JPH1138005A - 免疫学的測定試薬の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便で正確に、抗体又は抗原等の最適条件を
選定して用いる免疫学的測定試薬製造方法を提供する。 【解決手段】 【請求項１】 被測定物質に対する抗体又は抗原を含有
する緩衝液を用いる免疫学的測定試薬の製造方法であっ
て、上記緩衝液を特定する諸項目のうち少なくとも１種
について、免疫学的測定の最適条件を選定するにあた
り、選定すべき項目についての条件を設定した系を用い
て抗原抗体反応により生じる凝集度合い（Ｘ）を測定
し、更に、選定すべき項目についての条件を設定しない
系を用いて抗原抗体反応により生じる凝集度合い（Ｙ）
を測定し、上記（Ｘ）及び上記（Ｙ）が、（Ｘ）／
（Ｙ）≧０．８となったときの条件を当該項目について
の最適条件として選定する免疫学的測定試薬の製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を含有
する免疫学的測定試薬の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】不溶性担体を用いた免疫学的測定試薬
は、抗原抗体反応を利用した血液等の生体液中の微量成
分測定方法として汎用されている。このような不溶性担
体を用いた免疫学的測定試薬において、不溶性担体に担
持させる抗体又は抗原については、測定が正確かつ簡便
に行われるように適切な抗体又は抗原を選定する作業が
必要となる。

【０００３】このような抗体又は抗原の選定において
は、該抗体又は抗原の力価を測定し最適な抗体又は抗原
を選定している。上記選定における定性法としては、Ｏ
ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、免疫電気泳動法、受身赤血球
凝集反応等が知られ、また、定量法としては、定量沈降
反応法、レーザーネフェロメトリー、ＳＲＩＤ（Ｓｉｎ
ｇｌｅ Ｒａｄｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ）法、ＲＳＲＩＤ（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ
Ｒａｄｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）
法、免疫電気拡散法等が知られている（「免疫学実験入
門」、松橋直ら著、生物化学実験法、第１５巻、学会出
版センター刊、１９８１年）。

【０００４】しかしながら、当該抗体又は抗原が不溶性
担体に担持される際の該抗体又は抗原と該不溶性担体と
の結合性は、該抗体又は抗原の起源動物の種類や希釈す
る緩衝液の種類等によって大きく異なり、上記方法で力
価が高いものが免疫学的測定試薬用として最適な抗体又
は抗原であるとは言えないのが現状であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、簡便で正確に、抗体又は抗原等の最適条件を選定
して用いる免疫学的測定試薬製造方法を提供することを
目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、被測定物質に
対する抗体又は抗原を含有する緩衝液を用いる免疫学的
測定試薬の製造方法であって、上記緩衝液を特定する諸
項目のうち少なくとも１種について、免疫学的測定の最
適条件を選定するにあたり、選定すべき項目についての
条件を設定した系を用いて抗原抗体反応により生じる凝
集度合い（Ｘ）を測定し、更に、選定すべき項目につい
ての条件を設定しない系を用いて抗原抗体反応により生
じる凝集度合い（Ｙ）を測定し、上記（Ｘ）及び上記
（Ｙ）が、 （Ｘ）／（Ｙ）≧０．８ となったときの条件を当該項目についての最適条件とし
て選定することを特徴とするものである。以下に本発明
を詳述する。

【０００７】通常、免疫学的測定試薬の製造方法におい
ては、（１）用いる抗体又は抗原の選定、（２）選定さ
れた抗体又は抗原の感作、（３）ブロッキング、（４）
試薬保存、の４工程を経ることにより行われる。本発明
の免疫学的測定試薬の製造方法においても、この工程を
経るが、上記（１）、（２）、（３）及び（４）の工程
において、本発明の特徴である最適条件選定方法を適用
することができる。

【０００８】本明細書において、「緩衝液を特定する諸
項目」とは、例えば、当該緩衝液中に含有される不溶性
担体が担持する抗体又は抗原の種類及び量、当該緩衝液
のイオン種、ｐＨ、添加剤等の種類及び／又は量等を意
味する。これらのうちの１種又は２種以上が、本発明の
免疫学的測定試薬の製造方法において最適条件選定の対
象となる。本明細書において、「選定すべき項目につい
ての条件を設定した系を用いて」とは、例えば、選定す
べき項目が当該緩衝液のイオン種である場合には、当該
イオン種を含有した緩衝液を用いて後述する必要な処理
を行うことを意味し、「選定すべき項目についての条件
を設定しない系を用いて」とは、当該特定したイオン種
を含有しない緩衝液を用いて後述する必要な処理を行う
ことを意味する。

