JP5442713B2 - 化学物質検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、化学物質の検出方法、特に、圧/焦電変換器を有する化学物質検出装置を使用するイムノアッセイに関する。
イムノアッセイは、体液中の被分析物の存在、すなわち、より一般的には濃度を測定する試験である。イムノアッセイは、一般に抗原と抗体との特異的結合を伴う。この抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体には製造の再現性や一つのエピトープと被分析物との結合の束縛などいくつかの利益がある。被分析物の濃度の定量化可能な指標を与えるために、反応を既知濃度の標準サンプルと比較する。抗体または抗原の濃度は様々な方法によって決定し得るが、最も一般的な方法の一つが、抗原または抗体のいずれかを標識し、その標識の存在を検出することである。
焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、その変換器上に固定化された第1の試薬と、電磁放射線を吸収して無放射性崩壊(non-radiative decay)によりエネルギーを発生することが可能な標識を有する、第1の試薬と解離可能に結合した第2の試薬とを準備する工程(第1の試薬または第2の試薬のいずれかが、他方との結合を可能にし、かつ被分析物またはその被分析物の誘導体と優先的に結合することが可能な結合部位を有する)、
変換器をサンプルに曝露し、それによって被分析物またはその被分析物の誘導体を結合部位と結合させ、第2の試薬を置換する工程、
そのサンプルに電磁放射線を照射する工程、
発生したエネルギーを電気信号へ変換する工程、および
その電気信号を検出する工程
を含む方法を提供する。
焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、
その変換器上に固定化された第1の試薬と、
電磁放射線を吸収して無放射性崩壊によりエネルギーを発生することが可能な標識を有する、第1の試薬と解離可能に結合した第2の試薬(ここで、第1の試薬または第2の試薬のいずれかは、他方との結合を可能にしかつ被分析物またはその被分析物の誘導体と優先的に結合することが可能な結合部位を有する)と、
電磁放射線源と、
その電気信号を検出するための検出器と
を含む装置も提供する。
活性ピエゾ/パイロフィルムバイオセンサーの調製
次の実施例において検出装置として使用する、酸化インジウムスズで被覆した、分極した圧電性ポリフッ化ビニリデン(PVDF)バイモルフフィルムを低湿度環境においてポリスチレン溶液(トルエン中1%)により浸漬被覆して、酸化インジウムスズの上にポリスチレン層を施した。次いで、これをポリストレプトアビジン溶液(PBS中200μg/mL−10mmol/Lリン酸バッファー、pH7.5、2.7mmol/L KCl、137mmol/L NaCl、および0.05%Tweenを含有する)中で、室温で一晩のインキュベーションにより被覆した。Tischerらによる米国特許第5,061,640号公報に記載されている通り、ポリストレプトアビジンを調製した。
炭素標識リポーターコンジュゲートの調製
本質的にはVan Doomらによる米国特許第5,641,689号公報に記載されているとおりに、炭素標識リポーターコンジュゲートを調製した。抗体被覆リポーターコンジュゲート(R1)を調製するために、5mmol/Lリン酸バッファー、pH6.2中1mLのSpecial Black-4 RCCの名目上150nmの炭素粒子(Degussa, Essen, Germany)を200μg/mLポリストレプトアビジン溶液とともに室温で一晩振盪しながらインキュベートし、結果としてストレプトアビジン被覆表面(A1)を得た。得られた炭素コンジュゲートを(遠心分離、ペレット化および再懸濁により)洗浄した 次いで、このストレプトアビジン被覆炭素粒子懸濁液1mLとともにPBS中10μg/mLのビオチン化抗テストステロン(HyTest Ltd, Turku, Finland, カタログ番号2T2−ビオチン、またはAccurate Chemical Co, Westbury, New York, USA, カタログ番号BHS113)を一晩振盪しながらインキュベートした。得られた炭素コンジュゲートをpH8.5の0.05mol/Lホウ酸バッファーを用いて(遠心分離、ペレット化および再懸濁により)3回洗浄し、このバッファー中、暗所4℃で保存した。抗原被覆リポーター(R2)を調製するために、5mmol/Lリン酸バッファー、pH6.2中、1mLのストレプトアビジン被覆炭素粒子(A1)を30nmol/Lの7α−C6−ビオチン化テストステロン(Luppa et al. Clin. Chem. 1997, 43, 2345に記載のとおり調製したもの)とともに室温で一晩振盪しながらインキュベートした。得られた炭素コンジュゲートを、上記のようにpH8.5の0.05mol/Lホウ酸バッファーで3回洗浄し、このバッファー中、暗所4℃で保存した。
金標識リポーターコンジュゲートの調製
