JPH10510053A - 粒子凝集検定系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 各級が予め決めた特定の狭い範囲の粒径に限定されており、各級の粒子がその級に特有な特異的反応物で被覆されている、微小なポリスチレンの回転楕円体形の粒子の少なくとも１つの級を使う、１種以上の被検体に対する液体試料の検定系。被覆した粒子と試料を混合し、特異的に反応させて粒子と存在する被検体との複合体を形成した後、予想される複合体の大きさに対して共振する周波数範囲にわたり掃引される音波のバーストで混合物を照射する。複合体すなわち被検体の存在は、複合体が共振する周波数の音波の選択的吸収を測定することにより、直接検出される。

Description

【発明の詳細な説明】 粒子凝集検定系 本発明は化学的および生化学的検定系に関し、更に詳しくは改良された粒子凝 集検定系に関する。発明の背景 １種以上の被検体を含む液体試験試料を、１種以上の試薬と高度に特異的な反 応で種々反応させ、抗原／抗体または類似の複合体のような被検体複合体を形成 し、これを観察することにより試料中の所定分子構造体すなわち被検体の存在に 関して試料を検定する検定法はよく知られている。典型的には抗体を使い、当該 抗体が特異的に誘導されて反応することが抗原の存在を検定するが、上記検定法 は、ハプテンや、ホルモン、アルカロイド、ステロイド、抗原、抗体、核酸、酵 素およびそれらのフラグメントといった他の分子を含む被検体を定量するための 他の特異的反応にも拡張されてきた。ここで使う”被検体”の用語は広い意味で 用いられ、その存在および／又は量についての検定が求められている、抗原、ハ プテン、抗体などの分子を含むと理解すべきである。従って、本発明の検定法は 、イムノアッセイ自体よりも広い応用をもつことが理解される。“特異的反応” の用語およびその変形用法は、抗原／抗体反応などのような、著しく高い特異性 を示す反応を指すと理解すべきである。 従来技術のかなりの主要部分は、ときにＰＡＣＩＡ系と呼ばれる、粒子凝集検 定法として知られる特定のイムノアッセイに関するものである。ＰＡＳＩＡ系に 関する多くの重要な研究は、ベルギーのグループにより行われ、たとえば、「粒 子計数イムノアッセイ（ＰＡＣＩＡ）Ｉ、抗体、抗原およびハプテンの検定の一 般的方法」、C.L．Cambiaso ら、J．Immuno．Meth.，18（1977）33−34；「粒子 計数イムノアッセイ（ＰＡＣＩＡ）II、リウマチ様血清の凝集活性の抑制による 循環免疫複合体の自動検定」、C.L．Cambiaso ら、J．Immuno．Meth.，23(1978) 29−50；「粒子計数イムノアッセイ（ＰＡＣＩＡ）III、マウス血清の凝集活性 の抑制による循環免疫複合体の自動検定」、C.L．Cambiasoら、J．Immuno．Meth .,28（1979）13−23および「粒子計数イムノアッセイIV、ポリスチレンラテック ス粒子に対する結合のためのＦ(ａｂ')₂フラグメントおよびＮ^∈−クロロアセチ ルリシンＮ−カルボキシ無水物の使用」、N．Limetら、J．Immuno．Meth.，28（ 1979）25−32に公表されている。米国特許４，４２７，７８１を含め、これらの 論文およびこの研究に基づく後の論文は、試料を凝集剤および反応物被覆ラテッ クス粒子と混合し、自動分析フォーマットで血液細胞を計数することが意図され ている型の光散乱式光学装置、たとえばＴｅｃｈｎｉｃｏｎ ＰＡＣＩＡシステ ム（Technicon International Division，Geneva，スイス）により、非凝集また は遊離のラテックス粒子を計数することを教示している。それらの論文の著者は 、これは種々の被検体の実際的な感度のよい測定を行うために特に適した技術だ と主張している。