことが好ましい。このような部位は、配列の変化などにより所定のアデノウイルスゲノム中の天然の受容体結合配列をコードするＤＮＡ配列を除去または不活性化したり、あるいは天然の受容体結合配列を立体配座的に接近不能にし、それによってファイバーが通常結合する受容体に結合する能力を変化させるかもしくは排除する。欠失した天然の受容体結合配列が、異なるＤＮＡ配列、好ましくは、１つの受容体（好ましくは細胞特異的または組織特異的受容体）または受容体のクラスのようなタンパク質、あるいは、例えば所定の受容体に特異性を有する二重または多重特異的タンパク質への結合特異性をコードするＤＮＡ配列で置換されるか、または変異したかもしくは立体配座的に接近不能になった受容体結合配列が該ＤＮＡ配列を伴い得る。あるアデノウイルス血清型のファイバー遺伝子中のユニークな制限部位は、該ファイバー遺伝子の領域を別の血清型由来のファイバー遺伝子の相同領域で置換するのに用いることができる。このような制限部位は天然のファイバー配列全体を非天然のファイバー配列で置換するのにさえ用いることができる。好ましくはアデノウイルスベクターはいかなる適切な非天然のアミノ酸配列も迅速に挿入され得るものである。例えば、p193 FC（F^-）中のユニークなNde I およびBam HI制限部位が他のファイバー血清型遺伝子由来の受容体結合配列を挿入するのに用いることができる。あるいは、ＰＣＲを通じてユニークな制限部位を必要とすることなく配列をファイバー遺伝子配列中に挿入することもできる。組換えアデノウイルスは組換え配列とウイルスＤＮＡとのライゲーションによって、または相同組換えによって創製できるので、アデノウイルスベクターは、（１）実施例１に記載されるように、ベクター断片と残りのウイルスゲノムの相補的断片とを連結できるユニークな制限部位か、（２）実施例１に記載されるように、ウイルスＤＮＡと効率よく相同組換えできるタンパク質特異的配列のいずれかの側にある適当な長さのＤＮＡのどちらかを有していることが好ましい。好適なアデノウイルスベクターは、そのようなベクターの部分的な制限地図である図１０中に示される。図１０のアデノウイルスベクターは実施例１に記載のように創製した。所定のタンパク質、好ましくは１つの受容体または受容体のクラス、特に細胞特異的または組織特異的受容体に結合し得る短いペプチド配列またはタンパク質ドメインをコードするＤＮＡが、天然の受容体結合配列が欠失、変異した、または立体配座的に接近不能になったファイバー遺伝子配列中に好ましく挿入される。しかしながら、他のＤＮＡ配列、例えば受容体特異的抗体ドメインや特異的抗体により認識される抗原エピトープをコードする配列のような二重／多重特異的タンパク質認識配列をコードするものもまた、天然の受容体結合配列を置換するのに用いることができる。標的受容体は、最適には細胞特異的または組織特異的であり、望ましくは治療すべき細胞または組織でのみ発現する。非天然のユニークなプロテアーゼ部位もまた、ペントンベースまたはペントンベースキメラを通じてアデノウイルスをターゲッティングするためにファイバー遺伝子配列中に挿入することができる。該プロテアーゼ部位は、ファイバーの三量体化またはファイバータンパク質の受容体特異性に影響しないことが好ましい。ファイバーキメラを含有する粒子は標準の細胞系、例えば、現在アデノウイルスベクターに使用されている細胞系で生産される。生産および精製に引き続いて、ファイバータンパク質を切断しウイルス粒子からそれらを解き放ってファイバーを持たない粒子を生成する、配列特異的なプロテアーゼによる粒子の消化を通じて、該粒子はファイバーを持たなくなる。例えば、トロンビンはアミノ酸配列 V al Pro Arg Gly Ser(TRINS)（配列番号８）を認識してそこで切断する(Stenflo ら，J ．Biol．Chem.，257, 12280-12290(1982))。ファイバーを持たない粒子は安定で且つ細胞に結合し感染できることが分かっている（Falgout ら，J ．of Vi rology ，62，622-625(1992)）。このようにして得られる粒子は、次いでペントンベースまたは他のコートタンパク質により特定の組織にターゲッティングされ得る。天然の受容体結合配列を置換するのに用いられるＤＮＡの大きさは、例えば、ファイバーの妨害された折り畳みまたはペントンベース／ファイバー複合体の不適切な集合によって制約を受けるかもしれない。あるいは、キメラファイバータンパク質を含む細換えアデノウイルスは、ファイバータンパク質の受容体結合ドメインおよび三量体化ドメインを含む天然のノブ領域を除去し、非天然の三量体化ドメインおよびタンパク質特異的結合ドメインで置換することにより製造され得る（Peteranderl ら，Biochemistry，31，12 272-12276(1992)）。キメラファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスはまた、ノブ領域における点変異および三量体化するが天然の受容体に結合できないクローンの単離によっても製造することができる。いずれの場合においても、また上記した、天然の受容体特異的結合配列の除去または置換に関しても、適当な位置でファイバー遺伝子配列中に新しいタンパク質結合ドメインをコードする核酸配列を挿入することにより、該結合ドメインをファイバータンパク質のＣ末端上もしくはファイバータンパク質の露出したループ中に加えることができる。タンパク質結合配列をファイバータンパク質中に導入するのにどのような方法が用いられるかに関係なく、ファイバータンパク質は三量体化できなければならない。もしファイバータンパク質が三量体化できなければ、ペントンベースタンパク質に結合することができないであろう。したがって、天然の受容体結合配列は該分子が三量体化する能力に影響することなく変更されなければならない。組換えキメラファイバー遺伝子配列は、その発現および受容体またはタンパク質特異性および機能的親和性、三量体化能、ペントンベース結合および他の生化学的特徴の評価のために、アデノウイルス運搬ベクターからバキュロウイルスまたは好適な原核もしくは真核の発現ベクターに移すことができる。