【０００９】本発明の構成を具体的に説明するため、
「選定すべき項目」が、不溶性担体が担持すべき抗体又
は抗原である場合について、以下に更に詳述する。この
場合には、本発明の構成は、被測定物質に対する抗体又
は抗原を含有する免疫学的測定試薬の製造方法であっ
て、上記抗体又は抗原を選定するにあたり、（ａ）上記
抗体又は抗原を担持させた不溶性担体を含有する緩衝
液、（ｂ）陽性の被測定検体を含有する緩衝液、及び、
（ｃ）被測定物質に対する選定すべき抗体又は抗原を含
有する緩衝液を混合して抗原抗体反応により生じる凝集
の度合い（Ａ）を測定し、更に、（ａ）上記抗体又は抗
原を担持させた不溶性担体を含有する緩衝液、（ｂ）陽
性の被測定検体を含有する緩衝液、及び、（ｃ′）被測
定物質に対する選定すべき抗体又は抗原を含有しない緩
衝液を混合して抗原抗体反応により生じる凝集の度合い
（Ｂ）を測定し、上記（Ａ）及び上記（Ｂ）が、 （Ａ）／（Ｂ）≧０．８ となる抗体又は抗原を選定することを特徴とするものと
なる。

【００１０】即ち、本発明の免疫学的測定試薬の製造方
法においては、上記抗体又は抗原を選定するにあたっ
て、以下の作業を行う。 （ａ）上記抗体又は抗原を担持させた不溶性担体を含有
する緩衝液、（ｂ）陽性の被測定検体を含有する緩衝
液、及び、（ｃ）被測定物質に対する選定すべき抗体又
は抗原を含有する緩衝液を混合して抗原抗体反応により
生じる凝集の度合い（Ａ）を測定し、更に、（ａ）上記
抗体又は抗原を担持させた不溶性担体を含有する緩衝
液、（ｂ）陽性の被測定検体を含有する緩衝液、及び、
（ｃ′）被測定物質に対する選定すべき抗体又は抗原を
含有しない緩衝液を混合して抗原抗体反応により生じる
凝集の度合い（Ｂ）を測定し、上記（Ａ）及び上記
（Ｂ）が、 （Ａ）／（Ｂ）≧０．８ となる抗体又は抗原を選定する。

【００１１】上記（ａ）の緩衝液が含有する不溶性担体
は、抗体又は抗原を担持している。上記抗体又は抗原
は、後に述べる（ｃ）の緩衝液が含有する選定すべき抗
体又は抗原と混合して抗原抗体反応を起こす際に、
（ｃ）の緩衝液が含有する選定すべき抗体又は抗原と競
合することとなる。上記不溶性担体としては特に限定さ
れないが、水に均一に懸濁することができ、作業性もよ
いラテックス粒子が好ましい。

【００１２】上記（ｂ）は、免疫学的測定試薬に用いる
緩衝液に、陽性の被測定検体を含有させたものである。
上記陽性の被測定検体とは、免疫学的測定試薬の検体と
なる血液等の生体液であって、選定すべき抗体又は抗原
と抗原抗体反応を起こす抗原又は抗体（被測定物質とも
いう）を含有するものを意味する。上記抗原又は抗体を
含有させる量は、生理食塩水を免疫学的測定試薬で検体
として測定した場合に陽性と判断される量（カットオフ
量）以上であることが好ましい。

【００１３】本発明で用いられる抗体としては特に限定
されず、被測定物質である抗原に対するポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体等の通常抗原に対して反応し
得る抗体等が挙げられる。上記抗体は、複数の抗体から
なるものであってもよく、更に、抗体を限定分解したも
の、抗体を蛋白修飾したもの等であってもよい。上記抗
体としては、同一ロットで大量に供給することができる
ことから、特にヤギ等の大型動物産生抗体が好ましい。

【００１４】本発明で用いられる抗原としては、被測定
物質である抗体に対するエピトープを有するものであれ
ば特に限定されず、また、天然の抗原に何らかの操作を
加えたものであってもよく、遺伝子操作等により人工的
に作成されたものであってもよい。