この方法は非凝集粒子を計数することにより間接的に凝集を測 定するから、検定で使われる粒子の最初の量を前もって知っておくことが必要で ある点に留意すべきである。従って、使う粒子の全数が始めから分かっていない ときは、この系は定性的検出に役立たない。更に、この系は一時に一つの被検体 の測定に限定されるから、速度と融通性に欠けている。 粒子凝集の測定に使われる２種類の光学的方法、比濁分析（nephelometry）お よび比濁法（turbidimetry）が、「指標を含まない免疫分析法」、E．Henkel，J ．Clin．Chem．Clin．Biochem.，22（1984）919−926で議論されており、この２ つの方法の多くの欠点を指摘している。 本発明の主目的は、凝集した粒子の存在および／又は量に関し直接の情報を与 える簡単で安価な系を提供することにより、上記従来技術の問題を克服する、改 良された検定系を提供するにある。本発明の他の目的は、１種以上の被検体の存 在を同一試料で定性的に検出できる上記系、検定される１種以上の被検体の存在 を実質上同時に検出できる上記系、および２乃至４の粒子から形成された凝集体 または複合体（以下それぞれ“ジグルチネート”、“トリグルチネート”などと する）を共振周波数の圧力波の吸収により容易に検出できる上記系を提供するに ある。本発明の他の目的は、その一部は明らかであり、一部は以後に現れる。発明の要約 上記および他の目的を果たすために、本発明は一般に、１以上の級に分けた微 小な実質上回転楕円体形の粒子を使う液体試料検定系であり、上記各級は特定の 狭い範囲の粒径だけに限定されることを特徴としている。各級の粒子は、それぞ れの被検体に特異的な反応物で前被覆される。被検体がたとえば試料溶液中に存 在するときは、各級の粒子は被検体と反応し、被検体が２以上の結合部位をもつ ときは、典型的には先ずジグルチネートまたはトリグルチネートのような複合体 を形成する。後者の存在は、複合体が共振する周波数の圧縮波の散乱、吸収等に よる選択的減衰により検出する。粒子に被覆した反応物が検定しようとする被検 体と同一であるときは、その被検体と特異的に反応できる試薬を導入して、粒子 上に結合して固定化された反応物と試料中の可動または遊離の被検体との間に結 合を与える。使う圧縮波は超音波が好ましく、望ましくは超音波エネルギー発生 器は超音波の減衰の変化を測定するためのセンサーとしても働く。 従って、本発明は、そのような構成、要素の結合、および部品の配置を有する 装置、および幾つかの工程およびそれらの工程の１以上の間の相互関係からなる 方法からなり、これらは全て次の詳細な開示で例示され、その適用範囲は請求の 範囲に示される。図面の簡単な説明 本発明の性質と目的を更によく理解するために、添付図面に関連した次の詳細 な説明を参照すべきである。 図１は、本発明の原理を具体化している検定系の、一部分断面にした模式図で ある。 図２は、本発明で使う被覆した粒子の拡大した模式図である。 図３は、凝集体の寸法に相当する共振吸収ピークを示すための、周波数を音強 度に対しプロットしたグラフである。図面の詳細な説明 図には、液体試料２０を検定する例示の系が示されており、試料溶液２０およ び検定法に使う試薬に対して実質上化学的に不活性である微小な（たとえば平均 径で、全体として約０．１μ乃至約５０μ、好ましくは約０．５μ乃至約１０μ の範囲）球形または回転楕円体形粒子２２の異なる狭い範囲の径の複数の級の少 なくとも１つを使うのが好ましい。粒子２２は、典型的には白色ポリスチレンラ テックスビーズ（Interfacial Dynamics Corp.，Seattle，WAから商業上入手で きる）であるが、他の重合体、ガラスなどから容易に作ることもできる。各級の 粒子は、明確な予め決めた狭い範囲の粒子径に限定されていることを特徴として おり、たとえば各級は典型的には０．