したがって、本発明はまた、キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列を含む組換えバキュロウイルス発現ベクター並びに原核および真核の発現ベクターを提供する。該キメラファイバー遺伝子配列は天然のファイバーアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに、天然のファイバーが結合するタンパク質以外のタンパク質との結合に特異的な非天然の配列を含む。天然のファイバーアミノ酸配列は、キメラファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルスに関して上記したように、欠失または変異させても、あるいは立体配座的に接近不能にしてもよい。キメラ遺伝子をアデノウイルスベクターからバキュロウイルスまたは原核もしくは真核の発現ベクターに移すことによって、高いタンパク質発現が達成できる（総タンパクのおよそ５〜５０％がキメラファイバー）。したがって、本発明はまた、キメラファイバー遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスおよび天然のファイバーアミノ酸配列に加えて、あるいはそれの代わりに非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質を提供する。非天然のアミノ酸配列は、受容体や二重／多重特異的タンパク質のようなタンパク質との結合に特異的であるか、あるいは上述のようにプロテアーゼ切断部位をコードする。タンパク質特性解析研究のために、組換えキメラファイバータンパク質（ｒｃＦタンパク質，例えばｒｃＦ５）を上述の Wickhamら（1993）のようないずれかの好適な方法を用いて精製することができる。目的のファイバータンパク質の種々の特性パラメーターを調べることができる。受容体または他のタンパク質／ｒｃＦ相互作用の特異性および親和性は、上述の Wickham ら（1993）により野生型ペントンベースタンパク質について先に示されているように、スキャッチャード解析によって調べることができる。受容体特異性は、さらに、細胞へのｒｃＦ５の結合を妨害するために、標的受容体に特異的な抗体およびペプチドを用いて通常の方法により調べることができる。ペントンベースタンパク質へのｒｃＦ５の結合は、該ファイバータンパク質に対する抗体を介してプロテインＡでコーティングしたビーズに連結したときに、放射性標識されたペントンベースタンパク質を沈殿させる能力により調べられる。ウイルスの接着、侵入および遺伝子発現は、まず目的のインサートを含むアデノウイルスベクターを用いてキメラファイバータンパク質およびβ−ガラクトシダーゼのようなマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを生じさせることにより評価される。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＬａｃＺ）で感染させた細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現は細胞へのＡｄ− Ｇｌｕｃ添加後２時間ほどの早さで検出することができる。この手法は組換えウイルスの細胞侵入および遺伝子発現の迅速且つ効率的な分析を提供し、通常の技術を用いて当業者により容易に実施されるものである。ファイバー中に天然の受容体結合配列を欠く組換えウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域をＬａｃＺ遺伝子で置換したＡｄ５ＬａｃＺウイルスを複製することができるヒト胚細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）中で産生させることができる。キメラファイバーを含む組換えアデノウイルスを産生するためには、２９３細胞株はキメラファイバータンパク質がターゲッティングされる受容体を発現しなければならない。構成的に受容体が発現しない場合は、安定に発現する細胞系を創製するために該受容体遺伝子を２９３細胞株にトランスフェクトすればよい。本発明の組換えアデノウイルスは、矯正ＤＮＡ、すなわち、欠損するか損なわれた機能をコードするＤＮＡ、または、例えば細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするＤＮＡのような慎重な殺傷剤を標的細胞に送達することにより数多くの疾患のいずれかを治療するのに用いることができる。このような治療の対象となり得る疾患としては、例えば、癌（例えば黒色腫、膠腫または肺癌）、遺伝病（例えば嚢胞性線維症、血友病または筋ジストロフィー）、病原性の感染（例えばヒト免疫不全ウイルス、結核または肝炎）、心臓病（例えば壊死組織に再灌流させるための血管形成術または血管新生促進の後の妨害的再狭窄）および自己免疫障害（例えばクローン病、大腸炎または関節リウマチ）が挙げられる。当業者には、本発明の組換えアデノウイルスを遺伝子治療（例えば、Rosenfel dら，Science ，252，431-434（1991）；Jaffeら，Clin ．Res.，39(2), 302A（19 91）；Rosenfeldら，Clin ．Res.，39(2), 311A（1991）；Berkner，Bio Techniq ues ，6, 616-629（1988）を参照）、化学療法およびワクチン接種の目的で動物に投与するのに適当な方法を利用することができ、また、１つ以上の経路がこのような組換えアデノウイルスを投与するのに使用できるが、ある特定の経路が他の経路よりもより迅速でより効果的な反応を提供し得ることがわかるであろう。医薬上許容され得る賦形剤もまた当業者によく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択は組換えアデノウイルスの投与に使用される特定の方法によって部分的に決定されるであろう。