【００１５】本発明の免疫学的測定試薬の対象となる被
測定物質は、不溶性担体に担持された抗体又は抗原と抗
原抗体反応を起こす性質を有する抗原又は抗体であれば
特に限定されず、例えば、β₂ −マイクログロブリン
（ＢＭＧ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍
関連物質、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、リウマチ因子（Ｒ
Ｆ）、アンチストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、トランス
フェリン等の血漿蛋白、ＨＢ_S 抗原、ＨＢ_S 抗体、ＨＢ
_e 抗原、ＨＢ_e 抗体等のウイルス肝炎の抗原及び／又は
抗体等の各種の生体成分等が挙げられる。

【００１６】本発明の構成を、被測定物質が抗原であ
り、免疫学的測定試薬がラテックス試薬である場合を例
として更に詳しく説明する。まず、（ｃ）被測定物質に
対する選定すべき抗体を含有する緩衝液を、反応容器に
分注する。これに、（ｂ）陽性の被測定検体を含有する
緩衝液と、（ａ）抗体を担持せた不溶性担体を含有する
緩衝液とを、分注混合し、反応させる。このようにする
ことにより、（ｂ）中の抗原が（ａ）中の抗体と反応す
る前に、（ｃ）中の選定すべき抗体と接触することとな
り、（ａ）中の抗体と競合関係にある（Ｃ）中の抗体が
先に（ｂ）中の抗原と反応を起こすので、より好まし
い。

【００１７】上記抗原抗体反応により生じた凝集物の生
成量及び／又は生成速度を測定し、その凝集度合い
（Ａ）を求める。上記凝集度合いの求め方としては、
（ｃ）中の抗体の力価を表現しうるものであれば特に限
定されず、例えば、後に詳述する吸光度等が挙げられ
る。

【００１８】上記の工程の後、本発明においては、
（ｃ′）被測定物質に対する選定すべき抗体又は抗原を
含有しない緩衝液を、上記（ｃ）被測定物質に対する選
定すべき抗体又は抗原を含有する緩衝液の代わりに用い
て、全く同様の操作を経る工程を実施する。このことに
より、凝集度合い（Ｂ）を求める。上記（ｃ′）被測定
物質に対する選定すべき抗体又は抗原を含有しない緩衝
液としては、例えば、生理食塩水緩衝液等が挙げられ
る。

【００１９】上記のようにして求めた（Ａ）及び（Ｂ）
の関係が、 （Ａ）／（Ｂ）≧０．８ となった場合に、そのときの（ｃ）中の抗体を適正抗体
として選定する。（Ａ）／（Ｂ）が０．８未満である場
合には、（Ａ）の凝集度合いが低すぎるため、抗体とし
て選定すると、適正な免疫学的測定を行うことができな
い傾向が強くなるので、本発明においては、上記範囲に
限定される。

【００２０】上記抗原抗体反応により生じた凝集物の生
成量及び／又は生成速度は、吸光度等を測定することに
より測ることができ、これにより、（ｃ）中の抗体の力
価を算出することができる。この場合、例えば、吸光度
の測定は１回のみに限定されず、複数回であってもよ
く、また、吸光度を測定する代わりに散乱光の光量を測
定する方法も用いることができる。

【００２１】上記吸光度の測定においては、３００〜１
０００ｎｍの適当な波長において行うことができるが、
ラテックス粒子の粒径に対して充分に長い波長を用いる
ことが好ましい。また、上記凝集物の生成量及び／又は
生成速度の測定にあたっては、従来公知の装置等を用い
ることができ、例えば、吸光度を測定するための通常の
分光光度計、光の散乱強度を測定する装置、粒子数及び
／又は粒子径を測定するための装置等が挙げられる。

【００２２】上記凝集物の生成量及び／又は生成速度の
測定をするための装置としては、分光光度計を組み込ん
だ生化学自動分析装置、免疫比濁法による凝集反応を測
定するための装置、フローインジェクションを利用して
凝集反応を測定するための装置、ラテックス凝集反応を
測定するための装置等が挙げられる。

【００２３】以上で、本発明の免疫学的測定試薬の製造
方法において、「選定すべき項目」が、抗体又は抗原の
種類である場合についての説明を終えた。本発明におい
て「選定すべき項目」は、抗体又は抗原の種類のみに限
定されない。

