JP2011516850A - 化学物質検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化学物質の検出方法、特に、圧/焦電変換器を有する化学物質検出装置を使用するイムノアッセイに関する。
イムノアッセイは、体液中の被分析物の存在、すなわち、より一般的には濃度を測定する試験である。イムノアッセイは、一般に抗原と抗体との特異的結合を伴う。この抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体には製造の再現性や一つのエピトープと被分析物との結合の束縛などいくつかの利益がある。被分析物の濃度の定量化可能な指標を与えるために、反応を既知濃度の標準サンプルと比較する。抗体または抗原の濃度は様々な方法によって決定し得るが、最も一般的な方法の一つが、抗原または抗体のいずれかを標識し、その標識の存在を検出することである。
(i)焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、その変換器上に固定化された第1の試薬とを準備する工程(第1の試薬が被分析物またはその被分析物の誘導体の存在下で第2の試薬と結合することが可能な結合部位を有する)、
(ii)電磁放射線を吸収して無放射性崩壊(non-radiative decay)によりエネルギーを発生することが可能な標識を有する、被分析物またはその誘導体の存在下で第1の試薬と結合することが可能な結合部位を有する第2の試薬を導入する工程(第1の試薬または第2の試薬のいずれかが、被分析物またはその誘導体と結合することが可能である)、
(iii)その変換器にサンプルを曝露し、それによって被分析物またはその誘導体を第1の試薬または第2の試薬のいずれかと結合させる工程、
(iv)被分析物またはその誘導体と同じ第1の試薬または第2の試薬と結合し、それによって第1の試薬と第2の試薬との結合を妨げることが可能なマスキング試薬を導入する工程、
(v)そのサンプルに電磁放射線を照射する工程、
(vi)発生したエネルギーを電気信号へ変換する工程、および
(vii)その電気信号を検出する工程
を含み、工程(ii)〜工程(iv)がいかなる順序でも起こり得る方法を提供する。
活性ピエゾ/パイロフィルムバイオセンサーの調製
次の実施例において検出装置として使用する、酸化インジウムスズで被覆した、分極した圧電性ポリフッ化ビニリデン(PVDF)バイモルフフィルムを低湿度環境においてポリスチレン溶液(トルエン中1%)により浸漬被覆して、酸化インジウムスズの上にポリスチレン層を施した。次いで、これをポリストレプトアビジン溶液(PBS中200μg/mL−10mmol/Lリン酸バッファー、pH7.5、2.7mmol/L KCl、137mmol/L NaCl、および0.05%Tweenを含有する)中で、室温で一晩のインキュベーションにより被覆した。Tischerらによる米国特許第5,061,640号公報に記載されている通り、ポリストレプトアビジンを調製した。
リポーターコンジュゲートの調製
本質的にはVan Doomらによる米国特許第5,641,689号公報に記載されている通りに、炭素標識リポーターコンジュゲートを調製した。抗体被覆リポーターコンジュゲート(C2)を調製するために、5mmol/Lリン酸バッファー、pH6.2中、1mLのSpecial Black-4 RCCの名目上150nmの炭素粒子(Degussa, Essen, Germany)を200μg/mLポリストレプトアビジン溶液とともに室温で一晩振盪しながらインキュベートし、結果としてストレプトアビジン被覆表面を得た。得られた炭素コンジュゲートを(遠心分離、ペレット化および再懸濁により)洗浄した。次いで、このストレプトアビジン被覆炭素粒子懸濁液1mLとともにPBS中10μg/mLのビオチン化二次モノクローナル抗体(M2)(抗テストステロン捕捉抗体(M1)源として用いる抗体種と反応する)を一晩振盪しながらインキュベートした。得られた炭素コンジュゲート(C2)をpH8.5の0.05mol/Lホウ酸バッファーを用いて(遠心分離、ペレット化および再懸濁により)3回洗浄し、このバッファー中、暗所4℃で保存した。明確にするために、抗テストステロン抗体(M1)がモノクローナルマウス抗体であった場合には、二次モノクローナル抗体(M2)は完全無傷マウス抗体(いわゆる「ヤギ抗マウス抗体」)と反応するように作製されたヤギ抗体であった。当然、任意の他の種対も、モノクローナルでもポリクローナルでも用いることができ、当業者には周知であろう。
マスキング試薬の調製
抗原被覆マスキング試薬(MR1)を調製するために、5mmol/Lリン酸バッファー、pH6.2中1mLのストレプトアビジン被覆ポリスチレンラテックス粒子(名目上直径23nm)、Bangs Laboratories P/N PS02N/8192(Bangs laboratories Inc, Fishers IN, USA)を30nmol/Lの7α−C6−ビオチン化テストステロン(Luppaら(Clin. Chem. 1997, 43, 2345)に記載の通りに調製したもの)とともに室温で一晩振盪しながらインキュベートした。得られたコンジュゲートを、上記のようにpH8.5の0.05mol/Lホウ酸バッファーで3回洗浄し、このバッファー中、暗所4℃で保存した。