したがって、本発明における使用には非常に多様な好適な製剤がある。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって何ら限定するものではない。経口投与に好適な製剤は、（ａ）液剤、例えば水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈剤に溶解された有効量の化合物、（ｂ）それぞれ予め決められた量の有効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、（ｃ）適当な液体中の懸濁液剤、および（ｄ）適当な乳液剤からなり得る。錠剤型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学的に適合する賦形剤のうちの１つまたはそれ以上を含み得る。トローチ型は、有効成分を香味成分、通常はシュクロースおよびアカシアまたはトラガカントゴム中に含み得るし、また、香錠剤は有効成分をゼラチンおよびグリセリン、またはシュクロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に含み、乳化剤、ゲル剤などは有効成分に加えて、当技術分野において知られているような賦形剤を含有する。本発明の組換えアデノウイルスは単独で、あるいは他の適当な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容され得る推進ガス中におくことができる。それらはまた、ネブライザー噴霧器やアトマイザー噴霧器のような非加圧製剤用の医薬として製剤化され得る。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁化剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルのような単位用量または複数回用量を封入した容器で提供され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤および懸濁液剤は、以前に記載された種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。さらに、本発明の組換えアデノウイルスは、乳化用基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより坐薬としてもよい。膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当技術分野において適当であると知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。本発明によれば、動物、特にヒトに投与される用量は目的の遺伝子、使用される組成物、投与方法および治療される特定部位および生物によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。本発明の組換えアデノウイルスに加えて、組換えベクター、例えばアデノウイルス運搬ベクターはまたインビトロでの有用性を有する。それらは、アデノウイルスの細胞接着および細胞感染の研究における研究用の道具として、また、受容体−リガンド相互作用の測定方法に使用することができる。同様に、天然の受容体結合配列に加えて、あるいはそれの代わりに非天然のアミノ酸配列を含む組換えファイバータンパク質は、例えば、受容体−リガンドアッセイに、また、インビトロまたはインビボでの接着タンパク質として使用することができる。以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろん、これらは決して本発明の範囲を限定するように構成されたものではない。実施例１本実施例では、天然のＡｄ５受容体結合ドメインを非天然のＡｄ２受容体結合ドメインで置換したキメラファイバータンパク質を創製することにより、受容体特異性を変化させずにアデノウイルスの抗原性を変化させる方法について述べる。Ａｄ２ファイバー遺伝子をＰＣＲにより増幅した。その際、配列番号１のセンスＰＣＲプライマーの５’末端にXho I 部位を導入し、配列番号２のアンチセンスプライマーの５’末端にXma I およびBam HI部位を導入して、ベクターpAcSG2 （図４）(Pharmingen，San Diego，CA)中のXho I/Xma I クローニング部位にクローニングできるようにし、ベクター pAcSG2(F2)（図８）を作製した。pAcSG2( F2)は、受容体およびペントンベース結合活性について、ファイバーキメラをタンパク質レベルで評価するのに使用した。ファイバー２遺伝子のNde I/Bam HI断片を pAcSG2(F2)から除き、ベクター p1 93 FC（F-）（図５）にクローニングして p193 FC（F2）（図６）を作製した。ベクター p193 FC（F-）を、すべてのキメラファイバーアデノウイルスを作るための元になるベクターとして使用した。p193 FC(F-)ベクターは、p193 Ad5(Nde I/Sal I)（図３）ベクターをNde I およびMun I で切断して、終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含むＡｄ５ファイバー遺伝子のほとんどを除去し、Nde I/Mun I断片をＡｄ５ファイバーのアミノ酸コード領域は欠くが終止およびポリアデニル化シグナルを保持する合成オリゴヌクレオチドで置換することにより作製した。該合成オリゴヌクレオチドは、対に形成されると切断されたNde I およびMun I 部位を再創製し、Nde I/Bam HI部位への指向的なクローニングが可能なように終止コドンのすぐ上流にBam HI部位を含む、２つのセンスおよびアンチセンス相補オリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号３および配列番号４）から調製した。