【００２４】例えば、抗体又は抗原を含有する緩衝液の
イオン種、ｐＨ、添加剤等の種類及び／又は量等の諸項
目を選定すべき項目として用いて、本発明を適用するこ
ともできる。このような場合、上記で述べた（ｃ）被測
定物質に対する選定すべき抗体又は抗原を含有する緩衝
液の代わりに、例えば、（ｃ１）被測定物質に対する選
定すべきイオン種を含有する緩衝液を用い、また
（ｃ′）被測定物質に対する選定すべき抗体又は抗原を
含有しない緩衝液の代わりに、例えば、（ｃ１′）被測
定物質に対する選定すべきイオン種を含有しない緩衝液
を用いて、上記と同様の工程を実施する。そして、当該
凝集度合い（Ｘ１）と（Ｙ１）とを求め、これから（Ｘ
１）／（Ｙ１）を算出してこれが０．８以上である場合
のイオン種を適正イオン種として選定すればよい。

【００２５】また、同様の手法を、抗体又は抗原を含有
する緩衝液のｐＨ、添加剤等について適用することによ
り、適正なｐＨ、添加剤等を選定することができる。更
に、本発明の上記原理を応用して、抗体又は抗原の感作
工程における最適条件を判定することもできる。

【００２６】この場合には、例えば、本発明の方法にお
ける（ａ）抗体又は抗原を担持させた不溶性担体を含有
する緩衝液において、イオン種、ｐＨ、添加剤等の諸項
目を設定した緩衝液とし、そして、（ａ′）抗体又は抗
原を担持せた不溶性担体を含有する緩衝液において、イ
オン種、ｐＨ、添加剤等の諸項目を設定しない緩衝液と
し、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組み合わせによって本
発明の方法を実施して凝集度合い（Ｘ２）を求めた後、
（ａ′）、（ｂ）及び（ｃ）の組み合わせによって本発
明の方法を実施して凝集度合い（Ｙ２）を求め、そして
（Ｘ２）／（Ｙ２）を算出してこれが０．８以上である
場合の項目を最適項目として設定すればよい。

【００２７】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。以下の実施例及び比較例においては、β₂ −
マイクログロブリン（以下「ＢＭＧ」という）を測定す
るためのラテックス試薬を作製し、その性能を調べた。

【００２８】実施例１ １）抗ヒトＢＭＧ抗体の光学的測定 牛血清アルブミンを１重量％、ポリエチレングリコール
（ポリエチレングリコール６０００、平均分子量７５０
０、和光純薬工業社製）を０．５重量％の濃度で溶解す
る０．３５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）９．９８ｍＬ
に、ＢＭＧ陽性検体（濃度１００ｍｇ／Ｌ、デンカ生研
社製）を２０μＬ添加混合し緩衝液（Ｒ１）とした。平
均粒径が０．１μｍのポリスチレン系ラテックス（固形
分量１０％、積水化学工業社製）を抗ヒトＢＭＧ抗血清
（オリエンタル酵母社製）に添加し、抗ヒトＢＭＧ抗体
担持ラテックス試薬（Ｒ２）を得た。生理食塩水３μＬ
に、緩衝液（Ｒ１）１８０μＬ、更にラテックス試薬
（Ｒ２）９０μＬを添加し攪拌し４分後の波長８００ｎ
ｍの吸光度（Ａ）（実際の吸光度の測定値を１００００
倍した値）を測定した。次に、ＳＲＩＤ法にて高力価と
判定された抗体（抗ヒトＢＭＧ山羊産生抗体）を０．３
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で６０倍に希釈したも
の３μＬに、緩衝液（Ｒ１）１８０μＬ、更にラテック
ス試薬（Ｒ２）９０μＬを添加し攪拌し４分後の波長８
００ｎｍの吸光度（Ｂ）（実際の吸光度の測定値を１０
０００倍した値）を測定した。このときの換算値
〔（Ｂ）／（Ａ）〕が０．８５の抗体について以下の試
薬化工程を行った。

【００２９】抗体の不溶性担体への担持工程 上記抗ヒトＢＭＧ山羊産生抗体を、蛋白量として１．８
ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に溶解した液５ｍＬに、平均粒径が０．１μｍのポ
リスチレン系ラテックス（固形分量１０％、積水化学工
業社製）５００μＬを添加し、３７℃にて１時間攪拌し
た。

【００３０】担持抗体のブロッキング工程 次に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を２重量％濃度で含
有した上記緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬを上記の抗ヒト
ＢＭＧ山羊産生抗体担持ラテックス懸濁液に加え、３７
℃で１時間攪拌を続けた。