マスキングを施した抗体被覆フィルムの調製
マスキングを施したピエゾフィルム表面(C3)を調製するために、1枚の抗体被覆ピエゾフィルム(C1、上記)を、抗原被覆マスキング試薬(MR1上記)とともにPBS中で室温で一晩インキュベートした後、過剰のPBSで洗浄し、Stabilcoat (SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)で被覆し、その後40℃で乾燥させた。
アッセイ−抗体被覆ピエゾ/パイロフィルムセンサーおよびマスキング試薬
図3で示されるように、センサー1を作製して、このアッセイを実施した。センサー1は、1枚の抗体被覆ピエゾフィルム3(C3、上記)と、1枚の透明なポリカーボネート蓋材フィルム14とから作製する。これらのフィルムは、1枚の粘着ポリエステルフィルムダイカットからなるスペーサー15を用いおよそ500μmの距離をおいて配置して、大きさの異なる二つのチャンバー16,17を形成する、アッセイ反応用のおおよその寸法30x10x0.5mmの一つのチャンバー16および対照反応用の寸法10x10x0.5mmの小さい方の第2のチャンバー17。発生した電荷を検出するためにピエゾフィルムの上面および底面への電気接続を可能にするようになっている。
Claims (41)
- サンプル中の被分析物の検出方法であって、
(i)焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、その変換器上に固定化された第1の試薬とを準備する工程(第1の試薬が被分析物またはその被分析物の誘導体の存在下で第2の試薬と結合することが可能な結合部位を有する)、
(ii)電磁放射線を吸収して無放射性崩壊によりエネルギーを発生することが可能な標識を有する、被分析物またはその誘導体の存在下で第1の試薬と結合することが可能な結合部位を有する第2の試薬を導入する工程(第1の試薬または第2の試薬のいずれかが、被分析物またはその誘導体と結合することが可能である)、
(iii)その変換器にサンプルを曝露し、それによって被分析物またはその誘導体を第1の試薬または第2の試薬のいずれかと結合させる工程、
(iv)被分析物またはその誘導体と同じ第1の試薬または第2の試薬と結合し、それによって第1の試薬と第2の試薬との結合を妨げることが可能なマスキング試薬を導入する工程、
(v)そのサンプルに電磁放射線を照射する工程、
(vi)発生したエネルギーを電気信号へ変換する工程、および
(vii)その電気信号を検出する工程
を含み、工程(ii)〜工程(iv)がいかなる順序でも起こり得る、方法。 - 前記第1の試薬および第2の試薬が抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記マスキング試薬が、前記第1の試薬と結合することが可能な複数の部位を有する高分子である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記高分子の部位が、前記被分析物またはその誘導体と同じ化学構造を有する部分である、請求項3に記載の方法。
- 前記変換器の前記サンプルへの曝露の前に前記マスキング試薬が前記第1の試薬または第2の試薬と解離可能に結合されているものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マスキング試薬を前記サンプルと実質的に同時に導入する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マスキング試薬が前記第1の試薬または第2の試薬と可逆的に結合するものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識が、炭素粒子、着色ポリマー粒子、色素分子、酵素、蛍光分子、金属(例えば、金)粒子、ヘモグロビン分子、磁性粒子、非導電性コア材料および少なくとも一つの金属シェル層を有するナノ粒子、赤血球、およびそれらの組合せから選択されるものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の試薬が前記変換器に吸着されているものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の試薬が前記変換器と共有結合されているものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変換器がサンプルチャンバー内に設置されているものである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記チャンバーがウェルである、請求項11に記載の方法。
- 前記変換器が前記チャンバーと一体となっているものである、請求項11または12に記載の方法。
- 前記サンプルが浮遊粒子を含むものである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが全血である、請求項14に記載の方法。