次いで、キメラＡｄ２／Ａｄ５ファイバー遺伝子を含むNde I/Sal I 断片をベクター pGBS.59-100（図２）にクローニングして運搬ベクターpGBS.5 9-100（F2）（図７）を作製した。次に、pGBS.59-100(F2)運搬ベクターをSal I で切断、精製して、相補的な２７，５３０ｂｐのＡｄ５ＤＮＡ断片（左アーム，０〜２７，５３０ｂｐ）とともに適当な細胞系にトランスフェクトし、相同組換えを通じて組換えウイルスを作製した。適当な細胞系とは、キメラファイバーに対する受容体を発現し且つアデノウイルスベクターを複製し得るいずれかの細胞系のことである。Ａｄ５ＤＮＡの相補的断片は、野生型Ａｄ５ゲノムの２７，５３０位でＡｄ５ゲノムを１回切断する制限酵素Srf I でＡｄ５ＤＮＡを切断することにより調製した。次に、アガロースゲルまたは他の適当な分離技術も利用できたが、ＣｓＣｌ勾配を用いて大きい方の２７，５３０ｂｐ断片を小さい方のｂｐ断片から分離した。あるいは、ウイルスＤＮＡは、野生型Ａｄ５ゲノムの２７，０８２位で切断するSpe I のような制限酵素で切断することもできる。該２７，０８２ｂｐ Spe I 断片は、上記のように小さい方の断片から分離し、pGBS.59-100(F2)ベクター由来の相補的なSpe I/Sal I 断片と連結した後適当な細胞系にトランスフェクトすることができる。次いで、組換えウイルスをプラークアッセイにより単離し、該キメラに特異的なＰＣＲプローブを用いて、また、制限分析によって組換え体であることを確認することができる。実施例２本実施例では、天然のＡｄ５受容体結合ドメインを非天然のＡｄ２受容体結合ドメインで置換したキメラファイバータンパク質を作製することにより、受容体特異性および抗原性を変化させる方法について述べる。ＰＣＲを用いてＡｄ３ファイバー遺伝子の大きなフラクションを増幅するのにオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。配列番号５の５’センスプライマーはNde I 部位を組み込んだ読み枠の合った変異を含んでおり、一方、配列番号６のアンチセンスオレゴヌクレオチドは、Ａｄ２ファイバー遺伝子の対応するNde I/Bam HI領域が除去された pAcSG2(F2)中に増幅断片をクローニングできるようにBam HI部位を組み込んでいた。次に、Ａｄ３ファイバー遺伝子のNde I/Bam HI 断片をベクター pAcSG2(F3)（図１１）から除去し、ベクター p193 FC（F-）にクローニングして p193 FC（F3）（図９）を作製した。次いで、キメラＡｄ３／Ａｄ５ファイバー遺伝子を含む該Nde I/Sal I 断片をベクター pGBS.59-100にクローニングして運搬ベクター pGBS.59-100（F3）（図１０）を作製した。それから実施例１のように pGBS.59-100（F3）運搬ベクターを切断、精製してＡｄ５アームとともに適当な細胞系にトランスフェクトした。組換えウイルスをそれから実施例１のように単離し、組換え体であることを確認した。Ａｄ５の結合にはシアリル酸は関与しないのに対して、Ａｄ３に対する受容体はＡｄ３の結合のために必要なシアリル酸成分を含有する。シアリル酸はすべての高等真核細胞上に見出されるので、該Ａｄ３／Ａｄ５ファイバーキメラはすべての細胞に結合し得る。このようなベクターは非常に広い範囲の細胞種に感染することができ、インビボで非キメラＡｄ５ベクターとは異なる組織特異性を示す。実施例３本実施例では、受容体特異性をどのように変化させ得るか、また、結合ドメインをマウスアデノウイルスファイバーのＣ末端にどのように組み込み得るかについて述べる。例えば、非ヒトアデノウイルス血清型であるマウスアデノウイルスタイプ１由来のファイバー配列を、ＰＣＲを用いて増幅する。センスおよびアンチセンスＰＣＲプライマーにそれぞれ組み込まれたNhe I およびBam HI部位によってＰＣＲ産物のそれに続くクローニングが可能になる。Nhe I 部位は、ペントンベース認識ドメインをコードする配列の後に現れる、Ａｄ５ファイバー中に天然に見出される部位に対応する。必要なBam HI部位に加え、アンチセンスプライマーは５〜３０アミノ酸のアミノ酸スペーサー（例えば、ポリ［Ala Ser ］またはポリ［Gl y ］）に続いてα_Vβ₃−特異的なＲＧＤペプチドをコードする配列を含む。ユニークな制限部位がスペーサー配列に続く配列中に、次いで終止コドンの前にも再び組み込まれる。該部位によりα_Vβ₃−特異的なＲＧＤペプチド以外の受容体特異的配列の組み込みが可能となる。次に、得られるＰＣＲ産物を pAcSG2（F5）にクローニングして対応するＡｄ５ファイバー配列を置換し pAcSG2（MouseRGD ）を作製する。該キメラファイバー遺伝子を含むNde I/Bam HI断片を p193 FC（ F-）にクローニングして p193 FC（MouseRGD）を作製する。運搬ベクター pGBS. 59-100（MouseRGD）を作製するために p193 FC（MouseRGD）由来のNde I/Sal I 断片を pGBS.59-100にクローニングする。次いで該運搬ベクターを調製し、実施例１に記載されるようにして、相補的なＡｄ５ＤＮＡとともにａｖｂ３受容体を発現する細胞にトランスフェクトする。該キメラファイバーを含む組換えウイルスを実施例１と同様にして分析する。ベクター中に組み込まれたユニークな制限部位を用いて、Ｐ−セレクチン結合ドメインまたは一本鎖受容体特異的抗体のような他の受容体結合ドメインを直接ベクターにクローニングすることができる。しかしながら、トランスフェクションに使用される細胞系は、組換えウイルスが細胞に接着し感染するための標的受容体を発現していなければならない。ヒト受容体を認識しないファイバー分子への受容体または抗体結合ドメインの組み込みは、ヒト受容体を認識して効率よいターゲッティングを妨げる残存のアミノ酸配列を保持しないこのようなファイバーを用いたベクターのターゲッティングに備える。実施例４本実施例では、天然のファイバー受容体結合ドメインを変異し、非天然の結合ドメインを変異体Ａｄ５のＣ末端もしくは露出したループ内に組み込むことにより、受容体特異性を変化させる方法について述べる。