【００３１】緩衝液の置換工程 上記工程で得られた懸濁液を１５℃、１８０００ｒｐｍ
の条件で３０分間遠心分離を行い上清を廃棄し、不溶性
担体に担持されていない抗体を取り除いた。次いで、
０．１重量％アジ化ナトリウム、及び１重量％牛血清ア
ルブミンを溶解したトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬ
で沈殿を再度溶解した。この工程を２回繰り返しＢＭＧ
抗体担持ラテックス試薬（以下、ＢＭＧ測定用試薬とい
う）を製造し、吸光度とＢＭＧ濃度との関係を求め、図
１に示した。

【００３２】実施例２ 実施例１においてＳＲＩＤ法による判定が低く、換算値
が０．８５である抗体を用いたこと以外は、実施例１と
同様にしてＢＭＧ測定用試薬を製造したものを、実施例
１と同様にして吸光度とＢＭＧ濃度との関係を求め、図
１に示した。

【００３３】比較例１ 実施例１においてＳＲＩＤ法による判定が高く、換算値
が０．６である抗体を用いたこと以外は、実施例１と同
様にしてＢＭＧ測定用試薬を製造したものを、実施例１
と同様にして吸光度とＢＭＧ濃度との関係を求め、図１
に示した。

【００３４】比較例２ 実施例１においてＳＲＩＤ法による判定が低く、換算値
が０．６である抗体を用いたこと以外は、実施例１と同
様にしてＢＭＧ測定用試薬を製造したものを、実施例１
と同様にして吸光度とＢＭＧ濃度との関係を求め、図１
に示した。

【００３５】評価 図１から分かるように、ＳＲＩＤ法による評価では力価
が異なるが換算値が等しい抗体を用いた測定用試薬（実
施例１及び２）は、ＳＲＩＤ法による評価では力価が高
く換算値が低い抗体を用いた測定用試薬（比較例１）や
ＳＲＩＤ法による評価では力価が低く換算値も低い抗体
を用いた測定用試薬（比較例２）と比較して感度が高
く、直線性も同様の形状であった。

【００３６】

【発明の効果】本発明の免疫学的測定試薬の製造方法
は、上述の構成からなるので、簡便かつ正確に、最適な
抗体又は抗原を用いて不溶性担体を用いた免疫学的測定
試薬を製造することが可能である。また、効率よく試薬
化条件を判定できるため、開発時間の短縮が可能とな
り、コスト削減につながる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１、２及び比較例１、２における吸光度
とＢＭＧ濃度との関係を示すグラフである。縦軸は吸光
度（実際の吸光度の測定値を１００００倍した値）を、
横軸はＢＭＧ濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質に対する抗体又は抗原を含有
   する緩衝液を用いる免疫学的測定試薬の製造方法であっ
   て、前記緩衝液を特定する諸項目のうち少なくとも１種
   について、免疫学的測定の最適条件を選定するにあた
   り、選定すべき項目についての条件を設定した系を用い
   て抗原抗体反応により生じる凝集度合い（Ｘ）を測定
   し、更に、選定すべき項目についての条件を設定しない
   系を用いて抗原抗体反応により生じる凝集度合い（Ｙ）
   を測定し、前記（Ｘ）及び前記（Ｙ）が、 （Ｘ）／（Ｙ）≧０．８ となったときの条件を当該項目についての最適条件とし
   て選定することを特徴とする免疫学的測定試薬の製造方
   法。
2. 【請求項２】 被測定物質に対する抗体又は抗原を含有
   する免疫学的測定試薬の製造方法であって、前記抗体又
   は抗原を選定するにあたり、（ａ）前記抗体又は抗原を
   担持させた不溶性担体を含有する緩衝液、（ｂ）陽性の
   被測定検体を含有する緩衝液、及び、（ｃ）被測定物質
   に対する選定すべき抗体又は抗原を含有する緩衝液を混
   合して抗原抗体反応により生じる凝集の度合い（Ａ）を
   測定し、更に、（ａ）前記抗体又は抗原を担持させた不
   溶性担体を含有する緩衝液、（ｂ）陽性の被測定検体を
   含有する緩衝液、及び、（ｃ′）被測定物質に対する選
   定すべき抗体又は抗原を含有しない緩衝液を混合して抗
   原抗体反応により生じる凝集の度合い（Ｂ）を測定し、
   前記（Ａ）及び前記（Ｂ）が、 （Ａ）／（Ｂ）≧０．８ となる抗体又は抗原を選定することを特徴とする免疫学
   的測定試薬の製造方法。