２μの範囲内にあり、各級のそれぞれの粒 子はその級に特有である抗体のような少なくとも１つの反応物のさやまたはコー ト２６で被覆される。各級の粒子はまた、その級に特有である複数の型の反応物 で被覆することもでき、その複数の型の反応物の各々ははっきり区別できる被検 体と結合でき、相当する複合体を形成する。反応物は、抗体ばかりではなく、低 分子量ハプテン、抗原、酵素、および他の配位子と特徴的に高度に特異的な反応 をする他の生物学的および化学的受容体であることができる。 一つの特別の例では、１つの級が平均径２．０±０．１μをもち、他が平均径 ５±０．１μをもつ、２つの級の白色ポリスチレンラテックスビーズ２２に、各 々図２に示すようにそれぞれに特有のコート２６をする。たとえば、１群は抗原 、精製したｒＤＮＡポリペプチドＣＢｒ３（ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子から誘導さ れた組換え蛋白質）で被覆し、他の群は精製したｒＤＮＡポリペプチドＫ１（Ｈ ＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子から誘導された組換え蛋白質）で被覆する。ＨＩＶ−１ｅ ｎｖ蛋白質（ｇｐ４１およびｇｐ１２０）およびＨＩＶ−２ｅｎｖ蛋白質（ｇｐ ４１およびｇｐ１２０）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現した組換えＤＮＡおよ び全ての免疫的に検出できる細菌蛋白質を除くため精製したポリペプチドにより 提供される。蛋白質物質は疎水性ポリスチレン表面に容易に吸着されるから、蛋 白質を含む懸濁液または溶液に単に浸漬するだけで被覆された粒子が得られる。 勿論、抗体、抗原などで粒子を被覆するために共有結合のような他の技術が、従 来技術で広く報告されており、更にここで説明する必要はない。 上記の例示の被覆粒子を使用し、体液の試料２０に上記２群の被覆粒子を混合 することにより、血液のような体液のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を検定する。 この例の検定は、ＨＩＶのような抗原が、肝臓などのような組織は存在するが、 血清中では存在したとしても普通極めて低い濃度であり、一方抗体は血清中には るかに多く存在する場合に特に有用である。粒子２２上の抗原コーティング２６ は、試料２１中に正確に対応するウイルス抗体が存在すれば、これと特異的に反 応する。典型的には抗体は２以上の反応部位をもつから、初めはその抗体に対す る特異的抗原またはハプテンを被覆した１種以上の粒子に結合し、特異的に反応 して凝集体または複合体を形成する傾向がある。最終的にはより大きな複合体が 成長し、作られる傾向があるが、この凝集過程は、初めに形成される凝集体がジ グルチネート、トリグルチネートなどである点で速度に敏感である。 従って、上記のより小さな径の級の粒子は、当初約４μ乃至６μの主断面寸法 をもつ凝集体または複合体を形成する傾向があり、より大きな径の級の粒子は、 次いで当初１０μ乃至１５μの主断面寸法をもつ複合体を形成する傾向がある。 本発明では、４つの異なる級の被覆粒子でも容易に使用できる。この場合、他 の複合体または他の級の粒子と同一のまたはきわめて似た共振周波数をもつよう なジグルチネート、トリグルチネートのあり得る生成を避けるために、粒子の寸 法範囲を注意して選択する必要がある。 凝集は以下の実施例で示されるが、これらの実施例は単に１つの実施態様の例 として示すものであり、請求の範囲の本発明に制限を課する意図ではない。ヒト 甲状腺刺激ホルモン（以後ＴＳＨ）の検定に対しては、平均径１．６２μmの ポリスチレン球を、ｐＨ７．