三量体化し得るが天然のファイバー受容体に結合できないファイバーを生成する変異ファイバー遺伝子をクローニング用の適当な制限部位を組み込んだプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。必要なBam HI部位に加え、アンチセンスプライマーはポリ(Al aSer)またはポリ Glyのような５〜３０アミノ酸のアミノ酸スペーサーに続いてα_Vβ₃ー特異的なＲＧＤペプチドをコードする配列を含む。ユニークな制限部位がスペーサー配列に続く配列中に、次いで終止コドンの前にも組み込まれる。該部位によりα_Vβ₃−特異的なＲＧＤペプチド以外の受容体特異的配列の組み込みが可能となる。増幅されたキメラ遺伝子を p193 FC（F-）プラスミドにクローニングして p193 FC（F5^*：β３）を得る。次いで、pGBS.59-100（F5^*：β３）を得るために該キメラファイバー遺伝子を含むNde I/Sal I 断片を pGBS.59-100ベクターにクローニングする。該運搬ベクターを調製し、実施例１に記載されるようにして相補的なＡｄ５ＤＮＡとともにトランスフェクトする。該キメラファイバー遺伝子を含む組換えウイルスを実施例１と同様にして分析する。他の受容体または抗体にそれぞれターゲッティングするために、実施例３に記載されるようにして、他の受容体特異的または抗体特異的結合ドメインを該ベクターにクローニングして、タンパク質のＣ末端またはファイバー分子の露出したループ内にこのような配列を有するファイバーキメラを作製することができる。実施例５本実施例では、三量体化ドメインによるノブの置換および該ノブタンパク質のＣ末端での結合ドメインの組み込みについて述べる。アデノウイルスタイプ２ファイバー遺伝子をＰＣＲを用いてＡｄ２ウイルスＤＮＡから増幅し、バキュロウイルス運搬ベクター pBlueBac2（Invitrogen，La J olla，CA）にクローニングしてベクター pBB2Fを生成した。ユニークな制限部位であるPst I およびBam HIが該タンパク質のノブ領域をコードするファイバー２遺伝子の領域を囲む。これらの部位を用いて該ファイバー遺伝子のPst I からBa m HIまでの部分を除去し、それを、グリシンスペーサーを介して、インテグリンａｖｂ３に特異的なＲＧＤペプチドに融合させたK. lactis熱ショック因子（ＨＳＦ）タンパク質由来の三量体化ドメインをコードするＤＮＡで置換した。該ＨＳＦドメインおよびＲＧＤペプチドをコードするＤＮＡは、K. lactisのＨＳＦタンパク質全体の配列を含むプラスミドからＰＣＲを通じて得た。ＨＳＦ三量体化ドメインのＰＣＲに用いた配列番号７のアンチセンスＤＮＡプライマーにＲＧＤペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込んで、ＨＳＦ：ＲＧＤ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製した。センスプライマーはＡｄ２ファイバー遺伝子本来のPst I 部位を含んでいた。次に、ＰＣＲ産物をPst I およびBam HIで消化し、pAcSG2（F2）ベクターにクローニングしてプラスミド pAcSG2:HSF:RGD （図１４）を得た。グリシンスペーサーアームをコードする配列の端のＲＧＤコード配列に代えて、異なる受容体特異的または抗体特異的配列を迅速に該キメラＨＳＦ：ＲＧＤ遺伝子中に挿入できるように、ユニークなSpe I およびSca I 部位を該遺伝子に組み込んだ。pAcSG2:HSF:RGDプラスミド（図１４）を用いて高レベルで該融合タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを作った。発現した融合タンパク質は正しい大きさで且つ三量体を形成した。次いで、該キメラ遺伝子のNde I/Bam HI断片をベクター pAcSG2（HSF:RGD）から除去し、ベクター p19 3 FC（F-）にクローニングして p193 FC(HSF:RGD)（図１２）を作製した。該キメラファイバー遺伝子を含むNde I/Sal I 断片をベクター pGBS.59-100（図２）にクローニングして運搬ベクター pGBS.59-100(HSF:RGD)（図１３）を作製した。次に、実施例１と同様にして、pGBS.59-100(HSF:RGD)運搬ベクターを切断、精製してＡｄ５アームとともに適当な細胞系にトランスフェクトした。その後、実施例１と同様にして組換えウイルスを単離し、組換え体であることを確認した。実施例６本実施例では、ノブを三量体化ドメインで置換する方法およびプロテアーゼ切断部位を含む結合ドメインをノブのＣ末端に組み込む方法について述べる。キメラファイバーは、二重特異的抗体により認識されるエピトープを該キメラに組み込むことによって新しい受容体にターゲッティングすることができる。付加的なＲＧＤドメインを該タンパク質のＣ末端に組み込み、ユニークなプロテアーゼ認識部位によって抗体エピトープから分離する。該キメラウイルスはＲＧＤ配列に対する受容体を発現する組織培養細胞中で生育し得る。次いで、ウイルスの最終調製物をプロテアーゼに晒してエピトープを残したままＲＧＤ配列を除去する。次に、分子の半分がキメラファイバー上のエピトープを認識し、もう半分がいずれか所望の受容体、例えば細胞または組織特異的受容体を認識する二重特異的抗体にウイルス粒子を晒す。ＲＧＤ配列がないと、ウイルスは該二重特異的抗体により認識される細胞にのみ結合し、侵入する。実施例７本実施例では、天然のＡｄ５ファイバーを非天然のＡｄ７ファイバーで置換することによってＡｄ５ウイルスのアデノウイルス抗原性および受容体特異性を変化させる方法について述べ、このような組換えウイルスがインビトロおよびインビボで細胞に感染する能力を実証する。図１５に示すようにしてＡｄ５ウイルス−Ａｄ７ファイバー構築物を生成した。pAd70-100 中の約２．７ｋｂ（Ａｄ５２８６８９−３１３１７ｂｐ）断片をPac I リンカー（pAd-100dlE3.Pac ）で置換した。