- 前記放射線源が、一連の電磁放射線パルスを生成するように構成され、前記検出器が、前記放射線源からの各電磁放射線パルスと、前記電気信号の発生との間の時間遅延を決定するように構成されるものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルを前記変換器に曝露する工程と、前記サンプルを照射する工程との間に前記変換器から前記サンプルを取り出すこと無しに実施される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- (i)サンプル中の被分析物の検出装置において、焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、その変換器上に固定化された第1の試薬とを有し、第1の試薬が被分析物またはその被分析物の誘導体の存在下で第2の試薬と結合することが可能な結合部位を有する装置、(ii)電磁放射線を吸収して無放射性崩壊によりエネルギーを発生することが可能な標識を有する、被分析物またはその誘導体の存在下で第1の試薬と結合することが可能な結合部位を有する第2の試薬、および(iii)被分析物またはその誘導体と同じ第1の試薬または第2の試薬と結合し、それによって第1の試薬と第2の試薬との結合を妨げることが可能なマスキング試薬を含む、キット。
- 前記第1の試薬および第2の試薬が抗体である、請求項18に記載のキット。
- 前記マスキング試薬が、前記第1の試薬と結合することが可能な複数の部位を有する高分子である、請求項18または19に記載のキット。
- 前記高分子の部位が、前記被分析物またはその誘導体と同じ化学構造を有する部分である、請求項20に記載のキット。
- 前記変換器の前記サンプルへの曝露の前に前記マスキング試薬が前記第1の試薬または第2の試薬と解離可能に結合されているものである、請求項18〜21のいずれか一項に記載のキット。
- 前記マスキング試薬が、前記第1の試薬または第2の試薬と可逆的に結合するものである、請求項18〜22のいずれか一項に記載のキット。
- 前記標識が、炭素粒子、着色ポリマー粒子、色素分子、酵素、蛍光分子、金属(例えば、金)粒子、ヘモグロビン分子、磁性粒子、非導電性コア材料および少なくとも一つの金属シェル層を有するナノ粒子、赤血球、およびそれらの組合せから選択されるものである、請求項18〜23のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の試薬が前記変換器に吸着されているものである、請求項18〜24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の試薬が前記変換器と共有結合されているものである、請求項18〜24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記装置がサンプルチャンバーをさらに含んでなり、前記変換器が前記サンプルチャンバー内に設置されているものである、請求項18〜26のいずれか一項に記載のキット。
- 前記チャンバーがウェルである、請求項27に記載のキット。
- 前記変換器が前記チャンバーと一体となっているものである、請求項27または28に記載のキット。
- 前記放射線源が、一連の電磁放射線パルスを生成するように構成され、前記検出器が、前記放射線源からの各電磁放射線パルスと、前記電気信号の発生との間の時間遅延を決定するように構成されるものである、請求項18〜29のいずれか一項に記載のキット。
- サンプル中の被分析物の検出装置であって、焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、その変換器上に固定化された第1の試薬(第1の試薬は、被分析物またはその被分析物の誘導体と結合することが可能であり、かつ被分析物またはその被分析物の誘導体の存在下で第2の試薬と結合することが可能な結合部位を有する)と、第1の試薬と解離可能に結合したマスキング試薬と、電磁放射線源と、その電気信号を検出するための検出器とを含む、装置。
- 前記第1の試薬が抗体である、請求項31に記載の装置。
- 前記マスキング試薬が、前記第1の試薬と結合することが可能な複数の部位を有する高分子である、請求項31または32に記載の装置。
- 前記高分子の部位が、前記被分析物またはその誘導体と同じ化学構造を有する部分である、請求項33に記載の装置。
- 前記第1の試薬が前記変換器に吸着されているものである、請求項31〜34のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第1の試薬が前記変換器と共有結合されているものである、請求項31〜34のいずれか一項に記載の装置。
- サンプルチャンバーをさらに含んでなり、前記変換器が前記サンプルチャンバー内に設置されているものである、請求項31〜36のいずれか一項に記載の装置。
- 前記チャンバーがウェルである、請求項37に記載の装置。
- 前記変換器が前記チャンバーと一体となっているものである、請求項37または38に記載の装置。
- 前記放射線源が、一連の電磁放射線パルスを生成するように構成され、前記検出器が、前記放射線源からの各電磁放射線パルスと、前記電気信号の発生との間の時間遅延を決定するように構成される、請求項31〜39のいずれか一項に記載の装置。
- 選択的抗体免疫測定法において結合事象を検出するための、焦電または圧電素子および電極を含む変換器の使用。
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