５の１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液中１００mg／mlの抗 ＴＳＨモノクローナル抗体の溶液中で一夜温置することにより、上記抗体で被覆 する。被覆した球を、短時間の遠心分離により回収し、０．１％(w/v)ＢＳＡお よび０．０１％ＮａＮ₃を含むｐＨ７．５の１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液４倍容量 で３回洗う。次いで回収した被覆球を、０．１％(w/v)ＢＳＡ、０．０１％Ｎａ Ｎ₃、３００mM ＮａＩを含むｐＨ９．３の２０mM グリシン緩衝液に懸濁し、 試薬を形成する。この試薬中の単一球の初期濃度は、約５×１０⁷個／mLである 。製造およびコーティング工程の結果、未反応試薬中に存在するジグルチネート は、典型的には初期単一球濃度の約２％である。次いでこの試薬を、既知濃度の ヒトＴＳＨを含む標準ヒト血清（OEM Concepts，Inc.，Toms River，N.J.）の等 容量に加え、絶えずかきまぜて、被覆した球とヒトＴＳＨを反応させる。混合は 撹拌なしでも達成できる。粒子と被検体との間の特異的反応の開始後、最初の数 秒間の本発明の装置による反応混合物の試料採取は、製造およびコーティング工 程により作られたものより十分過剰のジグルチネート、トリグルチネートの存在 を検出した。 含まれる寸法の粒子の共振が予想される周波数範囲にわたって典型的に掃引さ れる超音波のような圧縮波のフラックスで、体液２０と粒子２２との反応した混 合物全体に音波をかけるため、源３０のような手段を備える。使う周波数の範囲 は、試料媒体のバルクを通る圧縮波の伝搬速度に依存することは明らかであり、 伝搬速度自体は温度、圧力、密度のような因子に依存する。そこで、第１の級の 粒子の予想される２および３粒子の複合体の断面寸法４μおよび６μ、および第 ２の級の粒子の同様な集団または複合体の断面寸法１０μ乃至１５μの値を例と して用いると、常圧、２５℃、海水に近い密度の液体試料では、その媒体中での 圧縮波の公称速度は約１５３０ｍ／秒になるから、これら複合体と共振する波長 に相当する周波数は約１００MHz乃至５００MHzの範囲にあるであろう。凝集した 粒子は典型的には非対称であるから、吸収される共振周波数は必ずしも狭い範 囲に規定された周波数バンド内にはない。系は全く温度に敏感であるから、検定 中試料溶液の温度を固定した予め決めた水準に保つために、３２に模式的に示し た既知の温度制御装置を備えるのが好ましい。好ましくは、超音波を源３０から バーストでかけ、それぞれ所望の周波数範囲を通し掃引し、好ましくは同一変換 器で放送し聴取するので、各凝集複合体は、入力波バーストの特徴的周波数バン ドを共振吸収でき、または掃引範囲内の圧縮波の特性を変化させることができる 。検定を妨害する可能性があるはるかに大きな凝集体塊の形成前に、ジグルチネ ートおよびトリグルチネートの存在を検出するため、粒子と被検体との特異的反 応の開始後の最初の数秒間だけ測定をするのが好ましい。各々の級がジグルチネ ートおよびトリグルチネートに特有な寸法をもつ、４つの異なる級の粒子では、 掃引された周波数バンド全体にわたって、吸収ピーク中心間に約２５MHzの分離 を与える１２の共振周波数があり得ることが理解される。４粒子より大きい凝集 体に関する共振データを得る試みは、著しく複雑となる傾向があるから、本検定 は、凝集反応の早期もしくは初期段階で形成された比較的小さな凝集体の測定に 限定するのが好ましい。粒子２２の凝集体による、典型的には共振吸収による減 衰の度合いは、とりわけ、粒子２２の密度と周りの媒体の密度の差に依存する。 たとえば、粒子と媒体の密度が近いときは、粒子の共振は著しく弱められ、鋭い 共振吸収ピークは観察されない。そこで、周囲の支持液媒体とは密度が少なくと も１０％の差をもつ粒子を使うのが好ましい。