Bam HIリンカーを図１３中に示したようにユニークなMun I 部位に挿入してpAd70-100dlE3.Pac.Bam を生成した。Ａｄ７ファイバー遺伝子を含む約１．１ｋｂのＰＣＲで増幅したPac I-Bam HI断片を、pAd70-100dlE3.Pac.Bam に挿入して pAd70-100dlE3.fiber7 を生成した。Ａｄ７ファイバーを有するＡｄ５ウイルスがインビトロおよびインビボで細胞に感染する能力を調べるために、リポーター遺伝子アッセイを行った。adCMV-CA TNeoと命名された複製能を欠損する組換えアデノウイルスリポーターベクターを該リポーター遺伝子アッセイに使用した。該リポーターベクターはアデノウイルスの複製起点およびウイルスパッケージング配列、強力な真核プロモーター（サイトメガロウイルス、すなわちＣＭＶ−１）とスプライシングエレメントの組み合わせ、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子配列、マウスβ^maj−グロビンポリ（Ａ）部位、ネオマイシン遺伝子（Ｎｅｏ）および重複組換えを見越した十分なアデノウイルスＤＮＡからなる。該リポーターベクターを用いてAdCMV-CATNeo，AdCMV-CATNeo-dlE3(AdCMV-CATN eo + pAd70-100dlE3)およびAdCMV-CATNeo-dlE3-Fiber7(AdCMV-CATNeo + pAd70-1 00dlE3.Fiber7)ウイルスを生成した。各ウイルスをラージスケールで、すなわち１Ｌのヒト胚性腎２９３細胞中で増殖させ、１０¹²粒子／ｍＬの濃度のウイルスを得た。Ａ５４９細胞を３つのウイルスのうちの１つに、見積もりで１００，３００または１，０００粒子／細胞となるように感染させた。４８時間後、細胞を回収して、Kass-Eisler ら（PNAS USA，90，11498-11502（1993，12月））に記載されるようにして溶解物を調製した。各溶解物５０μＬを用いてＣＡＴアッセイを行い、クロロホルム：メタノール（９５：５）を用いた薄層クロマトグラフィーによりアセチル化したクロラムフェニコール産物を分離した。アッセイの結果、各ウイルスは細胞に感染して適当なレベルで遺伝子産物を発現できることが示された。したがって、天然のファイバーを非天然のファイバーで置換したウイルスは、その親ウイルスと同様に細胞に感染して遺伝子を発現することができた。この研究に続いて、成体のSprague Dawleyラットに１０⁸個のウイルス粒子をK ass-Eisler ら（上述）に記載されるように直接心臓に注射して感染させた。５日後、該ラツトを屠殺して心臓溶解物を調製し、ＣＡＴアッセイを行った。ＣＡＴ遺伝子産物の量をdlE3ウイルスとdlE3-Fiber 7ウイルスとの間で比較した。その結果、両方のウイルスがイビボで細胞鬼感染できることが示された。野性型Ａｄ５ファイバー遺伝子をＡｄ７のファイバー遺伝子で置換してもウイルスの細胞感染能力を損なうことはなかった。したがって、天然のファイバーを非天然のファイバーで置換したウイルスはまた、インビボでもその親ウイルスと同様に細胞に感染して遺伝子を発現することができた。これらの結果は、遺伝子治療においてキメラファイバーを有するアデノウイルスが利用可能であることを支持するものである。ここに挙げたすべての刊行物は、各刊行物が言及によって組み込まれるために個々にそして具体的に述べられ、ここに完全に明らかにされたと同程度に、ここに言及することで組み入れられるものである。本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、当業者には好ましい実施態様が変更され得ることが自明であろう。本発明は、ここで特に記載した以外の方法でも実施され得ることを意図している。したがって、本発明は添付の請求の範囲の精神と範囲に包含されるすべての変形を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年９月１３日【補正内容】【図１２】【図１３】【図１４】【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年３月２６日【補正内容】請求の範囲：１．天然のファイバーアミノ酸配列に加えて非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質であって、該非天然アミノ酸配列がプロテアーゼ認識配列または天然のファイバーアミノ酸配列の血清型とは異なるアデノウイルスの血清型由来のタンパク質結合配列である該キメラアデノウイルスファイバータンパク質。２．天然のファイバーアミノ酸配列の代わりに非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質であって、該非天然アミノ酸配列がプロテアーゼ認識配列または天然のファイバーアミノ酸配列の血清型とは異なるアデノウイルスの血清型由来のタンパク質結合配列である該キメラアデノウイルスファイバータンパク質。３．天然のファイバーアミノ酸配列に加えて非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質であって、該非天然アミノ酸配列が天然のファイバーアミノ酸配列の血清型とは異なるアデノウイルスの血清型由来の配列である該キメラアデノウイルスファイバータンパク質。４．天然のファイバーアミノ酸配列の代わりに非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質であって、該非天然アミノ酸配列が天然のファイバーアミノ酸配列の血清型とは異なるアデノウイルスの血清型由来の配列である該キメラアデノウイルスファイバータンパク質。５．天然のファイバーアミノ酸配列に加えて非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質であって、該非天然アミノ酸配列がプロテアーゼ認識配列またはタンパク質結合配列であり且つキメラアデノウイルスファイバータンパク質の露出したループ内にある、該キメラアデノウイルスファイバータンパク質。