本質的にはFrens G. Nature 1973, 241, 20-22またはRoth J. The colloidal gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry. In Bullock GR, Petrusz P, eds. Techniques in immunocytochemistry, Vol 2. New York, NY, Academic Press, 1983, 216-284に記載されているとおりに、金標識リポーターコンジュゲートを調製した。抗体被覆リポーターコンジュゲート(R3)を調製するために、5mmol/Lリン酸バッファー、pH6.2中、1mLの単分散の名目上150nmの金粒子(BBI International, Cardiff, UK)を200μg/mLストレプトアビジン溶液とともに室温で一晩振盪しながらインキュベートし、結果としてストレプトアビジン被覆表面(A2)を得た。得られた金コンジュゲートを(遠心分離、ペレット化および再懸濁により)洗浄した。次いで、このストレプトアビジン被覆金粒子懸濁液1mLとともにPBS中、10μg/mLのビオチン化抗テストステロン(HyTest Ltd, Turku, Finland, カタログ番号2T2−ビオチン、またはAccurate Chemical Co, Westbury, New York, USA, カタログ番号BHS113)を一晩振盪しながらインキュベートした。得られた金コンジュゲートをpH8.5の0.05mol/Lホウ酸バッファーを用いて(遠心分離、ペレット化および再懸濁により)3回洗浄し、このバッファー中、暗所4℃で保存した。抗原被覆リポーター(R4)を調製するために、5mmol/Lリン酸バッファー、pH6.2中、1mLのストレプトアビジン被覆金粒子(A2)を30nmol/Lの7α−C6−ビオチン化テストステロン(Luppa et al. Clin. Chem. 1997, 43, 2345に記載のとおり調製したもの)とともに室温で一晩振盪しながらインキュベートした。得られた金コンジュゲートを、上記のようにpH8.5の0.05mol/Lホウ酸バッファーで3回洗浄し、このバッファー中、暗所4℃で保存した。
試薬被覆抗体被覆フィルムの調製
試薬被覆抗体被覆ピエゾフィルム表面を調製するために、1枚の抗体被覆ピエゾフィルム(C1、上記)を、抗原被覆炭素試薬(R2)または抗原被覆金試薬(R4)(上記参照)のいずれかとともにPBS中で室温で一晩インキュベートした後、過剰のPBSで洗浄し、Stabilcoat (SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)で被覆し、その後40℃で乾燥させ、それぞれ、炭素試薬被覆反応表面(C3)または金試薬被覆反応表面(C4)を得た。
試薬被覆抗原被覆フィルムの調製
試薬被覆抗原被覆ピエゾフィルム表面を調製するために、1枚の抗原被覆ピエゾフィルム(C2、上記)を、抗体被覆炭素試薬(R1)または抗体被覆金試薬(R3)(上記参照)のいずれかとともにPBS中で、室温で一晩インキュベートした後、過剰のPBSで洗浄し、Stabilcoat (SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)で被覆し、その後40℃で乾燥させ、それぞれ、炭素試薬被覆反応表面(C5)または金試薬被覆反応表面(C6)を得た。
アッセイ:試薬被覆ピエゾフィルムセンサー、炭素標識、単純「拡散」アッセイ
図5で示されるように、センサー1を作製して、このアッセイを実施した。センサー1は、1枚の抗体被覆ピエゾフィルム3(C3またはC5、上記)と、1枚の透明なポリカーボネート蓋材フィルム14とから作製する。これらのフィルムは、粘着ポリエステルフィルムダイカットのスペーサー18ピースを用いおよそ500μmの距離をおいて配置して、大きさの異なる二つのチャンバー19,20を形成する、アッセイ反応用のおおよその寸法30x10x0.5mmの一つのチャンバーおよび対照反応用の寸法10x10x0.5mmの小さい方の第2のチャンバー20。発生した電荷を検出するためにピエゾフィルムの上面および底面への電気接続を可能にするようになっている。
アッセイ:試薬被覆ピエゾフィルムセンサー、金標識、「重力支援拡散」アッセイ
このアッセイを実施するために、実施例6に記載したとおりにサンプルチャンバーを作製する(C4またはC6、上記)。このアッセイは、ピエゾフィルムをチャンバーの上面のピエゾフィルムに水平に向けること以外は実施例6と同様に計画する。そこで、チョップトLEDライトを用いて四つのLED(より大きな金標識を検出するのに好適な波長、名目上625nm、WO2007/107716号公報参照)で連続的にピエゾフィルムに照射し、そのうちの三つのLEDはアッセイチャンバーの表面の異なる領域に照射し、一つのLEDは対照チャンバーのピエゾフィルム表面に照射する。各LEDパルスについて、ロックイン増幅器およびアナログ・デジタル(ADC)コンバーターを使用してピエゾフィルムを通した電圧を測定する。ADC信号を経時的にプロットし、テストステロン濃度とADC数/分との関係を図7に示す。信号の変化だけを示すように反応開始時点のデータを目盛ゼロに合わせた。
Claims (28)
- サンプル中の被分析物の検出方法であって、
焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、その変換器上に固定化された第1の試薬と、電磁放射線を吸収して無放射性崩壊によりエネルギーを発生することが可能な標識とを有する、第1の試薬と解離可能に結合した第2の試薬とを準備する工程(第1または第2の試薬のいずれかが、他方との結合を可能とし、かつ被分析物またはその被分析物の誘導体と優先的に結合することが可能な結合部位を有する)、
変換器をサンプルに曝露し、それによって被分析物またはその被分析物の誘導体を結合部位と結合させ、第2の試薬を置換する工程、
そのサンプルに電磁放射線を照射する工程、
発生したエネルギーを電気信号へ変換する工程、および
その電気信号を検出する工程
を含む、方法。 - 前記変換器が二つの側壁、上面、および下面を有するサンプルチャンバー内に設置されているものである、請求項1に記載の方法。