粒子２２の凝集体の共振吸収ピー クは、音波変換器または別のマイクロホン３４により容易に検出でき、その出力 は適当な信号処理装置またはチャート記録計などのような表示装置３６に連結す るのが好ましい。たとえば、入超音波が１００乃至５００MHzの全範囲にわたり 平らなスペクトルをもつときは、凝集反応の開始後１０乃至１５秒内にとられ、 チャート記録計３６に表示される図３に示したような、出力中に吸収ピークがあ ろう。図３に示したそのような各ピークは、特定の２または３粒子複合体に関連 づけられる共振構造を示すものである。 上記のように、本発明は、複数の、好ましくは４までの異なる被検体を同時に 検定するのに容易に役立つ。たとえば、各級が当然にその特有の予め決められた 狭い範囲の粒径に限定された、複数の級の微小な粒子２２を提供できる。そのよ うな各級の粒子を、高い特異性をもって反応することのできる相当する異なる反 応物で前被覆する。たとえば、４つの級をそれぞれ、前記のＨＩＶ−１およびＨ ＩＶ−２ポリペプチド、並びにＨＶＡ（肝炎ウイルスＡ）およびＨＶＢ（肝炎ウ イルスＢ）蛋白質コート物質で被覆できる。次いで、４つの被覆した級を、検定 しようとする試料溶液と同時に混合して、各々抗原コーティングの１つを含む複 数の特異的反応をさせる。超音波バーストで掃引するとき、得られる共振吸収の 記録は、どの凝集体が形成されたかを示し、含まれる特定の抗原に容易に関連づ けることができる。試料に関連した、凝集により生じたものではない共振を示す バックグラウンドスペクトルを得るために、被覆した粒子２２を導入する前に、 試料２０を前掃引するのが好ましい。校正試験溶液中で既知の被検体に対し予め 決めた級の粒子で系を前校正し、実験的にどのピークが特定の凝集体に相当する かを同定しておくことにより、特定の凝集体により記録に現れるピークの相関は 容易に遂行できる。 本発明は、検定しようとする被検体と、粒子上に被覆された試薬との間の直接 の特異的反応による凝集体の形成を意図している。たとえば、抗原物質を粒子に 被覆するときは、後者は試料液に存在する抗体と特異的に反応して、凝集体を形 成する。逆に、抗体を粒子に被覆し、試料液中の抗原と直接に特異的反応をさせ るときも、類似の結果が起こる。または、本発明は、サンドイッチ検定、競合検 定などのような既知の間接型検定にも応用でき、この場合には、初期凝集体の寸 法は異なる可能性がある。たとえば、典型的なサンドイッチ検定では、粒子を検 定しようとする試料溶液中のものと同一の抗体で被覆する。この検定は、溶液中 の遊離の抗体と粒子に結合した抗体の両者と特異的に反応する抗原のような結合 剤を添加することを必要とし、直接の抗体／抗原反応で得られる凝集体とは異な る寸法の凝集体を生成する。 本発明の範囲から逸脱することなく、上記方法および装置においてある種の変 形を行えるから、上の説明に含まれ添付図面に示される全ての内容は、例示とし て解釈すべきであって、限定の意味で解釈すべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウォン，ウィリアム アメリカ合衆国．02173 マサチューセッ ツ，ミルトン，ランドルフ アヴェニュー 1041 (72)発明者 シュエ，チェン アメリカ合衆国．01970 マサチューセッ ツ，セイラム，ヘリング ドライヴ ナン バー35 ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．予め決められた狭い範囲の粒径に限定された少なくとも１つの級の、微 小な実質上回転楕円体形の、高い特異性でもって反応できる反応物で被覆された 粒子と、液体試料中に存在する被検体との上記反応により、２乃至４個の上記粒 子からなる複合体を初期に形成するように、上記反応物被覆粒子と上記試料を混 合する手段と、上記複合体が音波を減衰する周波数の範囲の音波で上記複合体を 照射する手段と、上記複合体による上記周波数範囲内の周波数の選択的減衰を検 出する手段とからなる、被検体に対する液体試料の検定装置。 ２．当該減衰が、当該複合体による当該音波の共振吸収によるものである、 請求の範囲１記載の液体試料の検定装置。 ３．当該反応物が当該それぞれの被検体型と特異的に反応できる、請求の範 囲１記載の液体試料の検定装置。 ４．当該反応物が当該被検体と同一かまたはその特定の類似体であり、当該 系が当該反応物と当該試料中の当該被検体とを結合させるため、当該被検体と特 異的に反応できる試薬を含んでいる、請求の範囲１記載の液体試料の検定装置。 ５．当該反応物が当該被検体に対する抗体である、請求の範囲３記載の液体 試料の検定装置。 ６．当該被検体が当該反応物に対する抗体である、請求の範囲３記載の液体 試料の検定装置。 ７．当該被検体がホルモン、アルカロイド、ステロイド、ハプテン、抗原、 抗体、核酸、酵素およびそのフラグメントからなる群から選ばれる、請求の範囲 １記載の液体試料の検定装置。 ８．当該狭い範囲の粒径が直径で約０．５１ 乃至約１０μの広い範囲内に ある、請求の範囲１記載の液体試料の検定装置。 ９．当該照射手段が超音波源からなる請求の範囲１記載の液体試料の検定装 置。 １０．当該源が約１００乃至５００MHzの周波数範囲にわたって当該超音波の 掃引を与えるように操作できる、請求の範囲９記載の液体試料の検定装置。 １１．当該源が当該粒子による当該超音波の減衰を検出するためのマイクロホ ンとして操作できる、請求の範囲９記載の液体試料の検定装置。 １２．複数の当該級を含み、当該各級の粒子は、その級に特有であって異なる 被検体と結合可能である相当する複合体を形成する反応物で被覆される、請求の 範囲１記載の液体試料の検定装置。 １３．複数の当該級を含んでおり、当該各級の粒子はその級に特有な複数の型 の反応物で被覆されており、上記複数の型の反応物の各々ははっきりと区別でき る被検体と結合可能である相当する複合体を形成する、請求の範囲１記載の液体 試料の検定装置。 １４．当該選択的吸収を検出する手段が、当該音波が当該粒子と試料の混合物 を横切った後、その音波を検出するように配置されたマイクロホン手段からなる 、請求の範囲２記載の液体試料の検定装置。 １５．当該検出手段が、更に当該マイクロホン手段の出力の結合したスペクト ル分析器を含んでいる、請求の範囲１４記載の液体試料の検定装置。 １６．当該検出手段が、更に当該共振複合体による当該周波数範囲内の当該周 波数の選択的吸収に相当する吸収ピークのスペクトルを表示する手段を含んでい る、請求の範囲１４記載の液体試料の検定装置。 １７．少なくとも１つの級の微小な実質上回転楕円体形の粒子の複数を、特異 的に反応できる試薬で被覆し、上記試薬と少なくとも１つの型の被検体とを含む 特異的反応を行わせて上記粒子の複合体を形成するように、上記の試薬で被覆し た粒子と液体試料を混合し、上記複合体を含む混合物に上記複合体が共振する周 波数の音波を導入し、上記複合体による上記音波の減衰の関数として上記複合体 の存在を検出することからなる、液体試料中の少なくとも１つの型の被検体の検 定法。 １８．当該減衰が、共振周波数における当該複合体による当該音波の選択的吸 収による、請求の範囲１７記載の方法。 １９．４つまでの複数の当該級の微小な実質上回転楕円体形の粒子を用意し、 上記級の各々が特有の予め決めた狭い範囲の粒径に限定されており、上記級の各 々の粒子を高い特異性でもって反応できる相当する異なる反応物で被覆し、各々 上記試薬の１つと相当する型の被検体を含む複数の特異的反応を行わせて上記粒 子の複合体を形成するように、上記の試薬で被覆した粒子と当該試料との同時混 合物を形成することからなる、請求の範囲１７記載の方法。