６．天然のファイバーアミノ酸配列の代わりに非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質であって、該非天然アミノ酸配列がプロテアーゼ認識配列またはタンパク質結合配列であり且つキメラアデノウイルスファイバータンパク質の露出したループ内にある、該キメラアデノウイルスファイバータンパク質。７．該非天然アミノ酸配列がキメラアデノウイルスファイバータンパク質の内部に位置するものである請求の範囲１〜４のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。８．該非天然アミノ酸配列がキメラアデノウイルスファイバータンパク質の露出したループ内に位置するものである請求の範囲１〜４のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。９．該天然ファイバーアミノ酸配列がファイバータンパク質内を移動させられたものである請求の範囲１，３，５および７のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。１０．該天然ファイバーアミノ酸配列がタンパク質結合配列である請求の範囲２，４，６および８のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。１１．哺乳動物細胞で産生されると該キメラファイバータンパク質が三量体を形成する請求の範囲１〜１０のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。１２．該非天然アミノ酸配列がさらに三量体化ドメインを含む請求の範囲１〜１１のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。１３．該非天然アミノ酸配列が少なくとも１つのスペーサー配列によって該天然アミノ酸配列と連結している請求の範囲１〜１１のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質。１４．請求の範囲１〜１３のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質を含む組換えアデノウイルス。１５．天然のファイバー配列が天然ファイバーアミノ酸配列の血清型とは異なるアデノウイルスの血清型由来の非天然ファイバー配列で完全に置換された組換えアデノウイルス。１６．さらに別のキメラアデノウイルスコートタンパク質を含む請求の範囲１４または１５の組換えアデノウイルス。１７．請求の範囲１〜１３のいずれかのキメラアデノウイルスファイバータンパク質をコードする単離精製された核酸。１８．請求の範囲１４〜１６のいずれかの組換えアデノウイルスをコードする単離精製された核酸。１９．請求の範囲１７の核酸を含むウイルス運搬ベクター。２０．該ベクターが原核発現ベクター、真核発現ベクターおよび組換えバキュロウイルスからなる群より選択される請求の範囲１７の核酸を含むベクター。２１．請求の範囲１４〜１６のいずれかの組換えアデノウイルスを細胞に導入することを含む細胞を遺伝的に修飾する方法。２２．請求の範囲１４〜１６のいずれかの組換えアデノウイルスを含む薬剤の、医療的処置における最初の使用。２３．医療的処置用薬剤の製造のための請求の範囲１４〜１６のいずれかの組換えアデノウイルスの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウィッカム、トーマスジェイ. アメリカ合衆国、メリーランド州 20854、ポトマック、チャレンコート、５ (72)発明者ファルク−ペダーセン、エリックアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10522、ドッブズフェリー、ブエナヴィスタドライヴ、8714 (72)発明者ロエルヴィンク、ペトラスダヴリュー. アメリカ合衆国、メリーランド州 28799 −2333、ゲイダーズバーグ、ロストナイフサークル、18313、アパートメント 203 (72)発明者ブルーダー、ジョセフティー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20879、ゲイダーズバーグ、リンドスコート、 20423 (72)発明者ゴール、ジェイソンアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10021、ニューヨーク、ナンバー８ピー、イー．セヴンティースストリート、420 (72)発明者コウヴェスディ、イムリアメリカ合衆国、メリーランド州 20052、ロックヴィル、ロリンズアヴェニュー、 206

Claims

【特許請求の範囲】１．(a)タンパク質結合配列を含む天然のファイバーアミノ酸配列に加えて、またはそれの代わりに、タンパク質結合配列またはプロテアーゼ認識配列を含む非天然のアミノ酸配列を含有するキメラファイバータンパク質、および(b)組換えアデノウイルスが接着またはそれによって内部移行した細胞において発現し得る治療遺伝子、および任意で、(c)三量体化ドメインを含む天然のファイバーアミノ酸配列の代わりに、三量体化ドメインを含む非天然のアミノ酸配列を含有する組換えアデノウイルス。２．該キメラファイバータンパク質中の該非天然アミノ酸配列が、該組換えアデノウイルスの血清型と異なるアデノウイルス血清型由来のタンパク質結合配列、二重特異的タンパク質結合配列および多重特異的タンパク質結合配列からなる群より選択されるタンパク質結合配列である請求の範囲１の組換えアデノウイルス。３．該キメラファイバータンパク質中の該非天然アミノ酸配列が、該キメラファイバータンパク質のＣ末端に位置するタンパク質結合配列である請求の範囲１の組換えアデノウイルス。４．さらにタンパク質への結合に特異的な非天然のアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含有する請求の範囲１の組換えアデノウイルス。