- 前記変換器が前記チャンバーの側壁の一つを形成しているものである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記変換器が前記チャンバーの上面を形成し、前記第2の試薬が前記サンプルの媒質より密度が高いものである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記変換器が前記チャンバーの下面を形成し、前記第2の試薬が前記サンプルの媒質より密度が低いものである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の試薬が固定化された抗体であり、前記第2の試薬が標識被分析物である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の試薬が固定化された被分析物であり、前記第2の試薬が標識抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変換器が、前記変換器上の防腐被膜、第1の試薬、および第2の試薬をさらに含んでなるものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識が、炭素粒子、着色ポリマー粒子、色素分子、酵素、蛍光分子、金属(例えば、金)粒子、ヘモグロビン分子、磁性粒子、非導電性コア材料および少なくとも一つの金属シェル層を有するナノ粒子、赤血球、およびそれらの組合せから選択されるものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の試薬が前記変換器に吸着されているものである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが浮遊粒子を含むものである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが全血である、請求項11に記載の方法。
- 前記放射線源が、一連の電磁放射線パルスを生成するように構成され、前記検出器が、前記放射線源からの各電磁放射線パルスと、前記電気信号の発生との間の時間遅延を決定するように構成される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルを前記変換器に曝露する工程と、前記サンプルを照射する工程との間に前記変換器から前記サンプルを取り出すこと無しに実施される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の試薬および第2の試薬が、存在する唯一の試薬である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の被分析物の検出装置であって、
焦電または圧電素子および電極を有する、エネルギー変化を電気信号へ変換することが可能な変換器と、
その変換器上に固定化された第1の試薬と、
電磁放射線を吸収して無放射性崩壊によりエネルギーを発生することが可能な標識を有する、第1の試薬と解離可能に結合した第2の試薬(ここで、第1または第2の試薬のいずれかは、他方との結合を可能とし、かつ被分析物またはその被分析物の誘導体と優先的に結合することが可能な結合部位を有する)と、
電磁放射線源と、
その電気信号を検出するための検出器と
を含む、装置。 - 二つの側壁、上面、および下面を有するサンプルチャンバーをさらに含んでなり、前記変換器が前記チャンバー内に設置されている、請求項16に記載の装置。
- 前記変換器が前記チャンバーの側壁の一つを形成しているものである、請求項16または17に記載の装置。
- 前記変換器が前記チャンバーの上面を形成し、前記第2の試薬が前記サンプルの媒質より密度が高いものである、請求項16または17に記載の装置。
- 前記変換器が前記チャンバーの下面を形成し、前記第2の試薬が前記サンプルの媒質より密度が低いものである、請求項16または17に記載の装置。
- 前記第1の試薬が固定化された抗体であり、前記第2の試薬が標識被分析物である、請求項16〜20のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第1の試薬が固定化された被分析物であり、前記第2の試薬が標識抗体である、請求項16〜21のいずれか一項に記載の装置。
- 前記変換器が、前記変換器上の防腐被膜、第1の試薬、および第2の試薬をさらに含んでなるものである、請求項16〜22のいずれか一項に記載の装置。
- 前記標識が、炭素粒子、着色ポリマー粒子、色素分子、酵素、蛍光分子、金属(例えば、金)粒子、ヘモグロビン分子、磁性粒子、非導電性コア材料および少なくとも一つの金属シェル層を有するナノ粒子、赤血球、およびそれらの組合せから選択されるものである、請求項16〜23のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第1の試薬が前記変換器に吸着されているものである、請求項16〜24のいずれか一項に記載の装置。
- 前記放射線源が、一連の電磁放射線パルスを生成するように構成され、前記検出器が、前記放射線源からの各電磁放射線パルスと、前記電気信号の発生との間の時間遅延を決定するように構成されるものである、請求項16〜25のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第1の試薬および第2の試薬が前記装置内の唯一の試薬である、請求項16〜26のいずれか一項に記載の装置。
- 置換イムノアッセイにおいて標識試薬を測定するための、焦電または圧電素子および電極を含む変換器の使用。
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