５．該キメラコートタンパク質中の該アミノ酸配列が、該キメラファイバータンパク質中の非天然アミノ酸配列と同じタンパク質への結合に特異的である請求の範囲４の組換えアデノウイルス。６．該キメラコートタンパク質がキメラペントンベースおよびキメラヘキソンからなる群より選択される請求の範囲４の組換えアデノウイルス。７．キメラファイバータンパク質をコードするキメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列を含む組換えバキュロウイルスであって、該キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列が、タンパク質結合配列であるアミノ酸配列をコードする天然のファイバー遺伝子配列に加えて、またはそれの代わりに、タンパク質結合配列であるアミノ酸配列をコードする非天然の遺伝子配列を含むものである該組換えバキュロウイルス。８．タンパク質結合配列である天然のファイバーアミノ酸配列に加えて、またはそれの代わりに、タンパク質結合配列またはプロテアーゼ認識配列である非天然のアミノ酸配列を含み、任意で、三量体化ドメインである天然のファイバーアミノ酸配列の代わりに三量体化ドメインである非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質。９．キメラファイバータンパク質をコードするキメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列を含むウイルス運搬ベクターであって、該キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列が、タンパク質結合配列であるアミノ酸配列をコードする天然のファイバー遺伝子配列に加えて、タンパク質結合配列またはプロテアーゼ認識配列であるアミノ酸配列をコードする非天然の遺伝子配列を含むものである該ウイルス運搬ベクター。１０．該ウイルス運搬ベクターがアデノウイルス運搬ベクターである請求の範囲９のウイルス運搬ベクター。１１．アミノ酸配列をコードする該非天然遺伝子配列が、該キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列の血清型とは異なるアデノウイルス血清型由来のタンパク質結合配列、二重特異的タンパク質結合配列および多重特異的結合配列からなる群より選択されるタンパク質結合配列である請求の範囲１０のウイルス運搬ベクター。１２．該天然ファイバー遺伝子配列が変異したものである請求の範囲１０のウイルス運搬ベクター。１３．該天然ファイバー遺伝子配列が非天然遺伝子配列の挿入により変異したものである請求の範囲１２のウイルス運搬ベクター。１４．該天然ファイバー遺伝子配列がタンパク質結合配列であり、それが立体配座的にタンパク質に近づけずに結合できないように、ファイバー遺伝子配列内を移動させられたものである請求の範囲１０のウイルス運搬ベクター。１５．該天然ファイバー遺伝子配列がタンパク質結合配列であり、該非天然遺伝子配列の挿入により移動させられたものである請求の範囲１４のウイルス運搬ベクター。１６．キメラファイバータンパク質をコードするキメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列を含むウイルス運搬ベクターであって、該キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列が、タンパク質結合配列であるアミノ酸配列をコードする天然のファイバー遺伝子配列の代わりに、タンパク質結合配列またはプロテアーゼ認識配列であるアミノ酸配列をコードする非天然の遺伝子配列を含むものである該ウイルス運搬ベクター。１７．該ウイルス運搬ベクターがアデノウイルス運搬ベクターである請求の範囲１６のウイルス運搬ベクター。１８．アミノ酸をコードする該非天然遺伝子配列が、該キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列の血清型とは異なるアデノウイルス血清型由来のタンパク質結合配列、二重特異的タンパク質結合配列および多重特異的タンパク質結合配列からなる群より選択されるタンパク質結合配列である請求の範囲１７のウイルス運搬ベクター。１９．キメラファイバータンパク質をコードするキメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列を含む原核または真核発現ベクターであって、該キメラアデノウイルスファイバー遺伝子配列が、タンパク質結合配列であるアミノ酸配列をコードする天然のファイバー遺伝子配列に加えて、またはそれの代わりに、タンパク質結合配列であるアミノ酸配列をコードする非天然の遺伝し配列を含むものである該発現ベクター。２０．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲１の組換えアデノウイルスの治療上有効な量を投与することを含む遺伝子治療方法。２１．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲２の組換えアデノウイルスの治療上有効な量を投与することを含む遺伝子治療方法。２２．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲３の組換えアデノウイルスの治療上有効な量を投与することを含む遺伝子治療方法。２３．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲４の組換えアデノウイルスの治療上有効な量を投与することを含む遺伝子治療方法。２４．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲５の組換えアデノウイルスの治療上有効な量を投与することを含む遺伝子治療方法。２５．遺伝子治療を必要とする患者に、請求の範囲６の組換えアデノウイルスの治療上有効な量を投与することを含む遺伝子治療方法。